CN103200958A

CN103200958A - 使用溶酶体酸性脂肪酶来治疗患者的溶酶体酸性脂肪酶缺乏

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Publication number: CN103200958A
Application number: CN201180053951XA
Authority: CN
Inventors: A·奎因
Original assignee: Synageva Biopharma Corp
Current assignee: Synageva Biopharma Corp
Priority date: 2010-09-09
Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2013-07-10
Also published as: ES2535605T5; DK2977057T3; US10166274B2; NZ700824A; EP2613798B2; PL2613798T3; AU2011314293A1; IL245283A0; NZ715014A; TWI482625B; JP2013540733A; RU2013110491A; HK1215532A1; US20190282671A1; IL225095A; ME02062B; BR122019021757B1; US20140348752A1; US11400141B2; PL2977057T3

Abstract

本发明提供LAL缺乏(例如沃尔曼氏病，CESD)的治疗，所述治疗包括以有效给药频率向哺乳动物施用治疗有效量的溶酶体酸性脂肪酶。还提供了在患有LAL缺乏的人患者中改善生长和肝功能、增加LAL组织浓度和增加LAL活性的方法。

Description

使用溶酶体酸性脂肪酶来治疗患者的溶酶体酸性脂肪酶缺乏

发明背景

溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺乏是罕见的溶酶体贮积病(LSD)，其特征为由于酶的缺乏而无法降解溶酶体中的胆固醇酯(CE)和甘油三酯(TAG)。LAL缺乏与其它溶酶体贮积病的类似之处在于底物在许多组织和细胞类型中积聚。在LAL缺乏中，底物积聚在网状内皮***的细胞中是最明显的，包括肝脏中的Kupffer细胞、脾脏中的组织细胞、以及小肠中的固有层。网状内皮细胞表达巨噬细胞甘露糖/N-乙酰基葡糖胺受体(也称为巨噬细胞甘露糖受体、MMR或CD206)，所述受体介导结合、细胞摄取以及具有GlcNAc或甘露糖封端的N-聚糖的蛋白质的溶酶体内化，并且提供用于在这些关键细胞类型中潜在校正酶缺乏的途径。

LAL缺乏是多***疾病，其最常见表现为胃肠、肝脏以及心血管并发症，并且造成明显的发病率和死亡率。LAL缺乏的临床作用是由于脂质材料在多种组织的溶酶体中大量积聚和对胆固醇和脂质稳态机制的强烈干扰，包括肝脏胆固醇合成的实质性增加。LAL缺乏呈现为至少两种表型：沃尔曼氏病(Wolman Disease，WD)和胆固醇酯贮积病(CESD)。

沃尔曼氏病，以首先描述它的医生来命名，是LAL缺乏的最具有侵袭性的呈现。这个表型的特征为胃肠和肝脏表现，包括生长不足、吸收不良、皮脂溢、体重剧烈减轻、***病、脾肿大以及肝肿大。沃尔曼氏病通常在生命期的第1年内快速进行并且常常是致命的。病例报告评论表明由于在生命期的第1年内的严重LAL缺乏，存活超过12个月龄对于呈现出生长不足的患者是极其罕见的。在所述最具侵袭性的形式中，生长不足是主要临床特征，并且是早期死亡率的主要原因。由肝脏增大和转氨酶升高所证明的肝损害的情况在婴儿中也是常见的。

沃尔曼氏病的诊断通过身体发现和实验室分析来确定。婴儿通常由于腹泻、持续性呕吐、喂养困难、发育迟缓以及发育停滞而在生命期的前两二个月内住院。身体发现包括因肝肿大和脾肿大而腹胀，并且放射检查经常揭示肾上腺的钙化。实验室评估通常揭示血清转氨酶水平升高，和内源性LAL酶活性不存在或者显著降低。在一些患者中观察到胆固醇和甘油三酯的血液水平升高。

患有LAL缺乏的患者还可以在生命后期呈现出主要的肝脏和心血管损害，并且这经常称为胆固醇酯贮积病(CESD)。在CESD中，肝脏受到明显的肝肿大、肝细胞坏死、转氨酶升高、肝硬化以及肝纤维化的严重影响。由于CE和TAG的水平提高，因此心血管损害可以高脂血症为特征。在一些患有CESD的受试者中已经报导了脂肪沉积物积聚在动脉壁上(动脉粥样硬化)。这些沉积物使动脉管腔变窄，并且可以导致血管堵塞，从而增加包括心肌梗塞和中风在内的明显的心血管事件的风险。然而，并非所有患有LAL缺乏的受试者都发展出动脉粥样硬化。例如，沃尔曼氏病患者承受着与下列疾病有关的其它症状，包括：肝脏和脾脏增大、***病、以及小肠吸收障碍，但是WD通常不以动脉粥样硬化为特征(The Metabolic and MolecularBases of Inherited Disease(Scriver，C.R.，Beaudet，A.L.，Sly，W.S.与Valle D.编著)第7版，第2卷，第2570页McGraw-Hill，1995)。同样，并非所有CESD患者都展现出动脉粥样硬化。参见Di Bisceglie等，Hepatology 11：764-772(1990)；Ameis等，J.Lipid Res.36：241-250(1995)。CESD的呈现对于一些未诊断出的患者高度可变，直到成年后期表现出并发症，而其它人可以在儿童早期呈现出肝功能障碍。CESD与寿命缩短和明显的不健康相关。患有CESD的那些人的预期寿命取决于相关并发症的严重性。

沃尔曼氏病的现有治疗选择非常有限。将抗体施用至发热和/或有感染迹象的婴儿。可以开出类固醇替代疗法用于肾上腺机能不全和专门的营养支持，并且在没有这些介入会预防死亡的证据的同时，目前也不清楚它们是否对短期存活具有影响。在用骨髓移植治疗的四名患有LAL缺乏的一系列患者中，由于移植数月内所述程序的并发症，所有四名患者都死亡。尽管在后续病例报导中描述了一些成功的情况，但是死亡率保持较高，并且多名患者由于他们病情太重而无法从移植前调节性方案中存活，因此没有被移植。极少数的报导的长期存活者确实表明造血细胞中的酶缺乏的校正单独就足以实质性改善这种疾病的临床状况。通常通过饮食限制来提供临床支持以尝试限制与导致死亡的疾病的急性表现相关的不可转运的和不可分解代谢的脂质的积累。

CESD表型的现有治疗选择集中于经由控制脂质积聚(通过排除富含胆固醇和甘油三酯的食物的饮食)并且通过施用降胆固醇药物(例如，斯达汀(statin)和消胆胺(cholestyramine))抑制胆固醇合成和载脂蛋白B的产生来对症治疗。尽管可以看到一些临床改善，但是潜在的疾病表现持续存在并且仍存在疾病进展。

已经表明，用重组LAL的酶替代疗法可以是溶酶体酸性脂肪酶缺乏和相关病症的可行治疗选择(参见Meyers等.(1985)Nutrition Res.5(4)：423-442；WO9811206；以及Besley(1984)Clinical Genetics26：195-203)。使用LAL缺乏的小鼠模型的一些研究已经证实通过每3天一次输注高剂量的(超过1毫克/公斤体重)重组人LAL，LAL缺乏(LAL^-/-)小鼠的一些异常得以校正(例如参见Grabowski US2007/0264249)。这些校正LAL缺乏小鼠内的缺陷的早期研究表明为了校正潜在的表型，需要相对大量和高频率剂量的重组LAL蛋白。还重要的是应注意，不同于最初描述的LAL^-/-大鼠模型(Yoshida和Kuriyama(1990)Laboratory Animal Science，第40卷，第486-489页)，上述研究中使用的LAL^-/-小鼠模型并不酷似人WD，因为LAL缺乏小鼠并未展现出人患者中观察到的生长缺陷。

迄今为止，没有外源性LAL施用至人，并且没有有效的疗法可用于治疗LAL缺乏，包括WD、CESD以及其它疾病。因此，为了改善患者的生活品质，极端需要具有最低施用频率的疗法。另外，需要在人患者中恢复生长、使肝功能正常化、增加LAL组织浓度并且增加LAL活性的治疗有效剂量。

发明概述

本发明是基于首次人临床病例，其中患者被成功地给予外源性LAL。患有LAL缺乏的其它致命形式(沃尔曼氏病或早发性LAL缺乏)的婴儿通过施用外源性LAL得到有效治疗，并且对患有迟发性LAL缺乏的一组人患者评估了LAL酶替代疗法的安全性评价。患有早发性LAL缺乏的婴儿每周以低剂量施用，而没有引发任何不良事件或反应。早在初始施用后1至2周就观察到生命体征和临床/实验室测量的功效的显著改善。在每周给药4个月之后，治疗的婴儿已经恢复正常生长并且展现出与LAL缺乏有关的所有症状(包括吸收障碍、肝肿大以及肝功能)的明显改善。迟发性成年患者也每周给予低量的外源性LAL，没有不良事件的迹象。因此，迄今为止收集的临床数据显示使用本发明的外源性LAL的酶替代疗法提供用于LAL缺乏的安全且有效的治疗。

因此，本发明提供通过施用有效量的外源性溶酶体酸性脂肪酶(LAL)来治疗人患者中与LAL缺乏相关的疾病或病症的方法。外源性LAL可以为具有N-连接型聚糖结构的重组人LAL，所述聚糖结构包含至少一个甘露糖和/或甘露糖-6-磷酸。外源性LAL被有效地内化到例如淋巴细胞、巨噬细胞和/或成纤维细胞的溶酶体中。

在一些实施方案中，患有LAL缺乏的人患者被诊断为患有沃尔曼氏病(WD)。在一个实施方案中，施用足以提高WD患者的生长。在一个实施方案中，施用足以恢复WD患者的正常生长。在其它实施方案中，患有LAL缺乏的人患者被诊断为患有胆固醇酯贮积病(CESD)。根据本发明的治疗方法可以提供给任何年龄的人患者。

本文还提供通过将有效改善肝功能的量的重组人LAL施用至患者来治疗患有LAL缺乏的人患者的方法。在一些实施方案中，施用足以使肝脏检验正常化。在一个实施方案中，施用足以降低肝脏转氨酶的血清水平。例如，肝脏转氨酶可以包括血清天冬氨酸转氨酶(AST)和/或丙氨酸转氨酶(ALT)。在一个实施方案中，施用足以使肝肿大减至最小。在一个实施方案中，施用足以降低患者的肝脏大小。在一个实施方案中，施用足以降低血清铁蛋白水平。

在一个实施方案中，施用足以降低血清脂质水平，包括例如胆固醇酯(CE)和/或甘油三酯(TG)水平。

还提供增加患有LAL缺乏的人患者的LAL活性的方法。所述方法包括将重组人LAL施用至患者，以便所述施用使得LAL活性增加，如可在例如淋巴细胞和/或成纤维细胞中所测量。

在一个实施方案中，描述通过每5天1次至每30天1次将有效量的外源性LAL蛋白施用至患者而治疗人患者的与LAL缺乏相关的病状的方法。

在一些实施方案中，患有LAL缺乏的人患者被给予约0.1mg至约50mg外源性LAL/公斤体重。在一个实施方案中，人患者被给予约0.1mg至约10mg的外源性LAL/公斤体重。在一个实施方案中，人患者被给予约0.1mg至约5mg的外源性LAL/公斤体重。

在一个实施方案中，输注速率在约0.1mg/kg/h至约4mg/kg/h之间。

在一些实施方案中，人患者用第二治疗剂治疗。第二治疗剂可以包括例如降胆固醇药物(例如，斯达汀或依泽替米贝(ezetimibe))、抗组胺剂(例如，苯海拉明(diphenhydramine))或免疫抑制剂。

附图简述

图1A描绘每周接受外源性LAL(SBC-102)给药(剂量：0.2mg/kg(初始输注，第0周)；0.3mg/kg(第1周)；0.5mg/kg(第2周)；以及1.0mg/kg(第3-8周))的婴儿男性沃尔曼氏病(即，早发性LAL缺乏)患者的血清天冬氨酸转氨酶(AST)的水平。图1B描绘同一患者的血清丙氨酸转氨酶(ALT)的水平。患者在初始输注时的年龄为4个月零1周。

图2描绘每周接受外源性LAL(SBC-102)给药(剂量：0.2mg/kg(初始输注，第0周)；0.3mg/kg(第1周)；0.5mg/kg(第2周)；以及1.0mg/kg(第3-8周))的沃尔曼氏病患者的血清铁蛋白水平。患者在初始输注时的年龄为4个月零1周。示出第0周初始给药后1周以后的血清铁蛋白水平。

图3描绘每周接受外源性LAL(SBC-102)给药(剂量：0.2mg/kg(初始输注；第0周)；0.3mg/kg(第1周)；0.5mg/kg(第2周)；以及1.0mg/kg(第3-8周))的沃尔曼氏病患者的生长速度。

图4描绘沃尔曼氏病患者的生长曲线(男孩的年龄标准体重(kg)百分位数)。

图5描绘每周接受0.35mg/kg的剂量的外源性LAL的41岁白人男性CESD患者的血清AST水平。

图6描绘每周接受0.35mg/kg的剂量的外源性LAL的41岁白人男性CESD患者的血清ALT水平。

图7描绘每周接受0.35mg/kg的剂量的外源性LAL的41岁白人男性CESD患者的血清白蛋白水平。

图8描绘每周接受0.35mg/kg的剂量的外源性LAL的41岁白人男性CESD患者的血清铁蛋白水平。

图9图解了四只年龄匹配的雄性大鼠的增重速率，这四只大鼠各自被分配给下列四种外源性LAL给药方案中的一种：每周一次1mg/公斤、每周一次5mg/公斤、每2周一次5mg/公斤或安慰剂。柱内的数字表示出生后的天数。

图10描绘野生型对照、外源性LAL治疗的LAL缺乏大鼠以及安慰剂治疗的LAL缺乏大鼠的病理学和组织病理学检查的结果。宏观病理学证实用外源性LAL治疗的大鼠的肝脏的颜色和大小正常化。来自用外源性LAL治疗的大鼠的肝脏组织的组织病理学显示基本上正常的肝脏组织学，这与安慰剂治疗的动物中的泡沫状巨噬细胞的大量积聚形成明显对照。

图11描绘在使用顺序扫描模式通过共聚焦荧光显微术检查的细胞的溶酶体中，重组人LAL(SBC-102)和溶酶体标记物的共定位。

图12描绘使用巨噬细胞细胞系NR8383通过竞争结合测定评价的重组人LAL(SBC-102)与GlcNAc/甘露糖受体的结合特异性。

图13描绘重组人LAL在正常细胞和LAL-缺乏细胞中的活体外活性。

图14图解了重组人LAL(SBC-102)治疗对LAL缺乏大鼠的内部器官质量的作用。器官大小表示为在每周施用媒介物或5mg/kg的SBC-102持续4周之后，在LAL^-/-大鼠和LAL^+/+大鼠中在8周龄测定的体重百分率。

图15图解了在每周给予媒介物或5mg·kg^-1的SBC-102持续4周之后，野生型和LAL缺乏大鼠的体重。剂量施用在第4周开始以菱形在X-轴上突出显示。

图16描绘在每周给予媒介物或5mg·kg^-1的SBC-102持续4周之后，在WT和LAL缺乏大鼠中在8周龄测定的肝脏胆固醇、胆固醇酯和甘油三酯的水平。

图17描绘LAL缺乏大鼠的体重增加百分率。

图18描绘在施用SBC-102持续4周之后，LAL缺乏大鼠的肝脏重量(作为体重的百分率)。

图19图解了在施用SBC-102持续4周后，LAL缺乏大鼠中的组织胆固醇酯的水平。

发明详述

本发明提供用于治疗患有对施用外源性溶酶体酸性脂肪酶具有反应性的疾病或病症的人的方法。

定义

为了方便起见，说明书、实施例以及所附权利要求书中使用的某些术语在本文中进行阐述以说明和定义用于描述本发明的各种术语的含义和范围。

如本文使用的“LAL”是指“溶酶体酸性脂肪酶”并且贯穿本说明书这两个术语可互换使用。LAL可以是人蛋白，即，人溶酶体酸性脂肪酶。如本文使用的术语“SBC-102”是指重组人溶酶体酸性脂肪酶。LAL在文献中还被称为酸胆固醇酯水解酶、胆固醇酯酶、脂肪酶A、LIPA以及固醇酯酶。

LAL催化胆固醇酯和甘油三酯水解为游离胆固醇、甘油和游离脂肪酸。因此，“LAL活性”可以例如通过荧光底物4-甲基伞形酮油酸酯(4MUO)的裂解来测量。4MUO的裂解可以例如通过所释放的荧光团(flurophore)4-甲基伞形酮(4MU)在约360nm处的激发和在460nm处的发射来检测。结果可以以相对荧光单位(RFU)来报告。例如，在30分钟端点测定中裂解的底物的量可以相对于4MU标准曲线来量化，并且一个活性单位(U)可以定义为在37℃下裂解1微摩尔的4MUO/分钟所需要的酶的量。因此，LAL的功能性片段或变异体包括具有LAL活性(例如，水解胆固醇酯和/或甘油三酯的能力)的片段或变异体。

如本文使用的“外源性LAL”是指非患者天然产生的LAL。例如，外源性LAL包括施用至患者的重组LAL蛋白、分离自人或动物并且施用至患者的LAL蛋白以及由于施用编码LAL的RNA和/或DNA或增加内源性LAL蛋白表达的另一种治疗而在患者中产生(即表达)的LAL蛋白。

“静脉内注射”在医学上经常称为IV推注或团注，是指以下施用途径：其中注射器被连接IV接入装置，并且药剂被直接注射，通常快速注射，并且如果它可能引起静脉刺激或过于快速的作用，则有时持续至多15分钟的时间。一旦药物被注射到IV管的流体流中，则必须有一些手段来确保它从管中到达患者。通常，这通过以下来完成：允许流体流正常流动，并且由此携带药物至血流中。然而，在一些情况下，在第一注射之后使用第二流体注射(有时称为“冲洗(flush)”)，以促进药物进入血流。

“静脉内输注”是指以下施用途径：其中药剂在延长的一段时间内进行递送。例如，药剂可以在1至8小时之间的一段时间内递送至患者。药剂还可以在约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7或约8小时的时期内递送至患者。为了完成静脉内输注，可以使用IV重力滴注或IV泵。当患者仅仅在某些时刻需要药剂并且不需要另外的静脉内流体(例如，水溶液，其可含有氯化钠、葡萄糖或其任意组合)时，通常使用IV输注，所述静脉内流体如恢复电解质、血糖以及水损失的那些流体。

如本文使用的术语“禽类”是指分类学鸟纲的生物体的任何种、亚种或属，如但不限于鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、野鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦以及平胸鸟，包括鸵鸟、鸸鹋以及食火鸡。所述术语包括原鸡(Gallus gallus)或鸡的各种已知品种(例如，白色来亨鸡(WhiteLeghorn)、棕色来亨鸡(Brown Leghorn)、横斑芦花鸡(Barred-Rock)、苏塞克斯鸡(Sussex)、新汉夏鸡(New Hampshire)、罗德岛鸡(RhodeIsland)、澳洲黑鸡(Australorp)、米诺卡鸡(Minorca)、芦花鸡(Amrox)、加州灰鸡(California Gray))，以及火鸡、野鸡、鹌鹑、鸭、鸵鸟以及通常以商业数量饲养的其它家禽的品种。它还包括在发育的所有阶段的单个禽类生物体，包括胚胎和胎儿阶段。

术语“家禽得到的”或“禽类得到的”是指由家禽产生或获得的组合物或物质。“家禽”是指可以作为禽畜饲养的禽类，包括但不限于：鸡、鸭、火鸡、鹌鹑以及平胸鸟。例如，“家禽得到的”可以指鸡得到的、火鸡得到的和/或鹌鹑得到的。

如本文使用的术语“患者”是指正在接受或已经接受或准备接受例如由医学护理提供者所指导的医学护理或治疗的任何人。

如本文使用的“治疗有效剂量”是指产生希望的治疗反应所需的药物的剂量(例如量和/或间隔)。治疗有效剂量是指一种剂量，相比于未接受这种剂量的对应受试者，所述剂量使得疾病、病症或副作用得到改善的治疗、治愈、预防或改善，或者疾病或病症的发生率或恶化率降低。所述术语在它的范围内还包括有效增强生理功能的剂量。

术语治疗(“treat”、“treating”以及“treatment”)是指减轻、减缓或改善疾病或症状、预防附加症状、改善或预防症状的潜在病因、抑制疾病或病症、阻止疾病或病状的发展、缓解疾病或病状、引起疾病或病状好转、缓解由疾病或病状引起的病状、或预防性和/或在症状已发生之后停止疾病或病状的症状。

如本文关于特定剂量使用的“kg^-1”、“每kg”、“/kg”和“每公斤”表示哺乳动物的“每公斤体重”，因此这些术语可互换使用。

如本文使用的术语“多肽”意欲涵盖单个“多肽”以及多个“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一个或多个链，并且不是指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于表示具有两个或更多个氨基酸的一个或多个链的任何其它术语都被包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替或与任何这些术语互换使用。术语“多肽”还意欲表示多肽的表达后修饰产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酰化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团而衍生化、蛋白水解性裂解、或被非天然存在的氨基酸修饰。多肽可以衍生自天然生物来源或由重组技术产生，但不必从指定核酸序列翻译。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成。

如本文所使用，两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的同源性百分率等于这两个序列之间的同一性百分率。两个序列之间的同一性百分率是由序列共享的相同位置的数量的函数(即，同源性％＝相同的位置的数量/位置的总数X100)，其中考虑了为优化两个序列的比对而需要引入的间隙数和各间隙的长度。两个序列之间的序列比较和同一性百分率的确定可以使用数学算法来完成，如以下在非限制性实例中所述。

两个氨基酸序列之间的同一性百分率可以使用已被并入ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表，间隙长度罚分12，和间隙罚分4来确定。另外，两个氨基酸序列之间的同一性百分率可以使用已被并入到GCG软件包(在http://www.gcg.com可得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol，Biol.48：444-453(1970))算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，间隙权重16、14、12、10、8、6或4，以及长度权重1、2、3、4、5或6来确定。

“分离的”多肽或其片段、变异体或衍生物意欲为不在它的天然周围环境中的多肽。不要求特定的纯化水平。例如，分离的多肽可以是从它的原生或天生环境中移出的。如本文所公开，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的，通过任何适合的技术分离、分开、或者部分或实质性纯化的天然或重组多肽也被认为是分离的。

本文公开的其它多肽是上述多肽的片段、衍生物、类似物、或变异体以及其任意组合。当谈到本文公开的任何多肽时，术语“片段”、“变异体”、“衍生物”以及“类似物”包括保留对应的天然多肽的至少一些活性的任何多肽(例如，保留水解胆固醇酯和/或甘油三酯的能力的LAL多肽片段、变异体、衍生物以及类似物)。多肽片段包括例如蛋白水解片段、以及缺失片段。多肽变异体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸取代、缺失或***而具有改变的氨基酸序列的多肽。变异体可以天然或非天然存在。非天然存在的变异体可以使用本领域已知的诱变技术来产生。变异型多肽可以包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。衍生物是已经被改变以展现出在原生多肽上未发现的另外的特征的多肽。实例包括融合蛋白。变异型多肽在本文中还可以称为“多肽类似物”。如本文所使用，主题多肽的“衍生物”可以含有通过官能侧基的反应而化学衍生化的一个或多个残基。“衍生物”还包括含有20个标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；和/或鸟氨酸可以取代赖氨酸。

术语“多核苷酸”意欲涵盖单个核酸以及多个核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，如在肽核酸(PNA)中所发现)。术语“核酸”是指多核苷酸中存在的任何一种或多种核酸区段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意欲为从它的原生环境中移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，出于本发明的目的，载体中所含有的编码LAL的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的其它实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分或实质性)的多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的活体内或活体外RNA转录物。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸此外包括合成产生的所述分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件，如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。

如本文所使用，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但是它可以被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等不是编码区的一部分。本发明的两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中，例如在单一载体上，或者在独立的多核苷酸构建体中，例如在独立(不同)的载体上。而且，任何载体可以含有单一编码区，或可以包含两个或更多个编码区。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，所述异源编码区融合或未融合至编码LAL多肽或其片段、变异体或衍生物的核酸。异源编码区包括但不限于特化的元件或基元，如分泌信号肽或异源功能性结构域。

多种转录控制区是本领域的技术人员已知的。它们包括但不限于：转录控制区，其在脊椎动物细胞中起作用，如但不限于来自巨细胞病毒(立即早期启动子，与内含子-A联合)、猿猴病毒40(早期启动子)以及逆转录病毒(如劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括来源于脊椎动物基因的那些，如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素以及兔β-球蛋白，以及能够在真核细胞中控制基因表达的其它序列。其它适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子可诱导的启动子(例如，可由干扰素或白介素诱导的启动子)。

类似地，多种翻译控制元件是本领域的普通技术人员已知的。它们包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及来源于小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。

在其它实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如，呈信使RNA(mRNA)的形式。

本发明的多核苷酸和核酸编码区可以缔合有另外的编码区，所述另外的编码区编码分泌或信号肽，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长中的蛋白质链跨过粗面内质网输出被起始，那么所述序列就从成熟蛋白质裂解。本领域的普通技术人员应意识到由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合至多肽的N-末端的信号肽，所述信号肽从完整或“全长”多肽裂解，以产生分泌的或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用原生信号肽，例如人LAL的MKMRFLGLVVCLVLWTLHSEG(SEQ ID NO：2)信号肽，或所述序列的保留指导与其可操作地缔合的多肽的分泌的能力的功能性衍生物。或者，可以使用异源信号肽(例如，异源哺乳动物或禽类信号肽)或其功能性衍生物。例如，野生型前导序列可以取代为人组织纤溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡糖苷酸酶的前导序列。

“载体”意谓由单链、双链、环状或超螺旋DNA或RNA构成的多核苷酸。典型载体可以由在适当的距离处可操作地连接以允许功能性基因表达的以下元件构成：复制起点、启动子、增强子、5′mRNA前导序列、核糖体结合位点、核酸序列盒(Nucleic acid cassette)、终止和聚腺苷酸化位点以及可选择标记物序列。在具体应用中可以省略这些元件中的一个或多个。核酸序列盒可以包含用于***待表达的核酸序列的限制性位点。在功能性载体中，核酸序列盒包含含有翻译起始和终止位点的待表达核酸序列。构建体中可以任选地包含内含子，例如在编码序列的5″方向。载体被构建成使得特定的编码序列与适当的调控序列一起位于载体中，编码序列相对于控制序列的位置和取向应使得编码序列在控制或调控序列的“控制”下转录。为了实现这一目的，可能需要对编码相关特定蛋白质的序列进行修饰。例如，在一些情况下，可能有必要修饰所述序列以便它可以以适当取向连接至控制序列，或维持阅读框。可以将控制序列和其它调控序列连接至编码序列，随后***载体中。或者，可以将编码序列直接克隆到表达载体中，所述表达载体已经含有控制序列和与控制序列一起处于阅读框中并且受控制序列调控的适当限制性位点。

如本文使用的术语“表达”是指基因产生生物化学品例如多肽的过程。所述过程包括基因在细胞内的功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲除以及瞬间表达与稳定表达。它包括但不限于基因转录成信使RNA(mRNA)，和所述mRNA翻译为多肽。基因表达产生“基因产物”。如本文所使用，基因产物可以是核酸，例如由基因转录产生的信使RNA、或从转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物更包括具有转录后修饰的核酸，所述修饰例如为聚腺苷酸化；或具有转录后修饰的多肽，所述修饰例如为甲基化、糖基化、添加脂质、与其它蛋白质亚基缔合、蛋白水解裂解等。

如本文使用的“宿主细胞”是指含有使用重组DNA技术构建并编码至少一种异源基因的载体的细胞。

如本文使用的术语“N-聚糖”、“寡糖”、“寡糖结构”、“糖基化型态”、“糖基化特征”以及“糖基化结构”具有基本上相同的含义，并且均表示由糖残基形成并且连接于糖基化蛋白质的一种或多种结构。

如本文使用的术语“药物组合物”是指本文所述化合物与其它化学组分的混合物，所述其它化学组分如载剂、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂。

具有不足LAL活性的患者

不希望将本发明限于任何特定病状或病状组别的治疗，本发明包括治疗患者的溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺乏。如本文所使用，患有LAL缺乏的患者是具有不足LAL活性的任何患者。患者的不足LAL活性可以例如归因于低RNA水平、低蛋白质水平或低蛋白质活性。不足LAL活性可以归因于LAL编码序列、LAL调控序列或另一基因(例如，调控LAL的基因)的突变。不足LAL活性还可以归因于环境因素。

本发明可以用于治疗受试者或患者的多种病状。因此，可以根据本发明由外源性LAL有益地治疗的任何病状均包括在本发明的范围内。

本发明的一个实施方案关注治疗由于溶酶体酸性脂肪酶缺乏引起的溶酶体贮积病(LSD)，特别是沃尔曼氏病(WD)和胆固醇酯贮积病(CESD)。不希望将本发明限于任何特定理论或操作机制，WD与CESD都可以归因于LAL基因座处的突变，并且导致脂质材料在多种组织的溶酶体中大量积聚，和胆固醇与脂质稳态机制的强烈干扰，所述积聚和干扰可以根据本发明的方法通过施用外源性LAL来治疗。因此，在一个实施方案中，根据本发明治疗的LAL缺乏是WD。在另一实施方案中，根据本发明治疗的LAL缺乏是CESD。在一些实施方案中，WD或CESD的诊断是基于遗传分析(例如LAL编码序列中功能性突变的鉴定)。在其它实施方案中，WD或CESD的诊断是基于临床发现(例如，身体检查和/或实验室检验)。

在一些实施方案中，外源性LAL可以用于治疗多种病状中的并发症，如非酒精性脂肪肝(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NAFLD是指与由于过量摄取酒精而引起的肝脏疾病具有类似的组织病理学的肝脏疾病。其特征为引起肝脏增大的大泡脂肪变性。NAFLD可以发展为NASH，其是指类似于NAFLD并且增加了可导致纤维化和肝硬化的炎症和肝脏损伤的肝脏疾病。

在一些实施方案中，外源性LAL可以用于治疗以下病状：包括胰腺炎，例如慢性胰腺炎和/或急性胰腺炎，以及酒精诱发的胰腺损伤，如酒精诱发的胰腺炎。

由任何有用的方法产生的外源性LAL都可以用于治疗由于酒精诱发的细胞损伤而引起的疾病，包括但不限于导致脂质酯在身体组织(如但不限于肝脏、脾脏、肠以及心血管组织)中积聚的那些酒精诱发的细胞损伤。根据本发明，吸收障碍也可以通过施用外源性LAL来治疗。外源性LAL还可用于治疗患有丹吉尔病(Tangier disease)和家族性低α脂蛋白血症的患者。丹吉尔病/家族性低α脂蛋白血症与胆固醇酯在巨噬细胞中的积聚相关，伴随有肝脾肿大和/或***病连同低HDL水平，这可以通过施用外源性LAL来治疗。例如，不希望将本发明限于任何特定理论或操作机制，降低的LAL活性可降低ABCA1表达，并且相反地，通过施用外源性LAL至患有丹吉尔病/家族性低α脂蛋白血症的患者获得的增加的LAL活性将增加ABCA1表达，以克服由于多态性而具有降低的功能活性的ABCA1基因的作用。

在一些实施方案中，在治疗前患者的LAL活性水平为正常LAL活性水平的约1％、约2％、约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％或约80％。在一个实施方案中，在治疗前患者的LAL活性水平为正常LAL活性水平的约50％或以下。在一个实施方案中，在治疗前患者的LAL活性水平为正常LAL活性水平的约40％或以下。在一些实施方案中，在治疗前患者的LAL活性水平为正常LAL活性水平的约30％或以下。在一些实施方案中，在治疗前患者的LAL活性水平为正常LAL活性水平的约30％或以下。在一些实施方案中，在治疗前患者的LAL活性水平为正常LAL活性水平的约20％或以下。在一些实施方案中，在治疗前患者的LAL活性水平为正常LAL活性水平的约10％或以下。在一些实施方案中，在治疗前患者的LAL活性水平为正常LAL活性水平的约5％或以下。在一些实施方案中，在治疗前患者显示不可测量的LAL活性。

在一些实施方案中，LAL活性水平在获自患有LAL缺乏的人患者的培养的成纤维细胞中测量。在一些实施方案中，LAL活性水平在患有LAL缺乏的人患者的淋巴细胞(例如，白细胞)中测量。淋巴细胞包括但不限于外周血单核细胞(PMBC)。测量方法例如描述于Burton等.，(1980)Clinica Chimica Acta 101：25-32和Anderson等.，(1999)Mol.Genet.& Metab.，66：333-345中，这两个文献整体并入本文。待用外源性LAL治疗的LAL缺乏患者可以展现出成纤维细胞LAL酶活性小于约30、约20、约10、约5、约4、约3、约2或约1pmol/mg/min，如使用三油精作为底物所测量。待用外源性LAL治疗的LAL缺乏患者可以展现出白细胞LAL酶活性小于约30、约20、约10、约5、约4、约3、约2或约1pmol/mg/min，如使用三油精作为底物所测量。待用外源性LAL治疗的LAL缺乏患者可以展现出成纤维细胞LAL酶活性小于约30、约20、约10、约5、约4、约3、约2或约1pmol/mg/min，如使用油酸胆固醇酯作为底物所测量。待用外源性LAL治疗的LAL缺乏患者可以展现出白细胞LAL酶活性小于约30、约20、约10、约5、约4、约3、约2或约1pmol/mg/min，如使用油酸胆固醇酯作为底物所测量。

外源性LAL的施用

本发明提供用外源性LAL治疗人患者的方法，所述方法包括施用外源性LAL至患者，其中施用足以在患者中恢复生长、改善肝功能、降低肝脏损害、增加LAL的组织水平和/或增加LAL活性。本发明提出以有用和之前未特征化的频率施用(即，给药方案)外源性LAL，以治疗源自LAL缺乏的病状，包括WD和CESD，以及之前未特征化的给药量，用于治疗这些病状。

本发明提出将治疗有效剂量的外源性LAL在每5天1次至每30天1次施用至患者持续由熟悉医学领域的从业者确定的一段时间。在一个实施方案中，所述时间段将是患者的寿命的剩余时间。在一个实施方案中，给药频率在每5天1次与每25天1次之间。在一个实施方案中，给药频率在每5天1次与每21天1次之间。在另一实施方案中，给药频率在每7天1次与每14天1次之间。外源性LAL可以每5天1次、每6天1次、每7天1次、每8天1次、每9天1次、每10天1次、每11天1次、每12天1次、每13天1次或每14天1次进行施用。在一些实施方案中，外源性LAL约每周施用一次。在其它实施方案中，外源性LAL约每两周施用一次。在一个实施方案中，给药频率是约每30天1次。

为了治疗病状，通常施用的外源性LAL的量可以取决于已知的因素而变化，所述因素如接受者的年龄、健康状况和体重、并行治疗的类型、治疗频率等。通常，活性成分的剂量可以为约0.01至约50mg/公斤体重。在一个实施方案中，根据本发明的外源性LAL的剂量为约0.1至0.5mg/公斤体重。在一个实施方案中，剂量为约0.1mg至约5.0mg/公斤。在一个实施方案中，剂量为约0.1mg至约5.0mg/公斤。在一个实施方案中，剂量为约0.1、约0.2、约0.25、约0.30、约0.35、约0.40、约0.45、约0.50mg/公斤。在一个实施方案中，剂量为约1mg至约5mg/公斤。在一个实施方案中，剂量为约1mg/公斤。在一个实施方案中，剂量为约3mg/公斤。例如，可以施用0.1mg/公斤体重、0.2mg/公斤体重、0.3mg/公斤体重、0.4mg/公斤体重、0.5mg/公斤体重、1mg/公斤体重、2mg/公斤体重、3mg/公斤体重、4mg/公斤体重或5mg/公斤体重。在一个实施方案中，剂量为约1mg至约20mg/公斤体重。

当采用本发明的给药方案时，本发明还包括其它剂量。例如根据本发明的给药方案，将对患者施用约0.1mg至约50mg/公斤体重。

在一些实施方案中，将约0.5至约50mg的外源性LAL施用至例如年龄在1个月与24个月之间的患有沃尔曼氏病的患者。在一个实施方案中，患者小于1岁。在另一实施方案中，患者小于2岁。在一些实施方案中，将约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约5mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg或约45mg的外源性LAL施用至患有沃尔曼氏病的患者。在一些实施方案中，将约0.5至约30mg、约0.5至约20mg、约0.5至约10mg或约0.5至约5mg施用至患有沃尔曼氏病的患者。在一些实施方案中，施用约1至约30mg、约1至约20mg、约1至约10mg或约1至约5mg。

在一些实施方案中，将约1mg至约350mg的外源性LAL施用至例如诊断患有CESD的患者。因此，在一些实施方案中，将约1、5、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325或350mg的外源性LAL施用至患有CESD的患者。在一些实施方案中，将约5至约350mg、约5至约300mg、约5至约250mg或约5至约200mg施用至患有CESD的患者。在一些实施方案中，将约10至约350mg、约10至约300、约10至约250或约10至约200mg施用至患有CESD的患者。

联合治疗

本文公开的治疗蛋白可联合其它治疗剂使用。本发明提供预治疗程序来使可以由施用根据本发明的外源性LAL而招致的任何潜在的过敏性反应减至最少或预防所述反应。在一个实施方案中，为了预治疗潜在过敏性反应，将H-1受体拮抗剂、也称为抗组胺剂(例如，苯海拉明)施用至患者。在一个实施方案中，H-1受体拮抗剂是以约1mg至约10mg/公斤体重的剂量施用。例如，抗组胺剂可以以约5mg/公斤的剂量施用。抗组胺剂的施用可以在施用根据本发明的外源性LAL之前。在一个实施方案中，H-1受体拮抗剂在施用外源性LAL之前约10至约90分钟，例如约30至约60分钟进行施用。H-1受体拮抗剂可以使用连接至血管接入端口的携带式***来施用。在一个实施方案中，抗组胺剂在施用外源性LAL之前约90分钟施用。在一个实施方案中，抗组胺剂在施用外源性LAL之前约10与约60分钟之间进行施用。在另一实施方案中，抗组胺剂在施用外源性LAL之前约20与约40分钟之间进行施用。例如，抗组胺剂可以在施用外源性LAL之前20、25、30、35或40分钟施用。在一个实施方案中，施用的抗组胺剂是苯海拉明。可以使用任何有用的抗组胺剂。这些抗组胺剂包括但不限于克立马丁(clemastine)、多西拉敏(doxylamine)、氯雷他定(loratidine)、地氯雷他定(desloratidine)、非索非那定(fexofenadine)、非尼拉敏(pheniramine)、西替立嗪(pheniramine)、依巴斯汀(ebastine)、异丙嗪(promethazine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)、左西替利嗪(chlorpheniramine)、奥洛他定(olopatadine)、喹硫平(quetiapine)、氯苯甲嗪(quetiapine)、茶苯海明(dimenhydrinate)、恩布拉敏(embramine)、二甲茚啶(dimethidene)以及右氯苯那敏(dexchloropheniramine)。

在一个实施方案中，抗组胺剂的施用剂量在约0.1mg与约10mg/公斤体重之间。在一个实施方案中，抗组胺剂的施用剂量在约1mg与约5mg/公斤体重之间。例如剂量可以为1mg、2mg、3mg、4mg或5mg/公斤体重。抗组胺剂可以通过任何有用的方法来施用。在一个实施方案中，抗组胺剂是静脉内施用。在另一实施方案中，抗组胺剂是以药学上可接受的胶囊来施用。

在另一实施方案中，就静脉输注而论，过敏性反应的可能性可以通过使用递增(ramp-up)方案来施用输注而降低。在这一上下文中，递增方案是指随着输注过程缓慢地提高输注的速率，以使患者对于药物的输注不敏感。

例如，如果患者预期或经历过敏性反应或不良免疫反应，那么还可以在外源性LAL施用之前、期间或之后施用免疫抑制剂，如但不限于抗组胺剂、皮质类固醇、西罗莫司(sirolimus)、伏环孢素(voclosporin)、环孢素(ciclosporin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、针对IL-2受体的抗体、针对T-细胞受体的抗体、针对TNF-α的抗体或融合蛋白(例如，英夫利昔单抗(infliximab)、依那西普(etanercept)或阿达木单抗(etanercept))、CTLA-4-Ig(例如阿巴他赛(abatacept))、抗OX-40抗体。

本发明还涵盖涉及施用含有外源性LAL的组合物联合一种或多种降胆固醇剂(例如HMG-CoA还原酶抑制剂)的疗法。这些药剂的非限制性实例包括：阿托伐他汀(atorvastatin)(和

)、氟伐他汀(atorvastatin)

洛伐他汀(lovastatin)(

)、匹伐他汀(pitavastatin)

普伐他汀(pravastatin)

罗苏伐他汀(pravastatin)

以及辛伐他汀(simvastatin)

外源性LAL的作用

本发明提出在用外源性LAL治疗后疾病相关的症状得到校正或正常化。回应于外源性LAL的临床进展(即，症状的改善)可以通过任何有用的方法或程序来监控。

在一些实施方案中，施用外源性LAL足以达成约200ng/mL至约1,500ng/mL的Cmax。在一些实施方案中，施用外源性LAL足以达成约200ng/mL至约1,000ng/mL的Cmax。在一些实施方案中，施用外源性LAL足以达成约200ng/mL至约800ng/mL的Cmax。在一些实施方案中，施用外源性LAL足以达成约200ng/mL、约300ng/mL、约400ng/mL、约500ng/mL、约600ng/mL、约700ng/mL、约800ng/mL、约900ng/mL、约1,000ng/mL、约1,250ng/mL或约1,500ng/mL的Cmax。在一些实施方案中，Cmax在输注过程中达到。

在一些实施方案中，施用外源性LAL足以达成少于40分钟的LAL半衰期(t_1/2)。在一些实施方案中，施用外源性LAL足以达成少于30分钟的LAL半衰期(t_1/2)。在一些实施方案中，施用外源性LAL足以达成少于20分钟的LAL半衰期(t_1/2)。在一些实施方案中，施用外源性LAL足以达成少于15分钟的LAL半衰期(t_1/2)。在一些实施方案中，施用外源性LAL足以达成少于10分钟的LAL半衰期(t_1/2)。在一些实施方案中，施用外源性LAL足以达成约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40分钟的LAL半衰期(t_1/2)。

在一些实施方案中，外源性LAL增加患者的LAL活性。LAL活性可以在例如肝脏、脾脏、***、主动脉、外周血液白细胞和/或皮肤成纤维细胞中增加。在一些实施方案中，LAL活性在分离自血液样品的淋巴细胞的提取物中测量。

外源性LAL可以使LAL活性增加至LAL施用之前的活性的至少约1.5、约2、约2.5、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15或约20倍。外源性LAL可以使LAL活性增加至LAL施用之前的活性的至少约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20倍。LAL活性可以使用本领域中已知的方法来评价，所述方法包括例如，使用[1-¹⁴C]油酸胆固醇酯、三油精(三[1-¹⁴C]油酸甘油酯)、肉豆蔻酸对硝基苯酯或4-MUO(4-甲基伞形酮油酸酯)底物的测定。

在一个实施方案中，采用器官和组织体积与表征来确定在施用本发明的外源性LAL后病状的改善。

在一个实施方案中，施用外源性LAL后肝功能/损伤的临床进展通过血液转氨酶如天冬氨酸转氨酶(AST)和/或丙氨酸转氨酶(ALT)，和/或其它生物标记物如白蛋白、碱性磷酸酶以及胆红素(直接和总值)随时间的量化来监控。

在一个实施方案中，使用成像技术来监控临床进展。例如且不限于，使用的成像技术可以是超声、CT扫描、核磁共振成像以及核磁共振光谱法。

在一些实施方案中，以本文所述的剂量施用外源性LAL足以在人患者中恢复生长和/或增加体重。施用外源性LAL还可以提高患有早发性LAL缺乏的婴儿或儿童患者的生长速率(即，体重增加)。例如，施用外源性LAL可以使体重增加速率增加达施用之前观察到的生长速率/速度的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约200％、约300％、约400％或约500％。在一些实施方案中，施用外源性LAL恢复年龄在约1个月与约24个月之间的患有早发性LAL缺乏(例如，沃尔曼氏病)的儿童患者的正常生长速率。在所述上下文中，“正常”是指如医学领域的普通从业者所确定的所治疗的患者的正常生长速率。

在一个实施方案中，例如就WD和CESD或其它LAL缺乏而论，肝肿大明显逆转，其中肝脏大小回复到比正常大小大约1％至约60％以内的大小。在所述上下文中，“正常”是指如医学领域的普通从业者所确定的所治疗的患者的正常肝脏大小。在一个实施方案中，肝脏大小被减小至比正常大约1％与约50％之间。在另一实施方案中，肝脏大小被减小至比正常大约1％与约40％之间。在一个实施方案中，肝脏大小被减小至比正常大约1％与约30％之间。在另一实施方案中，肝脏大小被减小至比正常大约1％与约20％之间。在另一实施方案中，肝脏大小被减小至比正常大约10％与约20％之间。例如，肝脏可以比正常大小大10％、11％、12％13％14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在另一实施方案中，肝脏大小被减小至比正常大约0％与约10％之间。例如，肝脏可以比正常肝脏大小大0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。

用外源性LAL治疗还可以改善肝功能。因此，在一些实施方案中，用外源性LAL治疗足以恢复正常肝功能和/或使肝脏检验正常化。在一些实施方案中，用外源性LAL治疗足以使肝脏转氨酶的血清水平降低例如至少约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、和/或至少约90％。在一个实施方案中，用外源性LAL治疗足以使肝脏转氨酶血清水平降低至少约40％。在一个实施方案中，用外源性LAL治疗足以使肝脏转氨酶血清水平降低至少约50％。在一个实施方案中，用外源性LAL治疗足以使肝脏转氨酶血清水平降低至少约60％。在一个实施方案中，用外源性LAL治疗足以使肝脏转氨酶血清水平降低至少约70％。在一个实施方案中，用外源性LAL治疗足以使肝脏转氨酶血清水平降低至少约80％。在一个实施方案中，用外源性LAL治疗足以使肝脏转氨酶血清水平降低至少约90％。

在一些实施方案中，肝脏转氨酶是丙氨酸转氨酶(ALT)。在一个实施方案中，施用外源性LAL足以降低血清ALT。例如，施用外源性LAL可以使血清ALT降低例如至少约50％、60％、70％、80％或90％。血清ALT水平可以起到指示肝脏损伤的作用。因此，本发明还涵盖通过施用有效降低血清ALT的量的外源性LAL来降低患有LAL缺乏的人患者的肝脏损伤的方法。

在一些实施方案中，肝脏转氨酶是血清天冬氨酸转氨酶(AST)。在一个实施方案中，施用外源性LAL足以降低血清AST。例如，施用外源性LAL可以使血清AST降低例如至少约50％、60％、70％、80％或90％。血清AST水平可以起到指示肝脏损伤的作用。因此，本发明还涵盖通过施加有效降低血清AST的量的外源性LAL来降低患有LAL缺乏的患者的肝脏损伤的方法。

在一些实施方案中，用外源性LAL治疗可以降低血清铁蛋白水平。因此，在一些实施方案中，与治疗前的水平相比，用外源性LAL治疗足以使血清铁蛋白降低例如至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一个实施方案中，用外源性LAL治疗足以使铁蛋白血清水平降低至少50％。在另一实施方案中，用外源性LAL治疗足以使铁蛋白血清水平降低至少约60％。在一个实施方案中，用外源性LAL治疗足以使铁蛋白血清水平降低至少约70％。在一个实施方案中，用外源性LAL治疗足以使铁蛋白血清水平降低至少约80％。在一个实施方案中，用外源性LAL治疗足以使铁蛋白血清水平降低至少约90％。在一个实施方案中，用外源性LAL治疗足以使铁蛋白血清水平降低至少约95％。

在一个实施方案中，例如，就沃尔曼氏病和CESD或其它LAL缺乏而论，脾肿大明显逆转，其中脾脏大小回复到比正常大小大约1％至约60％以内的大小。在所述上下文中“正常”是指如医学领域的普通从业者所确定的所研究的患者的正常脾脏大小。在一个实施方案中，脾脏大小被减小至比正常大约1％与约50％之间。在另一实施方案中，脾脏大小被减小至比正常大约1％与约40％之间。在一个实施方案中，脾脏大小被减小至比正常大约1％与约30％之间。在另一实施方案中，脾脏大小被减小至比正常大约1％与约20％之间。在另一实施方案中，脾脏大小被减小至比正常大约10％与约20％之间。例如，脾脏可以比正常大小大10％、11％、12％13％14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在另一实施方案中，脾脏大小被减小至比正常大约0％与约10％之间。例如，脾脏可以比正常脾脏大小大0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。

在一个实施方案中，施用外源性LAL足以减轻***病(即，增大的***)。因此，在一些实施方案中，***被减小至大约比正常大小大约1％至约60％以内的大小。在所述上下文中“正常”是指如医学领域的普通从业者所确定的所研究的患者的正常***大小。在一个实施方案中，***大小被减小至比正常大约1％至约50％。在另一实施方案中，***大小被减小至比正常大约1％至约40％。在一个实施方案中，***大小被减小至比正常大约1％至约30％。在另一实施方案中，***大小被减小至比正常大约1％至约20％。在另一实施方案中，***大小被减小至比正常大约10％至约20％。

例如，***可以比正常大小大10％、11％、12％13％14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在另一实施方案中，***大小被减小至比正常大约0％至约10％。例如，***可以比正常***大小大0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在另一实施方案中，进行脂质分析以监控病症的改善。例如，可以进行脂质分析来评估外源性LAL的治疗效果。脂质分析可以通过任何有用的方法对患者的组织样品(例如，血液样品、肝脏活组织检查样品)来进行，所述方法如但不限于本领域的技术人员认为适当的高效液相色谱、气相色谱、质谱或薄层色谱或其任何组合。在一个实施方案中，根据本发明进行的脂质分析证实总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和/或胆固醇酯的水平。

在一个实施方案中，例如，就沃尔曼氏病和CESD或其它LAL缺乏而论，根据本发明治疗的患者的脂质分析显示在肝脏、脾脏、肠、***和/或主动脉中脂质浓度正常化，如可以由医学领域的普通从业者所确定。

脂质水平可以使用血浆脂质分析或组织脂质分析来评价。在血浆脂质分析中，可以收集血浆，并且总血浆游离胆固醇水平可以使用例如比色测定用COD-PAP试剂盒(Wako Chemicals)来测量，总血浆甘油三酯可以使用例如甘油三酯/GB试剂盒(Boehringer Mannheim)来测量，和/或总血浆胆固醇可以使用胆固醇/HP试剂盒(BoehringerMannheim)来测定。在组织脂质分析中，脂质可以提取自例如肝脏、脾脏、和/或小肠样品(例如，使用Folch等.J.Biol.Chem 226：497-505(1957)中提供的Folch法)。总组织胆固醇浓度可以例如使用O-邻苯二醛来测量。

在一些实施方案中，施用外源性LAL足以增加营养物吸收。在一个实施方案中，施用外源性LAL增加营养物吸收，如通过血清α生育酚、25OH维生素D、血清视黄醇、二去氢视黄醇或运甲状腺素蛋白的水平所测量。

在一些实施方案中，例如就WD和CESD或其它LAL缺乏而论，施用外源性LAL足以增加血清血红蛋白水平(Hb)。在一个实施方案中，相比于在施用外源性LAL之前观察到的情况，血红蛋白水平增加至少约10％或约20％。

在一些实施方案中，外源性LAL可以使用使副作用减至最小的方法来施用。例如，施用外源性LAL可以使对外源性LAL的免疫反应减至最小。

LAL和包含外源性LAL的药物组合物

本发明涵盖治疗本文所述的任何LAL缺乏相关病症和之前未提及、但将受益于所述治疗的其它病状。根据本发明采用的外源性LAL包括重组LAL，其可在任何有用的蛋白质表达***中产生，所述蛋白质表达***包括但不限于细胞培养物(例如，CHO细胞、COS细胞)、细菌如大肠杆菌(E.coli)、转基因动物如哺乳动物和禽类(例如，鸡、鸭和火鸡)、以及植物***(例如，浮萍和烟草植物)。本发明的一个方面涉及根据2006年10月3日授权的美国专利号7,524,626；2007年10月10日提交的美国专利申请号11/973,853、2007年10月29日提交的美国专利申请号11/978,360以及2009年1月7日提交的美国专利申请号12/319,396产生的重组LAL，所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。本发明的一个方面涉及如Du等.，(2005)Am.J.Hum.Genet.77：1061-1074和Du等.，(2008)J.Lipid Res.，49：1646-1657中所述产生的重组LAL，所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。在一个有用的实施方案中，外源性LAL是例如，根据2011年4月23日提交的PCT/US2011/033699中所述的方法，在转基因禽(例如转基因鸡)的输卵管中产生，所述文献以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，重组LAL在禽类细胞系中产生。在一些实施方案中，重组LAL在哺乳动物(例如，人)细胞系中产生。

在一个实施方案中，根据本发明使用的外源性溶酶体酸性脂肪酶含有聚糖，所述聚糖具有实质性N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)和甘露糖封端的N-连接型结构。外源性LAL上的GlcNAc和甘露糖封端的聚糖可以被巨噬细胞和成纤维细胞特异性识别和内化。甘露糖-6-磷酸(M6P)可以使蛋白质靶向在牵涉于可通过外源性LAL施用治疗的病症中的细胞上表达的GlcNAc/甘露糖受体，也通常存在于根据本发明使用的外源性LAL上。

通常，本文讨论和描述的本发明的外源性LAL是人LAL。在一个实施方案中，外源性LAL具有Genbank RefSeq NM_000235.2)中提供的氨基酸序列。在一个实施方案中，成熟外源性LAL具有下列氨基酸序列：

SGGKLTAVDPETNMNVSEIISYWGFPSEEYLVETEDGYILCLNRIPHGRKNHSDKGPKPVVFLQHGLLADSSNWVTNLANSSLGFILADAGFDVWMGNSRGNTWSRKHKTLSVSQDEFWAFSYDEMAKYDLPASINFILNKTGQEQVYYVGHSQGTTIGFIAFSQIPELAKRIKMFFALGPVASVAFCTSPMAKLGRLPDHLIKDLFGDKEFLPQSAFLKWLGTHVCTHVILKELCGNLCFLLCGFNERNLNMSRVDVYTTHSPAGTSVQNMLHWSQAVKFQKFQAFDWGSSAKNYFHYNQSYPPTYNVKDMLVPTAVWSGGHDWLADVYDVNILLTQITNLVFHESIPEWEHLDFIWGLDAPWRLYNKIINLMRKYQ(SEQ ID NO：1)

在一些实施方案中，外源性LAL包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-378、SEQ ID NO：1的氨基酸3-378、SEQ ID NO：1的氨基酸6-378、或SEQ ID NO：1的氨基酸7-378。在一些实施方案中，外源性LAL包含选自由以下组成的组的至少两种多肽的混合物：SEQ ID NO：1的氨基酸1-378、SEQ ID NO：1的氨基酸3-378、SEQ ID NO：1的氨基酸6-378以及SEQ ID NO：1的氨基酸7-378。在一些实施方案中，外源性LAL包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸1-378的多肽、含有SEQ IDNO：1的氨基酸3-378的多肽和含有SEQ ID NO：1的氨基酸6-378的多肽的混合物。在一些实施方案中，外源性LAL包含与SEQ ID NO：1的氨基酸1-378、SEQ ID NO：1的氨基酸3-378、SEQ ID NO：1的氨基酸6-378、或SEQ ID NO：1的氨基酸7-378相同的多肽。在其它实施方案中，外源性LAL包含与SEQ ID NO：1的氨基酸1-378、SEQ IDNO：1的氨基酸3-378、SEQ ID NO：1的氨基酸6-378、或SEQ ID NO：1的氨基酸7-378至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同的多肽。在一些实施方案中，外源性LAL包含作为SEQ ID NO：1的功能性片段或与SEQID NO：1的功能性片段至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同的多肽。

在一些实施方案中，外源性LAL是2011年4月23日提交的PCT/US2011/033699中所述的重组LAL蛋白，所述文献以引用的方式整体并入本文。

应认识到，不相同的氨基酸位置经常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基取代为具有类似化学特性(例如，电荷或或疏水性)的其它氨基酸残基，并且因此不改变分子的功能特性。如果序列的保守取代不同，那么序列同一性百分率可以向上调节以校正取代的保守性质。进行这种调节的方式是本领域的技术人员所熟知的。保守取代的得分可以根据例如Meyers和Millers，Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17(1988)的算法来进行计算。

“比较窗”是指如在约25与约400个位置之间、或约50至200个位置之间、或约100与150个位置之间的连续位置的区段，在所述区段上，序列可以在两个序列最优地比对后与相同数量的连续位置的参比序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域所熟知的。用于比较的序列的最优比对可以例如通过以下来进行：局部同源性算法(Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)、全局比对算法(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)、相似性搜索方法(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444(1988)；Altschul等.，Nucl.Acids Res.25：3389-402(1997)、通常使用默认设置的这些算法的计算机实施(例如，Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST)、或手动比对和视觉检查(例如参见Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等.(编著)，1994)。例如，BLAST蛋白质搜索可以使用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3来进行，以获得与SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片段超过80％相同的氨基酸序列。

有用算法实施的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进性成对比对从一组相关序列来产生多重序列比对。还可以绘制树形图，所述树形图显示用于产生比对的集群关系。PILEUP使用Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.35：351-360(1987)的渐进性比对方法的简化。使用的方法类似于Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-3(1989)所描述的方法。多重比对程序开始于两个最类似序列的成对比对，从而产生两个比对的序列的集群。然后可以将所述集群与下一个最相关序列或比对序列的集群相比对。序列的两个集群可以通过两个单个序列的成对比对的简便延伸来进行比对。在每次迭代时包括越来越不相似的序列或序列集群的一系列所述成对比对产生最终比对。

在一些实施方案中，本发明的外源性LAL多肽包括野生型序列的变异体。这些变异体属于三种类别中的一种或多种：取代、***或缺失变异体。这些变异体可以是天然存在的等位基因或种间变异体，或它们可以通过编码蛋白质的DNA中的核苷酸的位点特异性诱变来制备。位点特异性诱变可以使用序列盒，或PCR诱变或其它本领域熟知的技术来进行，以便产生编码变异体的DNA，并且此后在重组细胞培养物中表达DNA。具有至多约100-150个氨基酸残基的变异型靶蛋白片段可以通过活体外合成使用建立的技术来进行制备。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表是本领域所熟知的(Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-10919(1992))。

氨基酸取代通常是单一残基。***通常是约1至约20个氨基酸，不过可以容忍显著更长的***。缺失范围为约1至约20个残基，不过在一些情况下，缺失可以长得多。取代、缺失以及***或其任何组合可以用于得到最终衍生物。

在一些实施方案中，外源性LAL的比活性为至少约100U/mg。在一些实施方案中，外源性LAL的比活性为至少约200U/mg。在一些实施方案中，外源性LAL的比活性为至少约250U/mg。在一些实施方案中，外源性LAL的比活性为约100至约1000U/mg。在一些实施方案中，外源性LAL的比活性为约100至约500U/mg。在一些实施方案中，外源性LAL的比活性为约100至约350U/mg。在一些实施方案中，外源性LAL的比活性为约200至约350U/mg。在一些实施方案中，外源性LAL的比活性为约250至约350U/mg。在一些实施方案中，外源性LAL的比活性为约250U/mg。在一些实施方案中，外源性LAL的比活性为约275U/mg。在一些实施方案中，外源性LAL的比活性为约300U/mg。人LAL在它的氨基酸序列中具有6个潜在位点用于N-连接型糖基化：Asn36、Asn72、Asn101、Asn161、Asn273以及Asn321，如SEQ ID NO：1中所示。在一些实施方案中，至少1、2、3、4或5个N-连接型糖基化位点被糖基化。在一些实施方案中，所有6个糖基化位点都被糖基化。在一些实施方案中，Asn36、Asn101、Asn161、Asn273以及Asn321被糖基化。在一些实施方案中，Asn36、Asn101、Asn161、Asn273以及Asn321被糖基化，并且Asn72未糖基化。在一些实施方案中，N-聚糖结构包含具有N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、甘露糖和/或甘露糖-6-磷酸(M6P)的二、三以及四触角结构。在一些实施方案中，外源性LAL在Asn101、Asn161以及Asn273处包含M6P-修饰的N-聚糖。在一些实施方案中，外源性LAL不包含O-连接型聚糖。在一些实施方案中，外源性LAL不包含唾液酸。在一些实施方案中，外源性LAL具有2011年4月23日提交的PCT/US2011/033699中所述的糖基化型态，所述文献以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方案中，外源性LAL的分子量是约55kD。

在某些实施方案中，受试者可以用例如在载体中的编码外源性LAL的核酸分子进行治疗。编码多肽的核酸的剂量在每名患者约10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg或30-300μg DNA范围内。感染性病毒载体的剂量在每个剂量10-100或更多个病毒粒子之间变化。

在本发明的一些实施方案中，外源性LAL在包括以下的治疗方法中施用：(1)用表达LAL或其活性片段、变异体、或衍生物的核酸(例如载体)转化或转染可植入的宿主细胞；以及(2)将转化的宿主细胞植入到哺乳动物中。在本发明的一些实施方案中，将可植入的宿主细胞从哺乳动物中移出、短暂培养、用分离的编码外源性LAL的核酸转化或转染、并且再植入到移出它的同一哺乳动物中。所述细胞可以但不要求从它所植入的同一部位处移出。所述实施方案，有时称为离体基因疗法，可以持续一段有限的时间提供外源性LAL多肽的连续供应。

尽管本发明中提供的治疗蛋白，即重组LAL，有可能以原始形式施用，但是优选的是将治疗蛋白作为药物制剂的一部分施用。

因此本发明还提供药物制剂，所述制剂包含禽类得到的糖基化治疗蛋白或其药学上可接受的衍生物连同其一种或多种药学上可接受的载剂以及任选地其它治疗和/或预防成分；和施用所述药物制剂的方法。本发明还提供药物制剂，所述制剂包含哺乳动物得到的糖基化治疗蛋白或其药学上可接受的衍生物连同其一种或多种药学上可接受的载剂，以及任选地其它治疗和/或预防成分；和施用所述药物制剂的方法。

载剂在与制剂的其它成分可相容并且对其接受者无害的意义上必须是“可接受的”。使用本发明的药物组合物治疗患者的方法(例如，施用的药物蛋白的量、施用频率以及治疗持续时间)可以使用熟悉本领域的医生已知的标准方法来确定。

药物制剂包括适于口服、直肠、经鼻、局部(包括颊和舌下)、***或肠胃外的那些制剂。药物制剂包括适于通过注射(包括肌肉内、皮下以及静脉内施用)来施用的那些制剂。药物制剂还包括通过吸入或吹入施用的那些制剂。适当时，制剂可以便利地以不连续剂量单位形式呈现，并且可以通过药剂学领域熟知的任何方法来制备。制备药物制剂的方法通常包括下列步骤：使治疗蛋白与液体载剂或细粉状固体载剂或两者相缔合，并且然后必要时，使产物成形为所需的制剂。

适于口服施用的药物制剂可以便利地作为以下形式呈现：不连续单位，如各自含有预定量的活性成分的胶囊、扁囊或片剂；作为粉末或颗粒；作为溶液；作为悬浮液；或作为乳液。活性成分还可以作为大丸剂、舐剂或糊剂呈现。用于口服施用的片剂和胶囊可以含有常规赋形剂，如粘合剂、填料、润滑剂、崩解剂或润湿剂。片剂可以根据本领域熟知的方法来涂覆包衣。口服液体制剂可以呈例如水性或油性悬浮液、溶液、乳液、糖浆或酏剂的形式，或可以作为干燥产物呈现，以在使用之前用水或其它适合的媒介物复原。所述液体制剂可以含有常规添加剂，如悬浮剂、乳化剂、非水性媒介物(可以包括可食用油)或防腐剂。

本发明的治疗蛋白还可以被配制用于肠胃外施用(例如通过注射，例如团注或连续输注)，并且可以与添加的防腐剂一起以单位剂型在安瓿、预填充注射器、小体积输注液中或在多剂量容器中呈现。治疗蛋白可以例如通过皮下注射、肌肉内注射和静脉内(IV)输注或注射来进行注射。在一个实施方案中，外源性LAL通过任何有用的方法通过IV输注来静脉内施用。在一个实例中。外源性LAL可以通过外周管线通过静脉内输注施用。在另一实例中，外源性LAL可以通过外周***的中心导管通过静脉内输注施用。在另一实例中，外源性LAL可以通过静脉内输注来施用，所述静脉内输注由附接至静脉血管接入端口的携带式输注机来促进。在一个静脉内输注的实施方案中，取决于待输注的药剂的量和患者之前的输注相关的反应历史，药剂在1至8小时的一段时间内进行施用，如由熟悉本领域的医生所确定。在另一实施方案中，外源性LAL通过IV注射静脉内施用。在另一实施方案中，外源性LAL可以经由腹膜内注射施用。在另一实施方案中，外源性LAL经由治疗蛋白的药学上可接受的胶囊来施用。例如，胶囊可以是肠衣包覆的明胶胶囊。

在一些实施方案中，治疗蛋白通过输注施用，并且输注可以在一段延长的时间段例如30分钟至10小时内进行。因此，输注可以在例如约1小时、约2小时、约3小时、约4小时或约5小时的一段时间内进行。输注还可以以多种速率来进行。因此，例如，输注速率可以为约1mL/小时至约20mL/小时。在一些实施方案中，输注速率为5mL至10mL/小时。在一个实施方案中，输注速率为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mL/小时。在一个实施方案中，输注速率为0.1至5mg/kg/h。在一个实施方案中，输注速率为约0.1、约0.2、约0.3、约0.5、约1.0、约1.5、约2.0或约3mg/kg/h。

治疗蛋白可以呈这些形式，如油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制试剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。治疗蛋白可以呈粉末形式，所述形式通过无菌固体的无菌分离或溶液的冻干而获得，以用于在使用之前用适合的媒介物例如无菌、无热原质水进行复原。

对于局部施用至表皮，治疗蛋白可以配制成药膏剂、乳膏剂或洗剂或透皮贴片。药膏剂和乳膏剂可以例如用水性或油性基剂在添加适合的增稠剂和/或胶凝剂的情况下进行配制。洗剂可以用水性或油性基剂来进行配制，并且一般还含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。

适于在口中局部施用的制剂包括锭剂，其在调味的基剂(通常是蔗糖和***胶或黄芪胶)中包含活性成分；香锭，其在惰性基剂如明胶和甘油或蔗糖和***胶中包含活性成分；以及漱口剂，其在适合的液体载剂中包含活性成分。

将适于直肠施用的其中载剂是固体的药物制剂最优选地表示为单位剂量栓剂。适合的载剂包括可可脂和本领域通常使用的其它材料，并且栓剂可以便利地通过下列方式形成：混合活性化合物与软化的或熔融的载剂，然后冷却并在模具中成型。

适于***施用的制剂可以呈现为子宫托、止血栓、乳膏剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂，其除了活性成分还含有如本领域已知适当的这些载剂。

对于鼻内施用，本发明的治疗蛋白可以用作液体喷雾剂或可分散粉末或滴剂的形式。

滴剂可以用水性或非水性基剂来进行配制，所述基剂还包含一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮液。液体喷雾剂宜从加压包递送。

对于吸入施用，根据本发明的治疗蛋白可以便利地从吹入器、喷雾器或加压包或者递送气雾剂喷雾的其它便利构件递送。加压包可以包含适合的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀以递送计量的量来确定。

对于通过吸入或吹入施用，根据本发明的治疗蛋白可以采取干粉组合物的形式，所述形式例如化合物与适合的粉末基剂例如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末组合物可以以单位剂型形式在例如胶囊或药筒，或者例如在吸入器或吹入器辅助下可以施用粉末的明胶或泡罩袋中呈现。当需要时，可以采用经过适配以便提供活性成分的持续释放的上述制剂。

根据本发明的药物组合物还可以含有其它活性成分，如抗微生物剂或防腐剂。

在一些实施方案中，外源性LAL在药物组合物中的浓度为约0.5至约10mg/ml。在一些实施方案中，LAL的浓度为约1至约5mg/mL。在一些实施方案中，LAL的浓度为约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5或约7.5mg/mL。

在一些实施方案中，包含外源性LAL的药物组合物还包含缓冲剂。示例性缓冲剂包括乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐以及谷氨酸盐缓冲剂。示例性缓冲剂还包括柠檬酸锂、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸钙、乳酸锂、乳酸钠、乳酸钾、乳酸钙、磷酸锂、磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙、马来酸锂、马来酸钠、马来酸钾、马来酸钙、酒石酸锂、酒石酸钠、酒石酸钾、酒石酸钙、琥珀酸锂、琥珀酸钠、琥珀酸钾、琥珀酸钙、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、乙酸钙、以及其混合物。在一些实施方案中，缓冲剂是二水合柠檬酸三钠。在一些实施方案中，缓冲剂是单水合柠檬酸。在一些实施方案中，药物组合物包含柠檬酸三钠脱水物和单水合柠檬酸。

在一些实施方案中，包含外源性LAL的药物组合物还包含稳定剂。示例性稳定剂包括白蛋白、海藻糖、砂糖、氨基酸、多元醇、环糊精，如氯化钠、氯化镁以及氯化钙等盐，冻干保护剂以及其混合物。在一些实施方案中，药物组合物包含人血清白蛋白。

在一个特定实例中，如本文公开产生的重组人LAL被用于药物制剂中，其中每1毫升含有外源性LAL(例如，2mg LAL)、柠檬酸三钠脱水物(例如，13.7mg)、单水合柠檬酸(例如，1.57mg)以及人血清白蛋白(例如，10mg)，并且被配制成酸性pH，如5.9±0.1。本发明涵盖有利于外源性LAL摄取到相关器官和组织的溶酶体中的任何施用途径。

实施例

下列特定实施例意欲说明本发明，并且不应理解为限制本发明的范围。

实施例1

通过施用重组LAL来治疗早发性LAL缺乏(沃尔曼氏病)

在15周龄时，男性婴儿因为出生后增重不良(出生体重：3.88kg)而住院。婴儿呈现有呕吐、喂养问题、营养状态差、腹泻、腹胀和贫血增加。患者被诊断患有沃尔曼氏病。

在初始身体检查时，患者体重5.62kg，使他处于年龄标准体重的第5个百分位数以下。在从15周龄初始检查并且在19周龄初始输注之前的接下来的4周中，患者未能增重。估计的生长速度经过计算小于年龄标准体重的第1个百分位数。腹部明显膨胀，具有明显的肝肿大和脾肿大。腹部超声和CT扫描证实肝脾肿大和双边对称增大的伴有钙化的肾上腺。血清丙氨酸转氨酶(ALT)的水平升高到119U/L(正常10-50U/L)，天冬氨酸转氨酶(AST)也升高到216U/L(正常10-45U/L)。在治疗起始之前，血清铁蛋白(炎症标记物)为约1,500μg/L(正常7-144μg/L)。患者在治疗前持续贫血，血红蛋白值的范围在7.2与8.3g/dL之间。

在19周龄，以0.2mg/kg的初始计量起始每周一次IV输注rhLAL(SBC-102)。在SBC-102输注之前患者用1mg/kg的苯海拉明预治疗约90分钟，以抵消潜在的输注反应。输注持续时间为约4小时。输注耐受良好，并且患者未经历任何不良事件或输注相关反应。

在初始输注七天后，对患者施用第二次输注。患者被给予0.3mg/kg的SBC-102持续约4小时，并且耐受输注，而未展现出任何不良事件的迹象。

在开始治疗两周内，患者展现出总体健康状况显著改善，包括机敏性和反应性增加。腹泻和呕吐稳定。患者开始增重，并且展现出血清转氨酶(例如，AST和ALT)明显降低，基本上到达正常水平(图1A和1B)。患者的生长速度快速正常化(图3和4)。腹胀降低，对应的腹围减小。肝功能检验显示持续改善(图1A和1B)。

在第三次就诊时，患者接受0.5mg/kg的SBC-102。输注持续耐受良好。临床状态显示持续改善，在7天内增重150g，并且从治疗起始时起，臂围增加了1.5cm(图3和4)。肝脏检验是稳定的，血红蛋白水平增加(10-11g/dL)，并且铁蛋白水平持续降低(图2)。在治疗之前碱性磷酸酶在低正常范围内：137U/L(正常110-300U/L)，并且随着治疗增加(204U/L)。SBC-102施用的这种作用与临床前疾病模型中获得的观察情况一致。

开始第四次输注，患者开始接受每周剂量1.0mg/kg。在治疗起始两个月后，患者的生长实质性改善，估计的生长速度接近第95个百分位数。生长的这一增加导致在63天中增重1.25kg或2.79磅，体重为7.21kg，使他处于年龄标准体重的30百分位数(图3和4)。AST和ALT水平都在第一次输注后快速降低。

治疗三个月后，AST和ALT正常。除了肝功能改善以外，还观察到铁蛋白显著降低(图2)。

在4个月的治疗过程中，患者的GI症状消退，并且患者的营养状态优良。患者持续增重(图3和4)并且证实了正常健康婴儿的身体体征。患者持续耐受输注，而未展现出任何输注反应或其它副作用。患者作为门诊病人接受了第21个剂量1.0mg/kg。

实施例2

用于早发性LAL缺乏的研究设计

通过每周IV输注施用SBC-102，即在转基因鸡中产生的rhLAL。所述研究被设计成评估通过每周IV输注施用SBC-102的两个给药方案的安全性、耐受性以及功效。因而，本研究中的主要结果变量决定了SBC-102在由于LAL缺乏而患有生长不足的儿童中的安全性和耐受性，并且包括：生命体征和身体检查发现结果；临床实验室检验；抗药物抗体检验；以及并行药剂的使用。考虑到生长不足是LAL缺乏/沃尔曼表型的普遍临床特征，因此对此病症的成功治疗应能够解决受LAL缺乏影响的儿童中所见的生长不足。评估与儿童的生长和营养状态直接相关的参数作为次要或探索性目标：例如体重的增量生长速度、体重增加以及线性生长速率。本研究还调查了SBC-102对药效学生物标记物；肝脏和脾脏大小；***病；血红蛋白和血小板；肝功能和营养的实验室评价；腹围、中上臂围以及头围的影响。本研究还描述了SBC-102在由于LAL缺乏而患有生长不足的儿童中的初步药物代谢动力学，包括血浆Cmax和估计的清除率。

表1：评价方案：筛选直至第24周

^P输注前

¹年龄适当的HRQOL

²身体检查将包括测量体重(仅筛选时的身长)、评价肝脏和脾脏大小、***病以及动脉病。

受试者被征募到两个相同规模的连续组群中(每个组群有4位受试者)。在各组群内和组群之间交错给药，其中给药始于较低剂量组群(组群1；开始剂量：0.35mg·kg^-1)中的第一位受试者。组群1中其它受试者的给药和较高剂量组群(组群2；开始剂量1mg·kg^-1)中给药的起始是基于在先受试者中的可接受的安全性和耐受性。

组群1

在研究中征募的前四位受试者构成了组群1。所述组群中的第一位受试者接受0.35mg·kg^-1单次剂量的SBC-102，并且如果基于给药后至少24小时的安全性评论被批准用于持续给药，那么受试者则在一周之后接受第二次剂量0.35mg·kg^-1的SBC-102。在受试者接受第二次剂量的SBC-102之后，评论所有可获得的安全性数据，此时就是否将第一位受试者的剂量升高至1mg·kg^-1并且起始组群1中其它受试者的给药来决定可接受性。组群1的其它3位受试者的给药以类似方式进行。如果安全性评论未授权将受试者的剂量从0.35mg·kg^-1升高至1mg·kg^-1，但认为受试者继续在所述开始剂量下治疗是安全的，那么受试者可以继续接受0.35mg·kg^-1的剂量。如果组群1中的任何受试者在接受至少4个1mg·kg^-1剂量的SBC-102后展现出对治疗的反应欠佳，那么考虑将剂量进一步升高至3mg·kg^-1。

组群2

在组群1完全征募到并且评论了组群1中至少2位接受2次或更多次1mg·kg^-1剂量的SBC-102的受试者的安全性之后，开始组群2的给药。将后4位进入研究的受试者征募到组群2中并给药。所述组群中的第一位受试者接受1mg·kg^-1单次剂量的SBC-102，并且如果基于给药后至少24小时的安全性评论被批准用于持续给药，那么受试者则在一周之后接受第二次剂量1mg·kg^-1的SBC-102。在受试者接受第二次剂量的SBC-102之后，关于以下各项的可接受性评论所有可获得的安全性数据：将第一位受试者的剂量升高至3mg·kg^-1并且起始组群2中其它受试者的给药。在具有安全性评论的情况下，组群2的其它3位受试者的给药以类似方式进行。如果安全性评论者未批准将受试者的剂量从1mg·kg^-1升高至3mg·kg^-1，但认为受试者继续在所述开始剂量下治疗是安全的，那么受试者可以继续接受1mg·kg^-1的剂量。如果受试者对1mg·kg^-1的开始剂量并不良好耐受，那么可以考虑0.35mg·kg^-1的降低的剂量。

所述研究包括约22次计划的就诊：第1次就诊(筛选)、第2次就诊(基线评价，研究药物的开始)至第21次就诊(每周施用研究药物)、第22次就诊(跟踪研究结束)。考虑到由于LAL缺乏所致的早发性生长不足的严重性和威胁生命的性质，这些患者有可能住院。

所述研究的目标群体是由于LAL缺乏而患有生长不足的男童和女童。如果满足以下标准，那么受试者对于参与本研究来说合格：(1)受试者的父母或法定监护人了解所述研究的全部性质和目的，包括可能的风险和副作用，并且在任何研究程序进行之前提供了书面知情同意/许可；(2)相对于进行测定的正常实验室范围，男童或女童具有证明的LAL活性下降或具有确诊LAL缺乏的证明的分子遗传学测试结果；并且(3)生长不足在6个月龄之前发作。

安全性

主要安全性终点包括不良事件(AE)的发生率和输注相关的反应(IRR)；生命体征(血压、心率、呼吸速率以及体温)自基线的变化、身体检查发现结果以及临床实验室检验(CBC/血液学、血清化学以及尿分析)；并行药剂/治疗的使用；以及抗SBC-102抗体(ADA)的表征，包括血清转化率、血清转化时间、中值和峰值免疫球蛋白G(IgG)ADA效价以及峰值IgG ADA效价时间。

功效

功效终点包括：(1)肝脏和脾脏大小自基线的变化和/或变化百分率(通过超声)和肝脏和脾脏的体积和脂肪含量(通过磁共振成像[MRI])；和(2)血清转氨酶、血清脂质(总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白[HDL]以及低密度脂蛋白[LDL])、血红蛋白以及血小板计数自基线的变化。还评估了≤18岁的受试者的生长参数，包括百分位数和z得分自基线的变化。这些生长参数是基于疾病控制中心(CDC)生长图并且包括＜30个月龄的受试者的年龄标准体重(WFA)、身长标准体重(WFL)、年龄标准身长(LFA)以及年龄标准头围(HCFA)；和≥36个月至18岁的受试者的WFA、年龄标准身长(SFA；应注意身长是指受试者的身高)以及身长标准体重(WFS)，以及所有受试者中体重偏低、消瘦以及生长迟缓的对应的生长状态指标。

实施例3

早发性LAL缺乏患者的身体评价

应考虑临床稳定性足以耐受全身麻醉的患者用于中心管线放置用于长期血管接入。在接受全身麻醉和/或镇静用于其它程序的受试者中，考虑基线腹部磁共振成像(MRI)扫描。在要求全身麻醉和/或镇静的新程序的情况下，在跟踪MRI是在第一次输注后不早于3个月的情况下，考虑跟踪MRI。测量人体测量参数(体重、身高、腹围、中上臂围和头围)。进行全身身体检查。进行完全身体检查。检查包括评价受试者的一般性外观、皮肤、头、眼、耳、鼻以及喉咙、心、肺、腹、四肢/关节和神经学状态。每次身体检查还包括下列各项：

肝脏大小：进行肝脏大小(可触及/不可触及，和肋缘下的厘米数)、规则性(光滑/有结节)以及敏感性(触痛/非触痛)的临床评价。

脾脏大小：进行脾脏大小(可触及/不可触及，和肋缘下的厘米数)、规则性(光滑/有结节)以及敏感性(触痛/非触痛)的临床评价。

***病：进行任何可触及的***的大小、位置以及特点的评价。待检查的区域包括：头部(枕骨、耳前、耳廓后、颏下、下颌下)、颈部、锁骨、腋窝以及腹股沟。任何增大的结节被表征为触痛或非触痛。

照片：拍摄受试者在仰卧位(全长和腹部特写)的数字影像。

肝脏/脾脏超声和MRI

可以进行腹部超声检查以测量肝脏和脾脏大小。腹部MRI可以提供肝脏和脾脏体积的更好量化，并且在第一次输注后至少3月的就诊时被认为在基线处。

生命体征

生命体征包括脉搏率、呼吸率、收缩期和舒张期血压以及核心体温(直肠或口腔)。在受试者处于仰卧位置后进行脉搏率和血压的评价。生命体征在所有研究就诊时都测量。在给药的当天，在输注前、输注期间和输注后2小时内每15分钟(±10)，并且然后在输注完成后的2小时与4小时之间每30分钟(±15)记录生命体征。

实施例4

实验室评价

进行下列实验室评价作为诊断检验和功效：

1)CBC/血液学：白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、血球密度、平均血细胞比容(MCV)、平均血细胞血红蛋白含量(MCH)、平均血细胞血红蛋白浓度(MCHC)、血小板计数、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、用于细胞形态学检查的外周涂片

2)化学组：葡萄糖、尿氮、肌酸酐、钠、钾、氯化物、钙(总钙和离子化钙)、镁、无机磷、总蛋白质、乳酸脱氢酶

3)肝功能检验：AST/血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶(SGOT)、ALT/血清谷氨酸丙酮酸转氨酶(SGPT)、碱性磷酸酶、γ谷氨酰转肽酶(GGTP)、白蛋白、胆红素(直接、总)

4)抗药物抗体：抗SBC-102抗体

5)尿分析：pH、葡萄糖、酮、血液、蛋白质、亚硝酸根

6)凝结研究：白细胞(如果血液、亚硝酸根和/或白细胞异常，则可以进行显微镜检查)

7)实验室营养评价：血清α生育酚∶胆固醇比、25OH维生素D、血清视黄醇、二去氢视黄醇、运甲状腺素蛋白、血清铁蛋白

8)脂质组：总胆固醇、甘油三酯、HDL、LDL

9)基因特征

DNA序列，包括蛋白质编码序列与调控基因转录、信使核糖核酸(mRNA)稳定性以及可鉴定的蛋白质翻译的效率的序列，这些序列包括：

1.溶酶体酸性脂肪酶(LIPA基因)

2.编码脂质生物学中涉及的其它蛋白质的基因，所述蛋白质可以促成和/或改变LAL缺乏的疾病表型，例如ABCA1

3.可改良对任何SBC-102的易感性的基因。

10)药物代谢动力学评价

为了降低医源性贫血的风险，可以限制PK取样。按重要性顺序，收集样品以取得下列参数：1)Cmax和2)CL的估值。在第0天(剂量1)和第105天(剂量16)收集用于测量SBC-102血清水平的样品。在所有受试者中，给药前(给药30分钟内)；在开始输注后90(±5)分钟；以及在开始输注后110(±5)分钟收集样品。在和生命体征评价一致的所有时间点处取得所有PK样品，之后在非输注臂上进行箍袖带吹胀用于BP评价。在箍袖带放气至少5分钟后在其它时间点获取PK样品。

实施例5

剂量制备和输注

SBC-102作为透明液体以单次剂量在10mL玻璃小瓶中提供。溶液(总计10.5mL，包括5％的过量填充)的浓度为2mg·mL^-1。所有SBC-102小瓶均储存在2-8℃的控制温度下。将小瓶冷冻，并且在储存期间避光保存。含有在0.9％盐水中稀释的SBC-102的注射器在临输注前制备。当预先制备SBC-102的注射器时，将稀释溶液加以标记，并且在制备4小时以内使用。

患者的体重，如在给药前在输注的当日早晨进行记录并且四舍五入到最接近的0.1kg，用于计算每次输注的SBC-102体积。在研究中使用的总输注体积是基于表2中列出的给药方案。

表2

剂量	输注体积
		0.35mg/kg	10mL
1mg/kg	10mL
		3mg/kg	20mL

剂量制备和施用应使用无菌无热原质一次性材料来进行，所述材料包括但不局限于注射器、针头、转移管以及活塞。

流量调节装置的输注速率应被设定为在约120分钟内施用全部的体积，如表3中所示。

表3

剂量

输注速率/小时

输注速率/分钟

输注速率/公斤/

			小时
				0.35mg/kg	5mL	0.083mL	0.175mg/kg/hr
1mg/kg	5mL	0.083mL	0.5mg/kg/hr
				3mg/kg	10mL	0.167mL	1.5mg/kg/hr

实施例6

不良事件(AE)

在经历临床上显著的心血管、呼吸或其它作用的AE或输注相关反应(IRR)的受试者中，根据在小于2岁的儿童中用于严重输注反应管理的制度指南，输注应该中断并且必须针对过敏性反应对受试者进行处理。必要时，这可以包括静脉内抗组胺剂、皮质类固醇以及肾上腺素。对于相关生物产品，大部分延迟的IRR在输注后超过24小时发生。症状包括关节痛、肌痛、流感样症状、头痛、疲倦以及皮疹或荨麻疹。延迟的反应可以用临床上指示的镇痛药或抗组胺剂来治疗。IRR分类为急性(开始输注24小时内发生)或延迟(在输注后1天与6天之间发生)。用于治疗超敏性反应的药剂和设备对于在未预料的严重的超敏性反应的情况下立即使用来说必须可获得。这些供应物包括但不局限于氧气、对乙酰氨基酚、抗组胺剂(例如苯海拉明，肠胃外和PO)、皮质类固醇、肾上腺素以及心肺复苏装置。在类似的生物产品中，大部分急性IRR在输注24小时内发生(

处方信息)。可能的急性IRR的迹象可以分类为：轻度至中度IRR：充血、潮红、发烧和/或寒战、恶心、瘙痒、荨麻疹、胃肠症状(呕吐、腹泻、腹部绞痛)。轻度反应定义为在暂时停止或降低输注速率后自我限制性、自发消退的反应。中度反应定义为用简单的措施未消退，要求延长的观察和治疗中断的反应。严重的IRR伴有胸痛、呼吸困难、哮鸣、喘鸣、低血压或高血压、呼吸停止、呼吸暂停、呼吸困难、心动徐缓或心动过速。在输注过程中如果观察到上述迹象和症状中的任一种，并且受试者保持血液动力学稳定，那么输注速率可减慢(降低至事件发作时所给予的速率的一半，例如由10mL·hr^-1降至5mL·hr^-1)，并且输注时间延长。在事件消退后，输注应该在降低的速率下持续最少30分钟，之后速率增加至输注方案中初始速率的75％。如果受试者继续显示出超敏性的迹象，根据在小于2岁的儿童中用于输注反应管理的制度指南，可以施用IM或低IV剂量的抗组胺剂。

实施例7

向患有迟发性LAL缺乏的人患者施用rhLAL

所述研究的主要目标是评估SBC-102在由于迟发性LAL缺乏而患有肝功能障碍的患者中的安全性和耐受性(生命体征、身体检查、临床实验室检验、免疫原性检验、不良事件评价、并行治疗)。次要目标是表征通过IV输注递送的SBC-102在单次和多次剂量(在第0天和第21天的输注前后)之后的药物代谢动力学。迟发性LAL缺乏受试者的纳入标准如下：

1.患者了解所述研究的全部性质和目的，包括可能的风险和副作用，并且愿意且能够遵守所有研究程序并提供了知情同意；

2.男性或女性患者≥18岁并且≤65岁；

3.相对于进行测定的正常实验室范围，证明的LAL活性下降，或确诊LAL缺乏的证明的分子遗传学测试结果；

4.基于临床呈现(肝肿大)和/或实验室检验结果(ALT或AST≥1.5×ULN)，肝损害的证据；

5.如果正用斯达汀或依泽替米贝，那么在筛选之前患者必须处于稳定剂量持续至少4周；

6.所有女性在筛选时必须具有阴性血清妊娠检验并且不能哺乳；并且

7.有生产可能的女性患者必须同意使用高度有效且经过批准的避孕法，持续整个研究时间并且在最后一个剂量后继续使用30天。

临床评价包括身体检查、尿分析、临床化学分析、CBC/血液学、急性期反应物、凝结研究、12导联ECG、抗SBC-102抗体、以及PK，以获得Cmax、AUC_inf、T_1/2、Cl以及V_SS。

在2小时内经由静脉内(IV)输注每周一次向患者给予0.35mg·kg^-1、1mg·kg^-1或3mg·kg^-1的LAL。向第一位受试者给药并且在进行所述组群中的其它受试者的给药之前监控耐受性，持续至少24小时。各受试者在他们第一次输注SBC-102之后仍保持为住院病人，持续24小时。受试者继续另外3个剂量的每周一次的SBC-102剂量的IV输注，条件是耐受性和安全性保持可接受。

药物代谢动力学

使用进入研究的接受至少一个剂量的研究药剂的所有受试者分析PK数据，但排除可能受主要方案偏差影响的任何数据点。使用单室输注模型进行PK分析。获得以下PK参数并由组群呈现(Cmax、AUC_inf、T_1/2、Cl以及V_SS)。使用第2次就诊和第6次就诊的数据比较单次和多次剂量PK参数。

在本研究中剂量之间的建议增量可以是3、4、5或6倍，这可以允许以mg·kg^-1计跨6倍剂量范围评价在人体中的初始安全性、耐受性以及药物代谢动力学。在相关的临床前大鼠模型中，1mg·kg^-1每周一次、3mg·kg^-1每两周一次以及5mg·kg^-1每周一次的药效学作用是相当的。因此，虽然并未预期受试者需要大于3mg·kg^-1每周一次的剂量，但取决于疾病的严重性可以考虑大于3mg·kg^-1如4、5、6、7、8、9或10mg·kg^-1的剂量。

研究设计

考虑到患有此病状的患者的罕见性，用于本研究的目标数量是9位可评估的受试者。受试者被征募到三个连续组群中，每个组群3位受试者。被分配到组群1的受试者开始第一次给药，接着是那些分配给组群2的受试者，然后是在组群3中给药。

表4：迟发性LAL缺乏研究方案：就诊、评价以及间隔

TC＝电话呼叫

^p给药前

¹包括饮酒史(AUDIT问卷调查)

²包括身高和体重

³给药前、输注期间每15分钟、输注后2小时内每15分钟、和输注后2-4小时内每30分钟

⁴第1次就诊和第8次就诊时的血清；第2次就诊和第6次就诊时的尿

⁵给药前，输注期间10、15、20、40、60、90分钟，输注结束时(约120分钟)和输注后5、10、20、30、40、60以及120分钟

组群1

3位受试者接受0.35mg·kg^-1的SBC-102的IV输注。对第一位受试者给药并且监控耐受性持续至少24小时，随后进行所述组群中的其它2位受试者的给药。各受试者在他们第一次输注SBC-102之后仍保持为住院病人，持续24小时。受试者继续另外3个0.35mg·kg^-1的IV输注，条件是耐受性和安全性可接受。

组群2

3位受试者接受1mg·kg^-1的SBC-102的IV输注。对组群2中的第一位受试者给药并且监控耐受性持续至少24小时，随后进行所述组群中的其它2位受试者的给药。各受试者在他们第一次输注SBC-102之后仍保持为住院病人，持续24小时。受试者继续另外3个1mg·kg^-1的IV输注，条件是耐受性和安全性可接受。

组群3

3位受试者接受3mg·kg^-1的SBC-102的IV输注。对组群3中的第一位受试者给药并且监控耐受性持续至少24小时，随后进行所述组群中的其它受试者的给药。各受试者在他们第一次输注SBC-102之后仍保持为住院病人，持续24小时。受试者继续另外3个3mg·kg^-1剂量的每周一次的IV输注，条件是耐受性和安全性可接受。

由于耐受性差或潜在安全性风险，安全委员会(SC)可以在任何点停止整个组群的给药或停止单个受试者的给药。

如果受试者在除了第8次就诊(研究结束)以外的计划就诊时或在未计划的就诊时中断研究治疗，那么受试者应在最后一次剂量的SBC-102后不早于7天返回，用于结束在第8次就诊时进行的研究评价。

在第2、4、5以及6次就诊时通过IV输注施用SBC-102。在研究期间始终记录并行治疗。从签署知情同意之时记录不良事件。

各受试者接受总计4周剂量的SBC-102，条件是耐受性和安全性保持可接受。

研究持续时间

所述研究包括4周的SBC-102给药和支持安全性与用于后续临床试验的给药方案的评估的洗脱期。在完成本研究之后，受试者适合于在另一方案下继续SBC-102，以便评价SBC-102在患有LAL缺乏/CESD表型的患者中的长期安全性和功效。

身体检查

由有行医资格的人士进行全身身体检查。应指定并记录***(包括但不限于心血管、呼吸、胃肠道以及神经***)。在每次进行检查时应说明任何异常。适用时，应将新诊断出的异常记录为不良事件。

在筛选就诊时待进行的其它身体检查评价：

a)肝脏大小：进行肝脏大小(可触及/不可触及，和肋缘下的厘米数)、规则性(光滑/有结节)以及敏感性(触痛/非触痛)的临床评价。

b)***病：进行任何可触及的***的大小、位置以及特点的评价。待检查的区域包括：头部(枕骨、耳前、耳廓后、颏下、下颌下)、颈部、锁骨、腋窝以及腹股沟。任何增大的结节被表征为触痛或非触痛。

c)动脉病：临床上评价右和左胫骨后与足背脉搏，并且记录右和左踝肱指数(ABI)。ABI被定义为足背或胫骨后动脉的收缩压除以右或左臂的臂收缩压(以较高者为准)的比率。

生命体征

测量生命体征，包括脉搏率、呼吸率、收缩期和舒张期血压以及体温。在受试者处于半仰卧位置至少5分钟之后进行脉搏率和血压的评价。在给药的当天，在输注前、输注期间和输注后2小时内每15分钟(±5)，并且然后在输注完成后的2小时与4小时之间每30分钟(±10)记录生命体征。其它读数可以在输注相关的反应(IRR)事件中根据研究人员的判断获取。在受试者已经仰卧至少5分钟之后获取具有正式记录的12-导联心电图(ECG)。

实验室评价

在评价方案中指示的各时间点收集样品用于实验室检验。进行以下分析(除了ESR、凝结研究以及抗SBC-102抗体以外)。

CBC/血液学：白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、血球密度、平均血细胞比容(MCV)、平均血细胞血红蛋白含量(MCH)、平均血细胞血红蛋白浓度(MCHC)、血小板计数、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞

化学组：葡萄糖、尿氮、肌酸酐、钠、钾、氯化物、钙、镁、无机磷、总蛋白质、乳酸脱氢酶、尿酸

肝功能检验：AST/SGOT、ALT/SGPT、碱性磷酸酶、GGTP、白蛋白、胆红素(直接、总)

脂质组：总胆固醇、甘油三酯、HDL、LDL

凝结研究：凝血酶原时间(PT)、国际标准化比率(INR)、活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)

尿分析：葡萄糖、酮、血液、pH、蛋白质、亚硝酸根以及白细胞(只有在血液、蛋白质、亚硝酸根和/或白细胞异常时，进行显微镜检查)

病毒性肝炎筛选：HBsAg和HCV血清学(在筛选时或如果在试验期间临床上有指示)

自身免疫性肝炎筛选：抗平滑肌抗体(ASMA)、抗核抗体(ANA)、抗LKM1抗体、抗SLA抗体

抗药物抗体：抗SBC-102抗体

急性期反应物：高敏感性C反应性蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)以及血清铁蛋白

妊娠检验：所有女性至少每月进行妊娠检验。这些检验使用在第1次就诊和第8次就诊时的血清以及第2次就诊和第6次就诊时的尿来进行。

药物代谢动力学(PK)评价：自与输注套管相对的臂上取PK样品。在第0天(剂量1，第2次就诊)和第21天(剂量4，第6次就诊)集中收集样品用于测量SBC-102血清水平：临给药前(给药30分钟以内)；在输注期间10(±1)、15(±1)、20(±1)、40(±2)、60(±2)以及90(±2)分钟；和在输注结束时(约120分钟)；以及在输注完成后5(±1)、10(±1)、20(±1)、30(±1)、40(±2)、60(±2)以及120(±2)分钟。

制备SBC-102

将第1次就诊时记录的受试者的体重用于计算用于每次输注的SBC-102体积。使用以下步骤通过稀释制备用于IV输注的SBC-102药品：

1.将小瓶自冷冻器移出。

2.确认小瓶上的有效期尚未过期。

3.确定给药所需的SBC-102的计算总体积。

实例：

受试者体重(按kg计)：70kg

受试者剂量水平：3mg·kg^-1

药物浓度：2.0mg·mL^-1

1.计算受试者剂量

2.计算注射体积：

4.基于给药组分配，使用以下0.9％盐水输注袋：

5.从100mL或250mL的0.9％盐水的输注袋中移出等于给药所需的SBC-102体积(如以上步骤3中所计算)的体积(即，使用以上实例，将105mL的盐水从250mL的输注袋中移出)。

6.将计算的SBC-102总体积抽取并转移到0.9％盐水输注袋(即，使用以上实例，将105mL的SBC-102溶液抽取并转移到输注袋中)。

7.使用温和的倒转来混合袋。

施用rhLAL

1.将IV输注管连接至SBC-102的稀释袋。

2.将管灌注，并且排出所有空气。

3.流量调节装置的输注速率被设定为在约100分钟内以以下速率施用总体积：

4.选择IV输注部位，它随受试者不同并且可以包括肘前或腕静脉(或中心静脉导管)。

5.将IV导管连接至血管导管。将盐水注射至IV管线中，以评价开放性并验证盐水容易冲洗。

6.用胶带将IV管线固定。

7.使用流量调节装置开始SBC-102输注。

8.定期监控输注。

9.当袋排空时，使用注射端口将25mL的0.9％盐水立即注射到输注袋中。

10.在相同输注速率下对管线进行冲洗(对于0.35mg·kg^-1和1mg·kg^-1剂量，为60mL/小时[1mL/分钟]，并且对于3mg·kg^-1剂量，为150mL/小时[2.5mL/分钟])，直到完成输注。输注结束被定义为输注和冲洗已经完成并且有文件记载时。

输注反应

输注相关的反应(IRR)被定义为任何免疫介导的至少有可能与输注相关的不良事件。IRR被分类为急性(开始输注24小时内发生)或延迟(在输注后1天与14天之间发生)。

用于治疗超敏性反应的药剂和设备对于在未预料的严重的超敏性反应的情况下立即使用来说必须可获得。它们包括但不局限于氧气、对乙酰氨基酚、抗组胺剂(例如苯海拉明，肠胃外和PO)、皮质类固醇、肾上腺素以及心肺复苏装置。

可能的急性IRR的迹象可以为充血、潮红、发烧和/或寒战、恶心、瘙痒、荨麻疹、胃肠症状(呕吐、腹泻、腹部绞痛)、心肺反应，包括胸痛、呼吸困难、哮鸣、喘鸣、低血压或高血压。如果在输注期间观察到任何以上迹象和症状并且受试者仍保持血流动力学稳定：输注速率必须减缓或停止。如果受试者继续显示超敏性的迹象，应施用抗组胺剂的IM或缓慢IV剂量。在经历具有临床上明显的心血管或呼吸作用的严重输注反应的受试者中，中断输注。在所述过敏反应中，受试者可以用静脉内抗组胺剂、皮质类固醇以及肾上腺素来治疗。

实施例8

在大鼠模型中施用重组LAL

在Yoshida和Kuriyama(1990)Laboratory Animal Science，第40卷，第486-489页(还参见Kuriyama等(1990)Journal of LipidResearch，第31卷，第1605-1611页；Nakagawa等，(1995)Journal ofLipid Research，第36卷，第2212-2218页)所述的LAL缺乏Donryu大鼠中评估重复给予重组人LAL对体重、组织甘油三酯和胆固醇、肝肿大、脾肿大、***病、肠重以及其它参数的影响，所述文献的公开内容是以引用的方式整体并入本文。在4周龄时，将对于LAL缺失为纯合(LAL-/-)的Donryu大鼠分成给予重组人LAL(在转基因鸡输卵管***中产生)或盐水安慰剂的组。将野生型年龄匹配的同窝出生大鼠用作对照。通过尾静脉注射以单次剂量或以按30分钟间隔给予的两个相等剂量，对LAL-/-大鼠每周给药一次，持续4周(总计给药4次)，或者每两周给药一次，持续4周(总共给药2次)。重组LAL的剂量为1mg/kg或5mg/kg。给药方案示于表5中。大鼠用苯海拉明(5mg/kg)预治疗以抵消潜在的过敏性反应，其程序是基于在用于治疗溶酶体贮积病的酶替代疗法的动物模型中的以前的经验(Shull等.(1994)Proceedings of the National Academy of Science，第91卷，第12937页；Bielicki等.(1999)The Journal of Biological Chemistry，274，第36335页；Vogler等.(1999)Pediatric Research，45，第838页.)，所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。

图9示出施用每周1mg/kg的重组LAL或每周5mg/kg的重组LAL或每两周5mg/kg的重组LAL的大鼠的增重的每日进展。在图中可见，在两个剂量大小和频率之间的治疗作用中差异很小或没有差异。

表5：LAL缺乏Donryu大鼠的称重和给药方案

实施例9

用重组LAL治疗的LAL-/-大鼠的病理学检查

在实施例8所述的研究结束时，将研究动物人道地安乐死，并且进行尸检以检查宏观病理学、组织病理学以及临床化学。宏观尸检包括检查身体的外表面、所有孔窍以及颅腔、胸腔和腹腔以及它们的内容物。测定大鼠的内部器官和组织的质量，并且收集器官和组织，并固定在10％中性缓冲的***中。在固定后，将组织进行处理并且制备苏木精和曙红染色的切片的组织载玻片并加以评价。

分析的治疗动物的宏观病理学检查显示肝脏大小和颜色得到实质性正常化，如在图10中示出的解剖标本中可见。测定了器官与体重的比率，并且证实了相比于安慰剂治疗的大鼠，被解剖的成功治疗的动物的肝脏、脾脏、肠系膜组织、十二指肠、空肠以及回肠的相对器官大小减小。分析的重组LAL治疗的大鼠的肝脏组织的组织病理学显示基本上正常的肝脏组织学，这与泡沫状巨噬细胞在安慰剂治疗的动物中的实质性积聚形成明显对照(图10)。

实施例10

重组人LAL在巨噬细胞和成纤维细胞溶酶体中的内化

在活体外使用巨噬细胞和成纤维细胞检查转基因禽得到的重组人LAL(“SBC-102”)结合细胞并内化至溶酶体代谢区中的能力。当与巨噬细胞一起孵育时，发现荧光标记的SBC-102定位至溶酶体。这种作用可以通过使用甘露糖多糖竞争剂来削弱，暗示N-乙酰基葡糖胺/甘露糖(GlcNAc/甘露糖)受体作为这些细胞的识别和摄取机制。在活体外孵育后，SBC-102增加了LAL缺乏人成纤维细胞和正常鼠类成纤维细胞中的细胞相关的LAL活性，表明暴露至SBC-102可以使得缺乏的酶活性被实质性替代。

甘露糖-6-磷酸(M6P)存在于SBC-102的寡糖结构中，所述寡糖结构已经显示参与溶酶体酶经由普遍存在的M6P受体递送至多种细胞类型中。

重组LAL是从转基因母鸡的卵白中纯化。Oregon Green NHS获自Invitrogen^TM(#0-10241)。大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383和小鼠成纤维细胞系NIH-3T3获自ATCC。缺乏LAL的沃尔曼氏病成纤维细胞获自Coriell Institute for Medical Research，并且LysoTracker

Red获自Invitrogen^TM。

酶标记：根据生产商的推荐，将PBS中的4mg的转基因禽得到的LAL用Oregon Green进行标记，随后将反应相对于PBS透析，然后浓缩。

巨噬细胞摄取：将荧光标记的转基因禽得到的LAL(5μg/mL)和LysoTracker

Red与NR8383细胞一起孵育2小时。通过共聚焦荧光显微术使用顺序扫描模式在488nm并且然后在514nm下检查细胞。

甘露聚糖的竞争抑制：将荧光标记的SBC-102(5μg/mL)和甘露聚糖与NR8383细胞一起孵育2小时。将细胞用胰蛋白酶处理，并且通过荧光活化的细胞分选使用中值荧光强度作为终点来测量重组LAL摄取。

使用巨噬细胞细胞系NR8383来检查转基因禽得到的LAL被吸收并且然后并入到靶细胞的溶酶体中的能力。将荧光标记的转基因禽得到的LAL和溶酶体标记物“LysoTracker

Red”(Invitrogen^TM)与细胞一起孵育2小时。随后通过共聚焦荧光显微术使用顺序扫描模式来检查转基因禽得到的LAL和溶酶体标记物在这些细胞的溶酶体中的共定位(图11)。重组LAL证实了定位至溶酶体，这与使用来自多种来源的重组人(rhLAL)的类似活体外研究一致。

转基因禽得到的LAL与GlcNAc/甘露糖受体的结合特异性通过竞争结合测定使用巨噬细胞细胞系NR8383来评价(图12)。5μg/mL的荧光标记的(Oregon Green)转基因禽得到的LAL和各种浓度的含甘露糖的寡糖甘露聚糖与细胞一起共孵育2小时。转基因禽得到的LAL的摄取被甘露聚糖的相对抑制(如与没有甘露聚糖对照相比较)通过荧光活化的细胞分选分析使用中值荧光强度作为终点来量化。观察到转基因禽得到的LAL结合/摄取的甘露糖剂量依赖性抑制，这与转基因禽得到的LAL:GlcNAcR的相互作用一致。

另外，在成纤维细胞中甘露糖-6-磷酸介导的摄取通过使用甘露糖-6-磷酸的竞争实验得以证实。

实施例11

在治疗的细胞中LAL活性增加

LAL催化胆固醇酯和甘油三酯水解为游离胆固醇、甘油以及游离脂肪酸。因此，LAL活性可以例如通过荧光底物4-甲基伞形酮油酸酯(4MUO)的裂解来测量。

成纤维细胞

使用正常和LAL-缺乏细胞在活体外检查转基因禽得到的LAL暴露增加细胞的LAL活性的能力。成纤维细胞分离自沃尔曼氏病患者，并且将正常鼠类成纤维细胞(NIH-3T3)在浓度为0、0.16或0.5微克/mL的转基因禽得到的LAL存在下孵育5小时。然后洗涤细胞以移除非特异性信号，并且使用4-甲基伞形酮油酸酯(4-MUO)底物测定细胞溶胞物的LAL活性。图13证实了相比于NIH-3T3，内源性细胞相关的LAL活性在沃尔曼氏病成纤维细胞中较低，并且在与转基因禽得到的LAL一起孵育后在两种细胞类型中都观察到LAL活性的剂量依赖性增加(图13)。

白细胞

血清单核白细胞获自施用前和施用后的LAL缺乏患者。血样冷藏储存，而不损失酶的活性。使用Ficoll和泛影酸钠的制剂从血液中分离单核白细胞(淋巴细胞)。将之前用汉克斯平衡盐溶液(Hanks’balanced salt solution)1∶1稀释的4-8mL血液轻缓地在3mLFicoll-Paque上分层并且离心。抽吸单核细胞环并且用汉克斯溶液洗涤一次，然后通过将离心块在1-2mL水中重悬而洗涤至少两次。将离心块在-20℃下冷冻，直到使用。在测定前，将离心块解冻，重悬在蒸馏水中，并且在冰上超声处理。然后在4℃下，将制剂在20,000×g下离心15min。测定前将上清液(含有0.5-1.5mg蛋白质/mL)保持在冰上。

通过下列方式制备用于酸脂肪酶测定的底物：将1ml含10mM4MUO(4-甲基伞形酮油酸酯)的己烷添加至1mL含16mM L-α-磷脂酰胆碱的CHCI₃中。在N₂下蒸发溶剂，并且添加25ml的2.4mM牛磺脱氧胆酸(钠盐)水溶液。将混合物在30-40W下在冰上超声处理1-2min。在测定之前，将1体积的底物储备液用7体积的200mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH 4.0)稀释。各个2mL反应试杯均含有100nmol 4-甲基伞形酮油酸酯、160nmol L-α-磷脂酰胆碱以及600nmol牛磺脱氧胆酸钠。

通过添加5-100μL酶来开始反应，并且在37℃下使用荧光分光光度计来监控。4MUO的裂解通过例如所释放的荧光团4-甲基伞形酮(4MU)在约360nm处的激发和在460nm处的发射来检测。记录荧光随时间的变化。

实施例12

重组人LAL(SBC-102)的活体内分析

将LAL-缺乏Yoshida大鼠(即，纯合)(参见Kuriyama等.(1990)，Journal of Lipid Research，第31卷，第1605-1611页；Nakagawa等.，(1995)Journal of Lipid Research，第36卷，第2212-2218页；以及Yoshida和Kuriyama(1990)Laboratory Animal Science，第40卷，第486-489页)用SBC-102(5mg/kg，IV)或安慰剂治疗，在4周龄时开始每周一次持续4周。对于每次施用，将SBC-102以两个相等剂量(2.5mg/kg)间隔30分钟注射到大鼠尾静脉中。在最后一个剂量一周后检查大鼠和年龄匹配的野生型对照。一式三份进行分析。

SBC-102治疗的动物的宏观病理学检查证实除了器官大小减小，肝脏颜色也正常化。SBC-102治疗的大鼠显示基本上正常的肝脏组织学，这与泡沫状巨噬细胞在媒介物治疗的动物中的实质性积聚形成明显对照。在LAL^-/-大鼠中升高的血清丙氨酸和天冬氨酸转移酶水平在SBC-102治疗的大鼠中也降低。

测定各大鼠的内部器官和组织的质量，并且数据示于图14中。器官大小表示为在每周施用媒介物或5mg/kg的SBC-102持续4周后，在8周龄时在LAL^-/-大鼠和LAL^+/+大鼠中测定的体重的百分率。

如图15所示，将SBC-102或媒介物治疗的Yoshida大鼠的体重与野生型大鼠相比较。SBC-102(5mg/kg)或媒介物通过IV注射以单次剂量或分开剂量(在4小时的时期内给予)施用至LAL^-/-大鼠。LAL^+/+大鼠是年龄匹配的同窝出生的对照。

实施例13

甘油三酯分析

对来自野生型、纯合安慰剂和纯合SBC-102治疗的动物的肝脏和脾脏组织进行甘油三酯分析。使用标准方法来进行甘油三酯分析(即MBL International的甘油三酯量化试剂盒，目录号：JM-K622-100)，并且以一式三份进行。

表6：野生型和LAL缺乏大鼠的肝脏和脾脏的甘油三酯水平

肝脏底物水平

图16示出在每周施用媒介物或5mg·kg^-1的SBC-102持续4周后在8周龄时在WT和LAL缺乏大鼠中测得的肝脏胆固醇、胆固醇酯以及甘油三酯水平。

实施例14

大鼠剂量反应研究

基于以上进行的研究，在LAL^-/-大鼠中检查LAL(“SBC-102”)的剂量范围和给药方案(qw和qow)的药效学(PD)作用。在这些研究中，SBC-102通过IV注射以0.2、1、3和5mg/kg的剂量qow施用，或者以0.35、1.0和5.0mg/kg qw施用，开始于4周龄持续1个月。结果证实体重(BW)增加改善(图17)、器官巨大症改善(图18)并且组织底物水平改善(图19)。随着SBC-102剂量增加，血清转氨酶水平也降低，在较高剂量下水平基本上达到野生型水平。

实施例15

SBC-102的药物代谢动力学

a.取样

PK样品取自患有迟发性LAL缺乏的成年患者。患者被给予0.35mg/kg，持续2小时。在第0天(剂量1，第2次就诊)和第21天(剂量4，第6次就诊)的血清样品是在临给药前(给药30分钟内)；在输注过程中(DI)在10(±1)、15(±1)、20(±1)、40(±2)、60(±2)和90(±2)分钟和在输注结束(EOI)(自开始输注约120分钟)时；以及在完成输注(AI)后5(±1)、10(±1)、20(±1)、30(±1)、40(±2)、60(±2)以及120(±2)分钟收集。

b血清酶测定

将保持在-20℃冷冻器中的4-MUO(4mM)在黑暗中在4℃冰箱中解冻，并且在使用前置于黑暗中25℃的孵育器中1.5小时。通过稀释SBC-102药品至1.56ng/mL来制备标准品。包括空白测定缓冲液。对于第一次稀释将所有样品稀释至50ng/mL。在制备稀释液后，立即涂铺标准品和样品。在制备标准品和样品后，将62.5μL的测定缓冲液(0.2mol/L乙酸钠三水合物，pH 5.5)添加至各孔中。将12.5μL的标准品和样品加入各孔，一式两份。用4％Triton X-100将4-MUO(4mM)稀释1.6倍，并且每孔添加25μL。将多孔板轻拍数次以进行混合，紧密密封并且置于37℃的孵育器中30分钟。在孵育后，将50μL的停止溶液(0.77M Tris pH 8.0)加入各孔以使最终体积为150μL/孔。将板置于微板读取器上，并且从板的底部在360nm的激发和460nm的发射下测量荧光水平。

如表7-11中所示，施用至患有迟发性LAL缺乏的成年患者的重组LAL的血清C_max在约270ng/mL至720ng/mL范围内。半衰期(t_1/2)在7.6分钟至16.7分钟范围内，并且平均t_1/2为约13分钟(标准偏差，3.812)。

表7

C_max＝369.93ng/mL；t_1/2＝16.8min；LLOQ＝4.68ng/ml

表8

C_max＝262ng/mL；t_1/2＝15.3min；LLOQ＝4.68ng/ml

表9

C_max＝718ng/mL；t_1/2＝10.8min；LLOQ＝4.68ng/ml

表10

C_max＝330ng/mL；t_1/2＝15.3min；LLOQ＝4.68ng/ml

表11

C_max＝379ng/mL；t_1/2＝7.7min；LLOQ＝4.68ng/ml

实施例16

免疫原性分析：抗SBC-102的测量

将各未知的阳性和阴性样品在于1×PBS中的5％奶粉中以1∶20稀释，并且在旋转器(500rpm)上在4℃下孵育12-18小时。在测定之前，将样品以2000×g离心20分钟，并且将上清液移出至新的1.5ml管中。

将SBC-102在1×PBS缓冲液中稀释至浓度为0.5μg/mL，并且将100μL放置在96-孔ELISA板的各孔中。将板用粘性盖覆盖，并且在室温下孵育8小时或在4℃下孵育过夜。在孵育后，将孔用1×洗涤缓冲液洗涤三次。将200μL的游离5％BSA-IgG加入各孔，并且将板密封，并且在4℃下孵育12-18小时或在室温下孵育2小时。在孵育后，将孔用1×洗涤缓冲液洗涤三次。将100μL的各对照样品、未知样品以及阴性样品加入孔中，一式三份。将板在微板振荡器(500rpm)上在室温下孵育1.5小时。在孵育后，将孔用1×洗涤缓冲液洗涤三次。将100μL的在稀释缓冲液中稀释至浓度为100ng/mL的生物素化SBC-102加入各孔中，并且将板在微板振荡器(500rpm)上在室温下孵育1.5小时。在孵育后，将孔用1×洗涤缓冲液洗涤三次。将100μL的在稀释缓冲液中以1∶4000稀释的抗生蛋白链菌素-HRP缀合物加入各孔中。将板在微板振荡器(500rpm)上在室温下孵育1.5小时。在孵育后，将孔用1×洗涤缓冲液洗涤四次。将100μL的TMB底物加入各孔中并且将板在黑暗中孵育15分钟。将50μL的停止溶液(0.5N H₂SO₄)加入各孔中以停止反应。测量在450nm下的OD。

如表12中所列出，每周接受剂量0.35mg/kg的SBC-102持续4周的患者并未展现出抗SBC-102抗体的水平提高，表明SBC-102输注的酶替代疗法没有在人患者中引发任何明显的免疫原性。这些患者并未展现出任何不良事件或输注相关的反应(IRR)。

表12

实施例17

通过施用重组LAL治疗沃尔曼氏病(WD)

在7周龄时，女性患者因为出生后增重困难和发展不良而住院。在初始身体检查时，患者体重3.6kg(出生体重3.7kg)并且消瘦，具有松垂的皮肤褶皱。腹部胀大，具有6cm的硬性肝肿大和约4cm的硬性脾肿大。在腹股沟中注意到增大的***并且肌肉活动性弱。

初始血红蛋白水平为9.2gm，血小板为506,000并且白血球为11,550。尿分析正常，并且骨髓涂片揭示了空泡状淋巴细胞和大量泡沫状细胞。血清化学测量：总脂质834mg/100ml、磷脂176mg/100ml、甘油三酯141mg/100ml、胆固醇129mg/100ml、胆红素0.3mg/100ml、碱性磷酸酶9.0BU％、SGOT 90单位、SGPT 50单位、胆碱酯酶20单位、尿氮8.3mg、空腹血糖45mg/100ml。腹部的CT扫描显示肝脾肿大和钙化的双侧对称增大的肾上腺。

患者外科植入静脉血管接入端口用于给药。在将端口连接至携带式输注机后，用1mg/kg的苯海拉明对患者进行预治疗，20分钟输注重组LAL，以便抵消潜在的过敏性输注反应。然后，通过静脉内输注经5小时的过程将1mg/kg的重组LAL施用给患者。无限期地每7天重复这种治疗一次。

在施用第一次剂量的重组LAL两周内，评估患者的增重，并且如通过超声所测定评估关键腹部器官的大小。还进行了检验患者的溶酶体酸性脂肪酶活性的实验室结果。

实施例18

通过施用重组LAL治疗胆固醇酯贮积病(CESD)

由儿科医生检查患有瘙痒性腹部皮疹的3岁男孩。在腹部检查时，医生注意到肝肿大并且通过超声确认。此时，未作出诊断并且定期监控患者。

在8岁时，他因胃肠炎住院。肝脏活组织检查的光显微术显示肝细胞中胞质内糖原增加并且有小脂质微滴。电子显微镜检查显示膜结合的脂质微滴具有小电子致密颗粒。作出了III型糖原贮积病(脱支贮积病(DeBrancher disease))的工作诊断，但皮肤成纤维细胞脱支活性正常。

在10岁时，肝肿大持续并且进行了第二次肝脏活组织检查。光显微术显示肝实质的小叶结构改变，其中胀大的肝细胞含有细胞质颗粒和伴随轻度门静脉周纤维化的空泡。发现成纤维细胞酸脂肪酶活性为正常的7％，从而确诊了CESD。总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的血浆浓度各自高于年龄和性别的第95个百分位数，分别在7.51、3.24以及5.58mmol/L，而血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)低于第5个百分位数，在0.47mmol/L；他具有混合型高脂质血症(高胆固醇血症、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症以及高β脂蛋白血症)。

患者外科植入静脉血管接入端口用于给药。在将端口连接至携带式输注机后，用5mg/kg的苯海拉明对患者进行预治疗，20分钟输注重组LAL，以便抵消潜在的过敏性输注反应。然后，通过静脉内输注经5小时的过程将5mg/kg的重组LAL施用给患者。无限期地每14天重复这种治疗一次。

***

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Claims

1.一种治疗患有溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺乏的人患者的方法，其包括向所述人患者施用重组人LAL，其中所述施用足以改善所述人患者的肝功能。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述施用足以使肝脏检验正常化。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述施用足以使肝肿大减至最小。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中所述施用足以降低肝脏大小。

5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述施用足以降低血清肝转氨酶水平。

6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中所述施用足以降低脂质水平。

7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中所述施用足以降低甘油三酯水平。

8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中所述施用足以降低胆固醇酯水平。

9.一种增加患有LAL缺乏的人患者的LAL活性的方法，所述方法包括将重组人LAL施用至所述患者，其中所述施用使得所述患者的LAL活性增加。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述施用足以将所述患者的LAL活性增加至少大约35pmol/mg/分钟。

11.一种在需要的患者中治疗LAL缺乏相关的病状的方法，其包括每5天1次至每30天1次向所述患者施用治疗有效量的外源LAL蛋白。

12.一种在需要的患者中治疗LAL缺乏相关的病状的方法，其包括每7天1次至每14天1次向所述患者施用0.1～50mg/kg的剂量的外源LAL蛋白。

13.一种在需要的患者中治疗LAL缺乏相关的病状的方法，其包括向所述患者施用0.1～50mg/kg的剂量的外源LAL蛋白。

14.一种在需要的人患者中治疗沃尔曼氏病或CESD的方法，其包括每5天1次至每30天1次向所述患者施用约0.1～50mg/kg的剂量的外源LAL蛋白。

15.如权利要求11～14中任一项所述的方法，其中所述外源LAL是重组人LAL。

16.如权利要求11～15中任一项所述的方法，其中所述外源LAL包含至少一个甘露糖或至少一个甘露糖-6-磷酸。

17.如权利要求1～12或14～16中任一项所述的方法，其中所述LAL以约0.10～约5.0mg/kg的量施用。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述量是约0.3mg/kg。

19.如权利要求17所述的方法，其中所述量是约0.35mg/kg。

20.如权利要求17所述的方法，其中所述量是约1.0mg/kg。

21.如权利要求17所述的方法，其中所述量是约3.0mg/kg。

22.如权利要求1～21中任一项所述的方法，其中所述施用约每周进行一次。

23.如权利要求1～21中任一项所述的方法，其中所述施用约每两周进行一次。

24.如权利要求1～23中任一项所述的方法，其中所述施用足以将血清天冬氨酸转氨酶(AST)的水平从治疗前水平降低至少50％。

25.如权利要求1～24中任一项所述的方法，其中所述施用足以将血清丙氨酸转氨酶(AST)的水平从治疗前水平降低至少50％。

26.如权利要求1～25中任一项所述的方法，其中所述施用足以使LAL半衰期(t_1/2)少于约17分钟。

27.如权利要求1～26中任一项所述的方法，其中所述施用足以使LAL半衰期(t_1/2)为约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17分钟。

28.如权利要求1～27中任一项所述的方法，其中所述施用足以使C_max为每mL血清至少约200ng。

29.如权利要求1～28中任一项所述的方法，其中所述施用足以使C_max为每mL血清约200ng至每mL血清800ng之间。

30.如权利要求1～29中任一项所述的方法，其中所述LAL被成纤维细胞内化。

31.如权利要求1～30中任一项所述的方法，其中所述LAL被巨噬细胞内化。

32.如权利要求1～31中任一项所述的方法，其中所述LAL由转基因禽类产生。

33.如权利要求1～31中任一项所述的方法，其中所述LAL由哺乳动物细胞系产生。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述哺乳动物细胞系是人细胞系。

35.如权利要求1～34中任一项所述的方法，其中所述施用是静脉内的。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述施用是通过输注的。

37.如权利要求35所述的方法，其中所述输注为约2小时至约4小时。

38.如权利要求36或37所述的方法，其中所述输注的速率是约0.1mg/kg/h至约4mg/kg/h。

39.如权利要求1～38中任一项所述的方法，其中所述施用使对重组人LAL的免疫反应减至最小。

40.如权利要求1～39中任一项所述的方法，其中所述施用减轻***病。

41.如权利要求1～40中任一项所述的方法，其中所述施用足以降低血清铁蛋白水平。

42.如权利要求1～41中任一项所述的方法，其中所述施用足以增加血清血红蛋白水平。

43.如权利要求1～42中任一项所述的方法，其中所述施用足以增加儿童患者的生长

44.如权利要求1～43中任一项所述的方法，其中所述施用足以增加体重增加的速率。

45.如权利要求1～44中任一项所述的方法，其中施用后所述患者的生长速率为施用前所述患者的生长速率的至少约2倍。

46.如权利要求1～45中任一项所述的方法，其中所述施用足以增加脂肪组织。

47.如权利要求1～46中任一项所述的方法，其中所述患者小于1岁。

48.如权利要求1～46中任一项所述的方法，其中所述患者至少1岁。

49.如权利要求1～48中任一项所述的方法，其中所述患者已被诊断为沃尔曼氏病。

50.如权利要求1～49中任一项所述的方法，其中所述患者已被诊断为胆固醇酯贮积病(CESD)。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述CESD是在10岁前被诊断的。

52.如权利要求1～51中任一项所述的方法，其进一步包括施用第二治疗剂。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述第二治疗剂是降胆固醇药物。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述第二治疗剂是斯达汀。

55.如权利要求53所述的方法，其中所述第二治疗剂是依泽替米贝。

56.如权利要求52所述的方法，其中所述第二治疗剂减少LAL的免疫原性。

57.如权利要求52所述的方法，其中所述第二治疗剂是抗组胺剂。

58.如权利要求52所述的方法，其中所述第二治疗剂是免疫抑制剂。

59.如权利要求57所述的方法，其中所述抗组胺剂是在LAL施用之前施用的药物有效剂量的苯海拉明。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述苯海拉明的剂量为约1～约5mg/kg。

61.如权利要求59或60所述的方法，其中所述苯海拉明在施用LAL之前约20～约90分钟施用。

62.如权利要求1～61中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括完成评价以监控患者的临床和病理学表现。

63.如权利要求62所述的方法，其中所述评价为：脂质分析、胸部X-射线、肝功能检验、粪便分类检查、血浆甲羟戊酸分析、免疫原性检验、血浆溶酶体酸性脂肪酶分析、壳三糖苷酶分析、门脉高血压分析、人体测量、肝或脾的分析、胃肠道成像、或它们的组合。

64.如权利要求63所述的方法，其中所述成像技术是超声波、核磁共振成像或核磁共振光谱法。

65.一种组合物，用于根据权利要求1～64中任一项所述的方法施用LAL。