CN103191791B - 生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片***及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片***及应用。该芯片***包括主体微流控芯片、微管、样品液微泵、交换液微泵、第一废液收集装置、第二废液收集装置、第三废液收集装置、激光发射装置、光电转换装置、光纤和计算机，在主体微流控芯片上包含不对称弯流道、第一分支通道、第二分支通道、第三分支通道、主流道、支路通道、对准标记等。本发明利用不对称弯流道实现粒子的预聚焦和分选，利用换液流道实现待测粒子承载液的交换以及粒子清洗，利用粘弹性流体的弹性及惯性效应实现粒子的截面中心聚焦。本发明无需鞘液，具有高速、高精度、微型化、自动化、低成本、制作工艺简单及易于批量生产等优点。

Description

生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片***及应用

技术领域

本发明涉及微流操控和检测领域，具体涉及的是生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片***及应用。该芯片***主要包含多通道流体操控模块，光学检测模块，信号处理模块等。

背景技术

微流控技术是一项集成复杂实验室功能，通过操控微体积流体，实现样品制备、反应、聚焦、分选及检测等功能的微芯片技术。而基于微流控技术实现微米级生物粒子分选与计数是生物医学、环境监测、分析化学等领域研究的重要内容。高效的粒子预聚焦和尺寸提纯技术是实现高精度计数的前提，常见的聚焦分选技术主要可分为基于磁场、电场、声场等外场的聚焦分选技术以及利用鞘液夹流的聚焦分选技术等。前者需附加设备提供外场，存在耗能大，不利于集成微型化且易损伤生物样本等不足。后者需多股鞘液，存在控制和操作复杂等问题。在生物微粒计数检测方法方面，目前主要有传统人工计数、基于Coulter原理的电检测、基于光学原理的检测。显然传统的人工技术在精度、智能化、微型化等方面已无法满足现代化实验室的高效样品处理需求，而Coulter技术则存在易损伤生物粒子活性，检测精度不高等问题。基于二维聚焦的光学检测技术，由于在第三维度上粒子存在一定的重叠概率，造成计数结果存在较大误差。近期已有研究利用两次鞘液实现粒子的三维聚焦以避免粒子的重叠，但使用两次鞘液夹流操作较复杂。同时，由于多数微流控芯片流速较低（雷诺数一般为10^-6～10¹)且受到计数检测设备的限制，使得现有的基于微流控技术的生物粒子计数检测通量都非常低（一般为几个至几百个每秒）。另外，对生物粒子计数检测前，往往需要对样品进行过滤、离心、清洗等复杂前处理操作，所需设备复杂、体积大且操作较为繁琐。

因此，如能提出生物粒子快速高精度分选、清洗、计数的自动化、集成化、微型化装置必将在一定程度上克服上述局限。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供生物微粒高通量分选和计数检测的多通道集成芯片***。单层基片上借助弯流道中微流体惯性效应来实现微米级生物粒子分选及聚焦，通过层流效应及惯性升力来实现粒子清洗和承载液交换，利用粘弹性流中的弹性力及惯性升力实现生物粒子的流道中心区域单平衡位置精确聚焦，最后基于光学检测和信号处理技术对检测到的光电信号进行识别，实现生物粒子的高精度计数并获取生物粒子的多种特征参数。同时，借助多层基片的堆叠实现通量的进一步提升。以上技术手段在一定程度上克服了目前微流控分选与计数检测技术通量低、精度低、外场耗能、自动与集成化程度低等局限。

技术方案：针对目前生物粒子分选、计数器件研究及应用中存在的不足和局限，本发明的生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片***，包括主体微流控芯片、微管、样品液微泵、交换液微泵、第一废液收集装置、第二废液收集装置、第三废液收集装置、激光发射装置、光电转换装置、计算机和光纤，主体微流控芯片上连接有微管、样品液微泵、交换液微泵、第一废液收集装置、第二废液收集装置、第三废液收集装置、激光发射装置、光电转换装置、光纤；

所述主体微流控芯片包含有不对称弯流道、第一分支通道、第二分支通道、第三分支通道、主流道、支路通道、出入口连接孔、样品入口、交换液入口、预分选干扰粒子出口、被替换承载液出口、废液出口、激发光光纤通道、前向角散射光纤通道、侧向角散射光纤通道和荧光光纤通道和对准标记；

所述主体微流控芯片由多个单层基片堆叠键合而成；

每层基片布局完全一样，所述样品入口、交换液入口、预分选干扰粒子出口、被替换承载液出口、废液出口上均设有出入口连接孔，所述样品液微泵与微管一端相连通，微管另一端与样品入口上的出入口连接孔相连，样品入口与不对称弯流道相连通，不对称弯流道分出第一分支通道和第二分支通道，第一分支通道与预分选干扰粒子出口相连通，预分选干扰粒子出口上的出入口连接孔与第一废液收集装置相连通，第二分支通道和第三分支通道一端交汇于主流道，所述第三分支通道另一端与交换液入口相连通，交换液入口上的出入口连接孔与交换液微泵相连通，所述主流道上依次设有换液流道、截面中心聚焦直流道、光学检测区域，所述主流道末端与废液出口相连通，废液出口上的出入口连接孔与第二废液收集装置连接，所述换液流道分出一个支路通道，所述支路通道与被替换承载液出口相连通，被替换承载液出口上的出入口连接孔与第三废液收集装置相连接，所述激光发射装置通过光纤与激发光光纤通道连接，所述光电转换装置通过光纤分别与前向角散射光纤通道、侧向角散射光纤通道和荧光光纤通道相连接，所述光电转换装置通过光纤与计算机相连接，所述激发光光纤通道和前向角散射光纤通道分别位于主流道两侧，激发光光纤通道垂直于主流道，前向角散射光纤通道与激发光光纤通道延长线的夹角为0.5°～6°，所述侧向角散射光纤通道和荧光光纤通道分别位于主流道的两侧，所述侧向角散射光纤通道与激发光光纤通道成95°～120°，所述荧光光纤通道分别与激发光光纤通道成60°～85°的角度，所述对准标记有多个，分别位于所述单层基片的四个角。

所述换液流道截面为矩形。

所述换液流道中的交换液体积流量大于样品液体积流量，截面中心聚焦直流道宽度大于支路通道，且交换液体积流量/样品液体积流量大于截面中心聚焦直流道宽度/支路通道。

所述主体微流控芯片为多层完全一致的基片堆叠键合而成。

所述主体微流控芯片其基片所用材质为聚二甲基硅氧烷、玻璃、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯中的一种。

所述光学检测区域四周集成有激发光光纤通道、前向角散射光纤通道、侧向角散射光纤通道、荧光光纤通道，激发光光纤及检测光纤均***通道固定集成在芯片上，从侧面发射激发光及接收检测光信号。

所述不对称弯流道、主流道、第一分支通道、第二分支通道、第三分支通道、支路通道、激发光光纤通道、前向角散射光纤通道、侧向角散射光纤通道及荧光光纤通道的高度相等。所述光电转换装置将检测到的光信号转换为数字信号并输入计算机利用相应软件进行相关数据的分析处理。其中，光电转换装置的工作原理如下：所述光电转换装置利用集成于其中的滤光片检测到光信号，同时将虑过的光信号转换为电信号并经集成于光电转换装置中的模数装换，将电信号转换为数字信号输入计算机。所述电转换装置包括滤光器、模数转换器、以及光电二极管、光电倍增管等。

所述生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片***在生物粒子分选与计数检测中的应用。

本发明中提出的主体微流控芯片为多层集成的复合结构，主体芯片所用材质可为聚二甲基硅氧烷（PDMS），PDMS具有很好的光学性能和机械性能，满足光学检测要求，不对生物样本造成损伤，且价格低廉配合成熟的模塑法适于批量生产。此外，主体微流控芯片还可选用玻璃、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚碳酸酯（PC）等材料制作。不同材料对应的加工工艺可能不同，可根据加工条件及应用对象选择芯片材质。本发明采用无掩模光刻技术制作所需微结构阳模并利用模塑法复制相应结构的PDMS基片。每层基片具有完全一致的尺寸和结构，可利用同一阳模进行批量复制。

每层基片上均设置微结构对准标记，利用体式镜进行精确堆叠操作，并利用紫外/臭氧处理或氧等离子体处理技术实现各层基片间的不可逆键合，进而完成多层结构的复合。

单层基片包含两个进口，其中生物粒子悬浮液经微泵驱动由入口注入不对称弯流道，借助微流体惯性效应（惯性迁移和截面二次流）实现粒子的预聚焦及尺寸分选，待测粒子继续在芯片内运动，而干扰测粒子则从芯片出口流至废液收集装置。芯片另一入口通入PVP、PEO、PSB等具有粘弹性特性且光学性质良好的洁净交换液。

交换液体积流量需明显大于样品液，交换液与待替换粒子悬浮液交汇于换液流道。由于两种液体流速不同，使得交换液流束宽度大于待替换粒子悬浮液流束宽度，粒子在惯性升力作用下，迁移至换液流道中心，处于交换液内。经足够长距离后得到粘弹性粒子悬浮液和不含待测粒子的废液。两种流体经过分岔结构后，废液通过芯片出口流至废液收集装置，而粘弹性粒子悬浮液则继续沿直流道流动。利用本换液流道实现待测粒子自动清洗，消除了待测粒子悬浮液中杂质（例如血红蛋白、红细胞碎片及其他小尺寸干扰细胞等）。通过微流体惯性效应及粘弹性效应实现待测粒子聚焦于流道截面几何中心位置并进入光学检测计数区域。经光学检测后，最终从出口流至废液收集装置。在光学检测环节有四个光纤通道，光纤水平***这些通道，用于发射激光及接收光信号。其中激发光光纤通道垂直于主流道，在激发光光纤通道同侧的光纤通道为荧光光纤通道，而另一侧则分别为前向角散射光纤通道及侧向散射光光纤通道。射入光纤的光学信号经过光电转换装置转换为数字信号，并通过相应识别程序得到待测粒子数量和多项生物粒子检测参数。所有基片共用相同的出入口连接孔，即无论基片层数多少，芯片出入口连接孔数量不变。

本发明提出的多层、多通道集成设计，大幅提高了生物粒子分选、计数效率，与传统的流式细胞计数检测技术相比，多层基片的堆叠以及不对称弯流道惯性预聚焦环节、粘弹性流体粒子清洗和换液环节、粘弹性与惯性效应单平衡位置聚焦环节、光学检测环节的集成应用很好地实现了高通量、高精度的生物粒子分选与计数检测。

有益效果：本发明提出的集成化高效粒子分选计数、检测芯片***，单层基片上巧妙利用不对称弯流道中微流体的惯性效应实现粒子的聚焦与分选，然后利用直流道中惯性迁移实现粒子清洗和换液，再则利用粘弹性和惯性效应实现粒子在流道中心区域的单平衡位置精确聚焦，同时集成光纤通道便于与光学器件封装拼接。与其他粒子计数检测计数相比，该芯片***具有成本低、操作简单、无需鞘液、精度高以及自动化、集成化程度高等优点。另外，本发明中主体微流控芯片采用多层基片堆叠，实现粒子的高通量、快速、微型化计数检测。本发明提出的芯片***和方法可广泛用于生物学、临床诊断、环境监测及生化分析等领域。

附图说明

图1本发明实施例1中集成芯片***示意图。

图2本发明实施例1中非底层基片示意图，即A-A剖面结构示意图。

图3本发明实施例7中换液流道粒子承载液交换原理图。

图4A本发明实施例8中截面中心聚焦直流道粒子单平衡位置聚焦原理侧视图。

图4B为本发明实施例8中截面中心聚焦直流道粒子单平衡位置聚焦流道B-B截面图。

图4C为本发明实施例8中截面中心聚焦直流道粒子单平衡位置聚焦流道C-C截面图。

图5本发明实施例8中光学检测区域粒子光学特性检测原理图。

具体实施方式

本发明提出的生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片***，其实施例如图1所示。非底层基片示意图，即A-A剖面结构示意图如图2所示。本发明所能够使用的芯片材质、制作工艺、基片层数、微结构尺寸、光纤规格、光学检测器、信号处理方法及芯片***的应用对象不局限于本实施例。

实施例1：

如图1和图2所示，生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片***，包括主体微流控芯片10、微管17、样品液微泵11、交换液微泵18、第一废液收集装置12、第二废液收集装置19、第三废液收集装置20、激光发射装置13、光电转换装置14、计算机15和光纤16，主体微流控芯片10上连接有微管17、样品液微泵11、交换液微泵18、第一废液收集装置12、第二废液收集装置19、第三废液收集装置20、激光发射装置13、光电转换装置14、光纤16；

所述主体微流控芯片10包含有不对称弯流道23、第一分支通道285、第二分支通道286、第三分支通道287、主流道288、支路通道289、出入口连接孔201、样品入口21、交换液入口22、预分选干扰粒子出口24、被替换承载液出口26、废液出口29、激发光光纤通道281、前向角散射光纤通道282、侧向角散射光纤通道283和荧光光纤通道284和对准标记202；

所述主体微流控芯片10由多个单层基片101,102,103堆叠键合而成；

每层单层基片101,102,103布局完全一样，所述样品入口21、交换液入口22、预分选干扰粒子出口24、被替换承载液出口26、废液出口29上均设有出入口连接孔201，所述样品液微泵11与微管17一端相连通，微管17另一端与样品入口21上的出入口连接孔201相连，样品入口21与不对称弯流道23相连通，不对称弯流道23分出第一分支通道285和第二分支通道286，第一分支通道285与预分选干扰粒子出口24相连通，预分选干扰粒子出口24上的出入口连接孔201与第一废液收集装置12相连通，第二分支通道286和第三分支通道287一端交汇于主流道288，所述第三分支通道287另一端与交换液入口22相连通，交换液入口22上的出入口连接孔201与交换液微泵18相连通，所述主流道288上依次设有换液流道25、截面中心聚焦直流道27、光学检测区域28，所述主流道288末端与废液出口29相连通，废液出口29上的出入口连接孔201与第二废液收集装置19连接，所述换液流道25分出一个支路通道289，所述支路通道289与被替换承载液出口26相连通，被替换承载液出口26上的出入口连接孔201与第三废液收集装置20相连接，所述激光发射装置13通过光纤与激发光光纤通道281连接，所述光电转换装置14通过光纤分别与前向角散射光纤通道282、侧向角散射光纤通道283和荧光光纤通道284相连接，所述光电转换装置14通过光纤16与计算机15相连接，所述激发光光纤通道281和前向角散射光纤通道282分别位于主流道288两侧，激发光光纤通道281垂直于主流道288，前向角散射光纤通道282与激发光光纤通道281延长线的夹角为0.5°，所述侧向角散射光纤通道283和荧光光纤通道284分别位于主流道288的两侧，所述侧向角散射光纤通道283与激发光光纤通道281成120°的角度，所述荧光光纤通道284分别与激发光光纤通道281成60°的角度，所述对准标记202有多个，分别位于所述单层基片101,102,103的四个角。

所述换液流道25截面为矩形。

所述换液流道25中的交换液体积流量大于样品液体积流量，截面中心聚焦直流道27宽度大于支路通道289，且交换液体积流量/样品液体积流量大于截面中心聚焦直流道27宽度/支路通道289。

所述主体微流控芯片10为多层完全一致的基片堆叠键合而成。

所述主体微流控芯片10其基片所用材质为聚二甲基硅氧烷、玻璃、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯中的一种。

在光学检测区域28四周集成有激发光光纤通道281、前向角散射光纤通道282、侧向角散射光纤通道283、荧光光纤通道284，激发光光纤及检测光纤均***通道固定集成在芯片上，从侧面发射激发光及接收检测光信号。

所述不对称弯流道23、主流道288、第一分支通道285、第二分支通道286、第三分支通道287、支路通道289、激发光光纤通道281、前向角散射光纤通道282、侧向角散射光纤通道283及荧光光纤通道284的高度相等。

所述光电转换装置14将检测到的光信号转换为数字信号并输入计算机15利用相应软件进行相关数据的分析处理。其中，所述光电转换装置14包括滤光器、模数转换器、以及光电二极管、光电倍增管等。

本实施例以一种基于粘弹性及惯性效应的多层结构生物微粒快速、高精度分选和计数检测芯片为例来阐述本发明中提出的方法、器件制作、***构建及计数检测原理。本实施例中主体微流控芯片非底层基片的材质选用聚二甲基硅氧烷（PDMS）。当然，还可选用玻璃、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚碳酸酯（PC）等光学性能良好的材料制作。不同材料对应的芯片加工工艺、键合技术可能存在差异，可根据加工条件及应用需求来选择相应材料。本实施例中利用无掩模光刻工艺制作SU-8阳模，并采用模塑法制作单层PDMS基片。该制作工艺具有成本低、制作周期短、适于批量生产等优点。当然结合实际应用需求及加工条件还可考虑采用有掩模光刻、超精密机加工等技术来制作阳模，甚至可通过其他加工手段直接完成基片制作。

实施例2：

与实施例1基本一样，所不同的是，前向角散射光纤通道282与激发光光纤通道281延长线的夹角为6°，所述侧向角散射光纤通道283和荧光光纤通道284分别位于主流道288的两侧，侧向角散射光纤通道283与激发光光纤通道281成110°的角度，荧光光纤通道284与激发光光纤通道281成70°的角度，所述主体微流控芯片10其基片所用材质为环氧树脂。

实施例3：

与实施例1基本一样，所不同的是，前向角散射光纤通道282与激发光光纤通道281延长线的夹角为3°，所述侧向角散射光纤通道283和荧光光纤通道284分别位于主流道288的两侧，侧向角散射光纤通道283与激发光光纤通道281成100°的角度，荧光光纤通道284与激发光光纤通道281成80°的角度，所述主体微流控芯片10其基片所用材质为甲基丙烯酸甲酯。

实施例4：

与实施例1基本一样，所不同的是，前向角散射光纤通道282与激发光光纤通道281延长线的夹角为3.5°，所述侧向角散射光纤通道283和荧光光纤通道284分别位于主流道288的两侧,侧向角散射光纤通道283与激发光光纤通道281成105°的角度，荧光光纤通道284与激发光光纤通道281成75°的角度，所述主体微流控芯片10其基片所用材质为聚碳酸酯。

实施例5：

与实施例1基本一样，所不同的是，前向角散射光纤通道282与激发光光纤通道281延长线的夹角为4.5°，所述侧向角散射光纤通道283和荧光光纤通道284分别位于主流道288的两侧，侧向角散射光纤通道283与激发光光纤通道281成95°的角度，荧光光纤通道284与激发光光纤通道281成85°的角度，所述主体微流控芯片10其基片所用材质为玻璃。

实施例6：

PDMS基片制作的具体工艺流程如下：首先，利用CAD软件绘制芯片流道图并将其导入无掩模光刻设备。在经过清洗、脱水等预处理的硅片上旋涂特定厚度的SU-8光刻胶，并将旋涂后的SU-8硅基片置于热板上逐步升温加热进行前烘。然后，将前烘完的SU-8硅基片置于无掩模光刻设备进行曝光处理，完成曝光的基片还需再一次曝后烘加热才能进行显影。最后，将显影得到的阳模进行硬烘加热以提高保留微结构的机械强度，这样就完成了SU-8阳模的制作。基于SU-8阳模和模塑法，经过PDMS配比、搅拌、倒模、真空脱气、PDMS固化、脱模等具体工艺步骤，最终得到所需的单层PDMS基片。

实施例7：

换液流道粒子承载液交换过程及原理：

被样品液微泵11增压的样品液经微管17从样品入口21进入不对称弯流道23。满足a_P≥0.07D_h（其中a_P为粒子直径，D_h为流道水力直径）的粒子在惯性升力（包含剪切诱导惯性升力及壁面诱导惯性升力）和截面二次流诱导的迪恩拽力的共同作用下聚焦于平衡位置且粒径越大聚焦位置越靠近内壁面，而粒径小于0.07D_h的粒子则无法聚焦且粒径越小越靠近外壁面。本实施例中待测粒子为粒径大于0.07D_h的靠近外壁面的较小粒子，靠近内壁面的较大粒子通过预分选干扰粒子出口24由支路引出并经微管17导入废液收集装置12，靠近内壁面较小粒子则继续在芯片内流动与由交换液入口22进入芯片的交换液252一起流至换液流道25。利用样品液微泵11和换液微泵18控制两种液体的体积流量使得交换液252体积流量明显大于样品液。当然，可以增加不对称弯流道23末端分岔支路个数实现多种尺寸粒子分选并将待测粒子253所在支路引入换液流道25。待替换粒子悬浮液251与交换液252交汇的夹角不宜过大且两者流速不能过高，以保证两股流体呈层流状态。图3为本发明实施例中换液流道粒子承载液交换原理图。进入换液流道25后，由于流道变宽引起宽度方向上剪切率梯度减小，从而导致待测粒子253受到的剪切诱导惯性升力255减小，小于壁面诱导惯性升力254，引起待测粒子253向流道中心方向移动。同时，交换液252体积流量大于待替换粒子悬浮液251体积流量，使得前者层流宽度大于后者，粒子聚焦平衡时处于交换液252流束中，形成新的粘弹性粒子悬浮液257。而被替换承载液256流束中已不含待测粒子，通过被替换承载液出口26流至废液收集装置12，从而实现了粒子承载液的更新交换，新的粒子悬浮液不含干扰杂质，即达到粒子自动清洗的目的。

实施例8：

截面中心聚焦直流道粒子单平衡位置聚焦过程及光学特性检测过程：

新的粒子承载液为粘弹性溶液，随该溶液流动的粒子在惯性效应及弹性效应的共同作用下聚焦于流道中心位置，如图4A、4B、4C所示，图4A为流道侧视图，图4B和图4C分别为流道B-B与C-C截面图。B处粒子聚焦于流道上下两面中心附近，在粘弹性效应作用下粒子受到指向截面中心的弹性力271，同时粒子在惯性效应作用下还受到壁面诱导惯性升力254与剪切诱导惯性升力255。在这些力的共同作用下，粒子最终聚焦于截面中心位置。待测粒子束大小将影响计数检测精度，而本发明同时利用了惯性效应及粘弹性效应使得粒子束大小非常接近待测粒子，有效避免被测粒子55重叠，大大提高了计数检测的精度。激发光光纤通道281垂直于主流道，激发光发射装置13所发出的激发光经***激发光光纤通道281的光纤射向被测粒子55，被测粒子55受激发，在与入射光51成0.5°～6°的夹角范围内产生前向角散射光52，前向角散射光纤通道282与激发光光纤通道281延长线的夹角可取0.5°～6°，但激发光光纤通道281与前向角散射光纤通道282不能在同一直线上，否则激发光将与前向角散射光一起射入前向角散射光纤，干扰前向角散射光检测。所述侧向角散射光纤通道283和荧光光纤通道284分别位于主流道288的两侧，所述侧向角散射光纤通道283与激发光光纤通道281成95°～120°，所述荧光光纤通道284分别与激发光光纤通道281成60°～85°的角度，光纤检测区域原理如图5所示。光纤通道高度与光纤外径大小相等，保证光纤中心与流道截面中心即被测粒子55在同一直线上，这样发射光能够精确的射中被测粒子55，而被测粒子55所发出的散射光及荧光能够精确的射入信号检测光纤。前向角散射光52信号反映细胞体积大小，前向角散射光52强，则细胞体积越大，反之细胞体积小。侧向角散射光53信号可提供细胞内精细结构及颗粒性质的信息。荧光54强度与细胞内DNA、RNA和蛋白质含量成正比，通过荧光54信号检测可以判定细胞内这些组分含量、抗原及酶活性（荧光信号的产生主要有两种，一种是标记在细胞上的荧光物质受激发而产生的，另一种是细胞自身受激发而产生）。经过光学检测区域28后粘弹性粒子悬浮液257直接经废液出口29流至废液收集装置12。同时，为增加芯片通量以提高***计数检测速度，本实施例采用多个单层基片101,102,103堆叠，所有基片共用出入口连接孔201。利用紫外/臭氧键合技术实现基片间的不可逆键合同时通过基片上的“+”对准标记202配合体视镜或其它校准辅助设备实现基片间的精确堆叠。键合最底层基片103前先将已经完成键合的多个单层基片101,102出入口用打孔装置打孔，得到出入口连接孔201，最后完成与最底层的单层基片103的键合。在芯片光纤通道上***相应光纤16，光纤16外径与光纤通道尺寸对应，以保证光纤16固定在芯片上。另外，为避免不同层基片间光信号的相互干扰，所选用的光纤数值孔径不能过大，同时光纤通道不能离光学检测区域28过远且单层基片厚度不能过小（单层基片厚度太小还会造成流道结构易变形）。芯片的光纤16总数为4倍基片数量（不包含没有流道的最底层的基片103。前向角散射光52信号较强，可利用光电二极管将该光信号转换为电信号，而荧光54信号较弱，需通过光电倍增管（PMP）实现光电转化，侧向角散射光53根据需求选择光电二极管或光电倍增管。传入计算机15的检测信号经过相关软件分析处理得到粒子数量、DNA含量以及表面抗原等参数。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片***，其特征在于：包括主体微流控芯片（10）、微管（17）、样品液微泵（11）、交换液微泵（18）、第一废液收集装置（12）、第二废液收集装置（19）、第三废液收集装置（20）、激光发射装置（13）、光电转换装置（14）、计算机（15）和光纤（16），主体微流控芯片（10）上连接有微管（17）、样品液微泵（11）、交换液微泵（18）、第一废液收集装置（12）、第二废液收集装置（19）、第三废液收集装置（20）、激光发射装置（13）、光电转换装置（14）、光纤（16）；

所述主体微流控芯片（10）包含有不对称弯流道（23）、第一分支通道（285）、第二分支通道（286）、第三分支通道（287）、主流道（288）、支路通道（289）、出入口连接孔（201）、样品入口（21）、交换液入口（22）、预分选干扰粒子出口（24）、被替换承载液出口（26）、废液出口（29）、激发光光纤通道（281）、前向角散射光纤通道（282）、侧向角散射光纤通道（283）和荧光光纤通道（284）和对准标记（202）；

所述主体微流控芯片（10）由多个单层基片（101,102,103）堆叠键合而成；

每层单层基片（101,102,103）布局完全一样，所述样品入口（21）、交换液入口（22）、预分选干扰粒子出口（24）、被替换承载液出口（26）、废液出口（29）上均设有出入口连接孔（201），所述样品液微泵（11）与微管（17）一端相连通，微管（17）另一端与样品入口（21）上的出入口连接孔（201）相连，样品入口（21）与不对称弯流道（23）相连通，不对称弯流道（23）分出第一分支通道（285）和第二分支通道（286），第一分支通道（285）与预分选干扰粒子出口（24）相连通，预分选干扰粒子出口（24）上的出入口连接孔（201）与第一废液收集装置（12）相连通，第二分支通道（286）和第三分支通道（287）一端交汇于主流道（288），所述第三分支通道（287）另一端与交换液入口（22）相连通，交换液入口（22）上的出入口连接孔（201）与交换液微泵（18）相连通，所述主流道（288）上依次设有换液流道（25）、截面中心聚焦直流道（27）、光学检测区域（28），所述主流道（288）末端与废液出口（29）相连通，废液出口（29）上的出入口连接孔（201）与第二废液收集装置（19）连接，所述换液流道（25）分出一个支路通道（289），所述支路通道（289）与被替换承载液出口（26）相连通，被替换承载液出口（26）上的出入口连接孔（201）与第三废液收集装置（20）相连接，所述激光发射装置（13）通过光纤与激发光光纤通道（281）连接，所述光电转换装置（14）通过光纤分别与前向角散射光纤通道（282）、侧向角散射光纤通道（283）和荧光光纤通道（284）相连接，所述光电转换装置（14）通过光纤（16）与计算机（15）相连接，所述激发光光纤通道（281）和前向角散射光纤通道（282）分别位于主流道（288）两侧，激发光光纤通道（281）垂直于主流道（288），前向角散射光纤通道（282）与激发光光纤通道（281）延长线的夹角为0.5°～6°，所述侧向角散射光纤通道（283）和荧光光纤通道（284）分别位于主流道（288）的两侧，所述侧向角散射光纤通道（283）与激发光光纤通道（281）成95°～120°，所述荧光光纤通道（284）分别与激发光光纤通道（281）成60°～85°的角度，所述对准标记（202）有多个，分别位于所述单层基片（101,102,103）的四个角。

2.如权利要求1所述的生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片***，其特征在于：所述换液流道（25）截面为矩形。

3.如权利要求1所述的生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片*** ，其特征在于：所述换液流道（25）中的交换液体积流量大于样品液体积流量，截面中心聚焦直流道（27）宽度大于支路通道宽度（289），且交换液体积流量/样品液体积流量大于截面中心聚焦直流道（27）宽度/支路通道宽度（289）。

4.如权利要求1所述的生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片***，其特征在于：所述主体微流控芯片（10）为多层完全一致的基片堆叠键合而成。

5.如权利要求1所述的生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片***，其特征在于：所述主体微流控芯片（10）其基片所用材质为聚二甲基硅氧烷、玻璃、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯中的一种。

6.如权利要求1所述的生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片***，其特征在于：在光学检测区域（28）四周集成有激发光光纤通道（281）、前向角散射光纤通道（282）、侧向角散射光纤通道（283）、荧光光纤通道（284），激发光光纤及检测光纤均***通道固定集成在芯片上，从侧面发射激发光及接收检测光信号。

7.如权利要求1所述的生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片***，其特征在于：所述不对称弯流道（23）、主流道（288）、第一分支通道（285）、第二分支通道（286）、第三分支通道（287）、支路通道（289）、激发光光纤通道（281）、前向角散射光纤通道（282）、侧向角散射光纤通道（283）及荧光光纤通道（284）的高度相等。

8.如权利要求1所述的生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片***，其特征在于：所述光电转换装置（14）将检测到的光信号转换为数字信号并输入计算机（15）利用相应软件进行相关数据的分析处理。

9.权利要求1-8任一项所述的生物微粒高通量分选和计数检测的集成芯片***在生物粒子分选与计数检测中的应用。