CN103185802A - 多相微流控免疫印迹芯片及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种多相微流控免疫印迹芯片及其制备方法和用途，所述芯片包括固定有分离的蛋白质条带的基底和片体，所述片体的一个表面上设有至少一个微流凹槽，所述微流凹槽与所述聚合物膜共同形成供抗体流通的至少一个微流通道，所述片体的另一个表面上在对应于所述微流通道的两个端口的位置处分别设有穿孔以形成所述微流通道的通道入口和通道出口；所述芯片的制备方法包括以下步骤：制备固定有分离的蛋白质条带的基底；制备设有至少一个微流凹槽的片体；组装制备的基底和片体；用途为其在蛋白质检测或在用于制备蛋白质检测的试剂盒中的应用。本发明单次免疫印迹反应可确定多个目标蛋白质的存在，检测灵敏度高，操作简单，提高检测效率，降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种芯片，尤其涉及一种多相微流控免疫印迹芯片及其制备方法和用途，属于生物技术和组织工程领域。
背景技术
微流控(Microfluidics)是一种利用微米级别的小型管道、结构对微升量级的微量流体进行精细控制的分析技术，相应的技术载体即微流控芯片。它以微电子工艺衍生出来的软蚀刻技术为依托，通过在芯片上集成微通道、微反应室等微小元件来构建微流路***，加载生物样品或化学反应液，以压力泵或电渗流作为动力形成微流路，从而在芯片上进行一种或多种精细的操作或反应，达到生物检测、化学合成或细胞生长等多种目的。
免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是Towbin等人于1979年发明的一种借助特异性抗体鉴定抗原信息的有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫生化技术。将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)等分离后，然后通过电流引导的转移技术，原位转印至硝酸纤维素膜，或聚偏氟乙烯膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。例如，将经SDS-PAGE分离的蛋白质带转移到膜上后，膜用封闭液处理，然后与第一抗体反应，膜经漂洗后再与酶标记或荧光素标记的二抗，即可显示出目标蛋白的位置。
现有的免疫印迹存在的问题是：(1)一次实验只能检测生物样品中一种蛋白质的表达情况。不能满足现在生物学研究中需要同时对细胞或组织中多种蛋白进行检测的目的。(2)一次免疫印迹实验需要的抗体溶液较多(几百微升至几毫升)，而抗体价格昂贵，使免疫印迹实验成本较高。
为了让一次实验能够检测多种蛋白，现有的技术有多色荧光素标记二抗法、多色量子点标记二抗法(Bakalova.R.；Zhelev，Z.；Ohba，H.；Baba Y J.Am.Chem.Soc.2005，27，9328-9329.)，表面增强拉曼免疫印迹法(Han.X.X.；Jia，H.Y；Wang，Y.F.；Lu，Z.C.；Wang，C.X.；Xu，W.Q.；Zhao，B.；Ozaki，Y.Anal.Chem.2008，80，2799-2804.)。但是，多色荧光素标记和多色量子点标记法能检测的蛋白数目受到限制，因为不同标记的物质(荧光素或量子点)的激发光和发射光的波长区间会有重叠，现在报道的蛋白检测数目大多在5种以下。表面增强拉曼免疫印迹法的缺陷在于，在检测多种蛋白质的混合物时，光谱谱图复杂而难以辨别。
现在也有一些报道利用微流控技术来检测电泳形成的多种蛋白，例如将整个电泳，转移的过程集中到一个微小的通道中(He，M.，Herr，A.E.，Nat.Prot.2010，5，1844-1856)，但是这种技术的问题是不能提供目标蛋白质分子量的信息，而且读出手段比较复杂，难以为一般的生物实验室采用；又如，我们之前发明了一种***，利用平行的微流通道来引入抗体检测目标蛋白(Pan，W.Y.；Chen，W.；Jiang，X.Y.；Anal.Chem.2010，82，3974-3976)，可以解决上面的问题，但是这种方法一次只能处理一个样品，显然不能满足生物学实验中需要同时处理很多样品的需求。
发明内容
因此，本发明的目的是，针对目前微流控蛋白检测一次只能处理一个样品的不足，以及生物学实验中要同时处理大量样品的需求，发明设计一种多相微流控免疫印迹芯片，以期达到能够通过微流控技术高通量地进行蛋白检测。
针对上述目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种多相微流控免疫印迹芯片，包括固定有分离的蛋白质条带的基底和与其叠置的片体，所述片体与基底相叠置的表面上设有至少一个微流凹槽，所述微流凹槽与所述基底共同形成供流体流通的至少一个微流通道，所述片体的另一个表面上在对应于所述微流通道的两个端口的位置处分别设有穿孔以形成所述微流通道的通道入口和通道出口。
优选地，所述至少一个微流凹槽包括多个平行分布的第一凹槽，所述多个平行分布的第一凹槽的端部通过第二凹槽依次连接，所述多个平行分布的第一凹槽与基底上的蛋白质条带相垂直。
优选地，所述多个平行分布的第一凹槽与第二凹槽相垂直。
优选地，所述流体包括抗体。
上述多个第一凹槽与基底上的蛋白质条带相垂直，所述多个第一凹槽平行分布，并且第一凹槽与第二凹槽相垂直，可保证测量结果的精确和准确性，使结果更加清晰。
优选地，所述多个平行分布的第一凹槽为5～15个。
优选地，所述基底由聚偏二氟乙烯膜、聚偏二氟乙烯电纺丝薄膜、表面经化学修饰的镀金玻璃片、聚苯胺薄膜或聚吡咯薄膜制成，更优选地，所述基底由聚偏二氟乙烯膜制成。
优选地，所述蛋白质条带为从聚丙烯酰胺凝胶中转移到基底上的蛋白质条带，优选地，所述转移为电转移，，更优选地，所述蛋白质条带转移到由聚偏二氟乙烯膜制成的基底上。
优选地，所述片体为高分子材料经热塑或热固化而成的片体，优选地，所述片体由聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯制成，更优选地，所述片体由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。
优选地，本发明所述片体上的微流凹槽的宽度为50-200μm，深度为50-200μm，长度为10cm-50cm。
另一方面，本发明还提供一种多相微流控免疫印迹芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：制备固定有分离的蛋白质条带的基底；
步骤2：制备设有至少一个微流凹槽的片体，优选地，所述微流凹槽包括多个平行分布的第一凹槽，所述多个平行分布的第一凹槽的端部通过第二凹槽依次连接，所述多个平行分布的第一凹槽与基底上的蛋白质条带相垂直，优选地，所述多个平行分布的第一凹槽与第二凹槽相垂直；
步骤3：组装步骤1制备的基底与步骤2制备的片体，即得。
优选地，在步骤1中，所述基底由聚偏二氟乙烯膜、聚偏二氟乙烯电纺丝薄膜、表面经化学修饰的镀金玻璃片、聚苯胺薄膜或聚吡咯薄膜制成，优选地，所述基底由聚偏二氟乙烯膜制成。
优选地，所述蛋白质条带为从聚丙烯酰胺凝胶中转移到基底上的蛋白质条带，优选地，所述转移为电转移，更优选地，所述蛋白质条带转移到由聚偏二氟乙烯膜制成的基底上。
优选地，在步骤2中，所述片体为高分子材料经热塑或热固化而成的片体，优选地，所述片体由聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯制成，更优选地，所述片体由聚二甲基硅氧烷制成。
优选地，所述片体上的微流凹槽的宽度为50-200μm，深度为50-200μm，长度为10cm-50cm。
优选地，在步骤2中，当所述片体由聚二甲基硅氧烷制成时，具体通过包括以下步骤的方法进行：将聚二甲基硅氧烷与固化剂混合并倒入具有微流管道的模板，再将其烘干后，将固化的聚二甲基硅氧烷从模板上切下，在预设计的进样口和出样口处打孔，即得。
优选地，在步骤2中，所述聚二甲基硅氧烷与固化剂按18∶1-24∶1的质量比混合；优选地，于80℃下烘烤10-50分钟，更优选地，所述聚二甲基硅氧烷与固化剂按20∶1的质量比混合，于80℃下烘烤25分钟，最优选地，所述模板为硅片。
优选地，在步骤3中，具体通过包括以下步骤的方法进行：
步骤3.1：将固定按分子量分离的蛋白条带的聚基底烘干，所述烘干条件优选为37℃，60分钟；
步骤3.2：将设有至少一个微流凹槽的片体盖在步骤3.1得到的基底上，优选地，将设有至少一个微流凹槽的片体按多个平行分布的第一凹槽与基底上的蛋白质条带垂直的方向盖在步骤3.1得到的基底上，轻按压紧，即得。
再一方面，本发明还提供一种上述方法制得的多相微流控免疫印迹芯片在蛋白质检测中的应用，或在制备蛋白质检测的试剂盒中的应用，优选地，所述蛋白质检测为优化免疫反应抗体浓度。
另一方面，本发明还提供一种用于检测蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包括上述所述的多相微流控免疫印迹芯片或上述所述方法制得的多相微流控免疫印迹芯片。
本发明所提供的微流控免疫印迹芯片的实用范围包括同时检测细胞中的多种蛋白，检测蛋白质的分子量标准以及优化免疫反应中抗体浓度等，与现有技术相比，本发明所提供的微流控免疫印迹芯片及相应的检测方法具有明显的优势，能够明显地节约时间，传统的免疫检测***检测时间为5h至整夜，而本发明的芯片的检测时间小于等于1h；检测需要的样品量少，传统的免疫检测***检测十种样品需要的检测样品为100～200μg，而本发明的芯片检测十种样品需要的检测样品量为5～10μg；耗用抗体少，传统的免疫检测***检测一种蛋白耗用的抗体溶液体积为5-10mL，而本发明的芯片检测一种蛋白耗用的抗体溶液体积为20～40μL，降低成本，提高印迹分析的效果与质量，使传统耗时耗力的免疫印迹分析进入高通量自动化分析阶段。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明所述的多相微流控免疫印迹芯片的示意图和相应的实物图，图中A为固定有分离的蛋白条带的基底的示意图，图中B为固定有分离的蛋白条带的基底的实物图；图中C为多相微流控免疫印迹芯片的示意图，图中D为多相微流控免疫印迹芯片的实物图；图中E为多相微流控免疫印迹芯片检测蛋白后的试验结果示意图；图中F为多相微流控免疫印迹芯片检测蛋白后的试验结果，其中1为基底，101为基底上的蛋白标记，102为基底上的分离的蛋白条带；2为片体，201为形成通道入口的穿孔，202为形成通道出口的穿孔，3为微流凹槽，301为第一凹槽，302为第二凹槽；
图2为本发明所述的多相微流控免疫印迹芯片检测蛋白后的试验结果的后的局部放大图，图中1，1′；2，2′；3，3′；4，4′；5，5′；6，6′；7，7′均表示多相微流控免疫印迹芯片中对称位置处的检测结果，箭头所示为相应的微流通道所加入的抗体，所述抗体分别为抗-肌动蛋白抗体、抗膜联蛋白抗体和抗Pan-14-3-3抗体；
图3为本发明所述的多相微流控免疫印迹芯片用不同浓度蛋白条带和不同浓度的抗体检测蛋白的试验结果，图中3-1表示四个NIH 3T3细胞的裂解全蛋白条带加不同浓度的抗体检测的试验结果，图3-1中1表示分离的蛋白条带为浓度为10μg的NIH 3T3细胞的裂解全蛋白的检测结果，2表示分离的蛋白条带为浓度为5μg的NIH 3T3细胞的裂解全蛋白的检测结果，3表示分离的蛋白条带为浓度为2.5μg的NIH 3T3细胞的裂解全蛋白的检测结果，4表示分离的蛋白条带为浓度为1.25μg的NIH 3T3细胞的裂解全蛋白的检测结果；图中3-2表示图3-1中1加不同浓度的抗体的检测结果变化，图中3-3表示图3-1中1，2，3，4中的第三点的检测结果变化；
图4为本发明所述的多相微流控免疫印迹芯片与传统的免疫检测方法检测蛋白相比较的试验结果，图中A表示本发明所述的多相微流控免疫印迹芯片，B表示图A的局部放大图，C表示普通的免疫检测方法的孵育盒，D表示本发明所述的多相微流控免疫印迹芯片与传统的免疫检测方法检测蛋白结果的比较，其中Mic-WB表示本发明的多相微流控免疫印迹芯片蛋白检测方法，传统-WB表示传统的免疫检测方法，图中箭头所示为蛋白条带；
图5为本发明所述的多相微流控免疫印迹芯片分离分子量相近蛋白的结果，图中1-7分别表示多相微流控免疫印迹芯片中添加不同的抗体的检测结果。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
以下实施例中所用的抗β-肌动蛋白抗体(抗β-actin抗体)、抗膜联蛋白抗体(抗Annexin抗体)，抗Pan-14-3-3抗体购自SantaCruz公司。
实施例1
本实施例说明本发明的多相微流控免疫印迹芯片的制备方法
1.微流控芯片模板的制备
制备的主要过程为光刻，即利用光刻胶在紫外线照射下可改变性质的特点制作与设计好的掩膜上的图形完全一致的光刻胶硅片模板。具体的制备方法可参见Y Xia，G.Whitesides，Annual Review of Materials Science 1998，28，15。
2.设有多个微流凹槽的片体的制备
制备方法为软刻蚀技术，制备材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS，poly-dimethylsiloxane)，其在普通的状态下是透明而粘稠的液体，经与固化剂(184 silicone elastomer curing agent，购自美国道康宁公司)反应并加热后可固化。利用PDMS可以将硅片模板上的突起图形转换为对应的管道图形，从而得到设有多个微流凹槽的片体。在成型温度保持为80℃的情况下，本发明对制备设有多个PDMS微流凹槽的片体的原料质量配比和高温成型时间进行了优化，具体条件表1所示。
表1聚二甲基硅氧烷和固化剂的配比不同的各组物质
具体的实验步骤如下：
(1)根据表1中所示的PDMS单体(SYLGARD 184硅橡胶，购自美国道康宁公司)和固化剂(SYLGARD 184硅橡胶固化剂，购自美国道康宁公司)的质量配比，分别称取原料并混合，搅拌约10分钟至均匀，在真空泵中减压抽净气泡。
(2)在具有微流管道的硅片模板上倒入PDMS和固化剂的混合物，放置于真空泵中抽净气泡。
(3)放入烘箱中80℃，按照表1所示的时间进行烘烤，硅片上突出的光刻胶会将PDMS印上凹槽。
(4)将固化的PDMS从模板上切下，并在预设计的进样口处用带针头的注射器打孔，用Scotch(购自3M)白胶带清洁PDMS微流凹槽面。
(5)将聚偏二氟乙烯膜放在载玻片上，将设有多个PDMS微流凹槽的片体盖在聚偏二氟乙烯膜上，设有多个PDMS微流凹槽的片体尺寸大于聚偏二氟乙烯膜。用手将轻按将聚偏二氟乙烯膜与设有多个PDMS微流凹槽的片体压紧。
(6)用移液枪在芯片上通道末端的孔口处滴上30μL蓝墨水，在通道的另一端用注射器抽吸，记录和观察液体进入通道的难易程度和通道的渗漏情况，结果表明，当PDMS单体与固化剂按20∶1的质量配比，在80℃下烘干25分钟的条件下，液体容易通入通道，并且没有渗漏现象，效果较好。所制备好的片体上的微流凹槽规格为：宽度：50-200μm，深度：50-200μm，长度：10cm-50cm，具体如下表2。
表2组号1-9制得的微流通道规格
3.电泳
通过电泳仪将蛋白质混合物在聚丙烯酰胺凝胶中按分子量大小分离为条带，实验步骤同传统的免疫印迹实验中的电泳步骤相同，具体可参见H.Towbin，T.Staehelin，J.Gordon，Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 1979，76，4350。
4.电转移法
在电场作用下，将蛋白由聚丙烯酰胺凝胶中转移到聚偏二氟乙烯膜(即印迹多孔膜，由溶剂挥发成孔，孔径为0.2-0.45μm，购自milipore公司)，或者聚偏二氟乙烯电纺丝薄膜(纳米级纤维形成的无纺布，孔径为纳米级，具体制备方法可参见Yang，D.Y.；Niu，X.；Liu，Y Y；Wang，Y；Gu，X.；Song，L.S.；Zhao，R.；Ma，L.Y；Shao，Y.M.；Jiang，X.Y Adv Mate：2008，20，4770-4775.)上，实验步骤同传统的免疫印迹实验中的电转步骤相同，具体可参见H.Towbin，T.Staehelin，J.Gordon，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 1979，76，4350。
5.微流控芯片的组装
芯片组装即是将固定了蛋白的聚偏二氟乙烯膜与设有多个PDMS微流凹槽的片体结合在一起，组成封闭的通道，使液体能在负压下吸入通道，并且通道不会出现渗漏。微流控芯片的组装具体包括以下步骤：
(1)将转移上蛋白条带的聚偏二氟乙烯膜放在烘箱中烘干，37℃，60分钟。
(2)将聚偏二氟乙烯膜放在载玻片上，将设有多个PDMS微流凹槽的片体盖在聚偏二氟乙烯膜上。
(3)用手轻按将聚偏二氟乙烯膜与设有多个PDMS微流凹槽的片体压紧。因为PDMS具有弹性和粘性，所以设有多个PDMS凹槽的片体和聚偏二氟乙烯膜能密封良好。
6.微流控芯片免疫荧光检测
通过抗原抗体识别，在不同的通道中孵育不同的抗体，检测聚偏二氟乙烯膜上的多种蛋白。具体包括以下步骤：
(1)通道内封闭：用移液枪在芯片上通道末端的孔口处滴上3μL封闭液(5％体积牛血清蛋白BSA，磷酸盐缓冲液PBS)，在通道的另一端用注射器抽吸，使溶液充满通道，孵育10分钟后，用注射器抽出溶液。
(2)一抗孵育：将一抗用抗体稀释液进行稀释，并优化了该抗体稀释液的配方，调控Tween-20的体积分数为0.01％，0.02％，0.05％，0.1％，0.2％，0.4％，0.5％，得到不同配比的的磷酸盐缓冲液。分别向不同的通道中通入40μL针对不同蛋白的抗体稀释液，孵育30分钟后抽出。揭开PDMS通道，用去离子水冲洗聚偏二氟乙烯膜表面。
(3)摇洗：用PBST(0.2％体积Tween-20)摇洗聚偏二氟乙烯膜三次，每次5分钟。
(4)膜封闭：将膜放在封闭液(其配方同抗体稀释液)中摇荡20分钟。
(5)二抗孵育：将聚偏二氟乙烯膜放入荧光标记的二抗稀释液(其配方同抗体稀释液)中避光摇荡30分钟。
(6)摇洗：用PBST(0.2％体积Tween-20)避光摇洗聚偏二氟乙烯膜三次，每次10分钟。
(7)荧光检测：将聚偏二氟乙烯膜放入Typhoon Trio TM多功能影像分析***(Amersham公司)中检测信号，参数设置如下：发射滤光片520nm，激光488nm，PMT480，敏感度中等。
(8)观察并记录每组的荧光信号和背景，结果表明，当一抗稀释液的磷酸盐缓冲液中含有0.2％体积Tween-20时，信噪比最强。
实施例2
本实施例用于说明本发明的多相微流控免疫印迹芯片的多相检测能力。实施步骤如下：
如实施例1中所述，将80μg NIH 3T3细胞的裂解全蛋白分别上样到两个泳道中，依照优选的时间进行电泳，转膜，然后将负载蛋白质的膜烘干，使用PDMS单体与固化剂按20∶1的质量配比，在80℃下烘烤25分钟的条件制备出PDMS芯片，将膜和芯片通过轻压结合在一起。从左至右在通道中分别通入不同的抗体，具体地，1和2：通入抗膜联蛋白抗体和抗Pan-14-3-3抗体两种抗体的混合物；3和4：通入抗-肌动蛋白抗体(抗-actin抗体)和抗Pan-14-3-3抗体两种抗体的混合物；5和6：通入抗-肌动蛋白抗体(抗-actin抗体)和抗膜联蛋白抗体两种抗体的混合物，7：通入抗-肌动蛋白抗体(抗-actin抗体)，抗膜联蛋白抗体(抗Annexin抗体)，抗Pan-14-3-3抗体三种抗体的混合物，从右至左1′-7′通入的抗体的顺序与从左到右1-7相同，抗体的优选浓度为1∶80，二抗使用荧光标记的兔抗小鼠IgG，浓度为1∶2000。结果如图2所示。
实施例3
本实施例用于说明本发明的多相微流控免疫印迹芯片用于半定量检测的能力。
如实施例1中所述，将四个泳道中分别装在上10μg，5μg，2.5μg，1.25μgNIH 3T3细胞的裂解全蛋白，依照优选的时间进行电泳，转膜，然后将负载蛋白质的膜烘干，使用PDMS单体与固化剂按20∶1的质量配比，在80℃下烘干25分钟的条件制备出PDMS芯片，将膜和芯片通过轻压结合在一起。取用SantaCruz公司的抗膜联蛋白抗体，初始浓度取为1∶20，然后梯度稀释抗体溶液分别为1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1280。将这七种浓度的抗体分别通入7个微流通道之中，二抗的浓度为1∶2000。得到不同浓度的抗体和不同量的抗原分别作用的点阵图。如附图3-1所示，不同的反应结果被整齐清晰地排布在一张结果图片中。对这些结果做荧光强度的定量分析，可以很容易地得到荧光强度随设定的抗原抗体变化的曲线。分别地，如图3-2所示，对于一定量的抗原量，使用不同浓度的抗体，得到抗体滴定曲线，该曲线说明固定在基底上的定量抗原对于抗体的结合能力与饱和程度，用于判定后续试验中的优选浓度；如图3-2所示，对于一定量的抗体浓度，使用不同量地抗原，得到抗原的滴定曲线，该曲线可以说明抗原的量的多少，用于判定后续试验中该特定目标蛋白在未知样品中的浓度。这个点阵图说明本发明在一次实验中得到这两个有用的信息。
实施例4
本实施例用于说明本发明的多相微流控免疫印迹芯片缩短免疫反应时间的能力。
如实施例1所述，将20μg的NIH-3T3细胞(购自ATCC)裂解全蛋白装载到蛋白泳道中，按照优选的时间，电压，温度条件进行电泳，转膜，干燥，一抗的浓度为1∶200，7个通道内通入相同浓度的一抗，其孵育时间分别设定为2.5min，5min，10min，20min，30min，60min，90min，二抗的浓度为1∶2000，孵育时间设定为60min。作为比较实验，对于传统的蛋白免疫印迹方法，同样将一抗的浓度设定为1∶200，准备7个同样的孵育皿，将7个孵育皿中的一抗孵育时间也分别设定为2.5min，5min，10min，20min，30min，60min，90min，二抗的浓度和孵育时间也分别为1∶2000和60min。分别反应，漂洗之后比较本发明和传统免疫印迹方法的荧光强度随时间变化的程度，如附图4所示，可以看到本发明中的荧光强度可以在相对较短的时间(20min)内达到饱和，因此可以明显减少正常反应所需的时间。
实施例5
本实施例说明本发明的多相微流控免疫印迹芯片用于分辨免疫印记中相邻蛋白条带的能力。
在常规的电泳分离以及电转移之后，选取全蛋白中两个分子量相近的蛋白质膜联蛋白(36kD)和GAPDH(35.8kD)，若采用传统的免疫印记的反应，由于两个条带相隔太近，无法区分，只能采用两次独立的检测来实现鉴定。而在本发明中，由于不同的微流通道可以将不同的抗体分隔开来，所以能够在一次实验中同时检测多个分子量相近，位置相邻的蛋白条带。例如，将本发明中的微流通道铺盖在一个待区分的条带之上，将一个通道中通入抗膜联蛋白的抗体，相邻的另一个通道中通入抗GAPDH的抗体，具体的：图中1和7：抗Pan-14-3-3抗体；2和6：抗膜联蛋白抗体(抗Annexin抗体)；3和5：抗GAPDH抗体；4：抗-肌动蛋白抗体(抗-actin抗体)，参照实施例1中的步骤经过反应，显影之后，如图5所示，通道2和通道3对应的地方都有信号，则说明此条带是由抗膜联蛋白的条带和GAPDH的条带复合而成的。
实施例6
本实施例说明本发明的多相微流控免疫印迹芯片中微流通道严格分隔抗体溶液，保证密封性的能力。
使用PDMS单体与固化剂按20∶1的质量配比，在80℃下烘烤25分钟的条件制备出PDMS芯片，将其与负载蛋白质的聚偏二氟乙烯膜贴合。然后利用一个塑料的平板将聚偏二氟乙烯膜和PDMS芯片压合，取下塑料板，二者接触处颜色变浅，说明二者贴合情况良好。此时通入抗体溶液，可以方便地使抗体溶液从通道入口顺利流至通道出口，不发生液体的泄漏。
实施例7
本实施例说明本发明的多相微流控免疫印迹芯片中的微流通道具有自动进样的能力。
首先将PDMS芯片与干净的玻璃片贴合，然后在通道内通入用磷酸盐缓冲液溶解的脱脂奶粉溶液，使用了不同脱脂奶粉在溶液中的不同配比，使其质量分数为1％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％，5％，5.5％，6％，6.5％，7％，在通道内孵育5分钟，然后抽出。将被脱脂奶粉溶液孵育过的PDMS芯片和聚偏二氟乙烯膜贴合，压紧，在通道入口处滴加抗体溶液。结果表明，通道入口处的抗体溶液可以在没有外力的驱动下自动流入通道内。通过比较实验得知，当选用的脱脂奶粉溶液中奶粉的质量分数为5％时，自动进样效果最明显。
Claims (13)
1.一种多相微流控免疫印迹芯片，包括固定有分离的蛋白质条带的基底和与其叠置的片体，所述片体的与基底相叠置的表面上设有至少一个微流凹槽，所述至少一个微流凹槽与所述基底共同形成供流体流通的至少一个微流通道，所述片体的另一个表面上在对应于所述微流通道的两个端口的位置处分别设有穿孔以形成所述微流通道的通道入口和通道出口。
2.根据权利要求1所述的多相微流控免疫印迹芯片，其特征在于，所述微流凹槽包括多个平行分布的第一凹槽，所述多个平行分布的第一凹槽的端部通过第二凹槽依次连接，所述多个平行分布的第一凹槽与基底上的蛋白质条带相垂直，优选地，所述多个平行分布的第一凹槽与第二凹槽相垂直，更优选地，所述流体包括抗体，更优选地，所述多个平行分布的第一凹槽为5～15个。
3.根据权利要求1或2所述的多相微流控免疫印迹芯片，其特征在于，所述基底由聚偏二氟乙烯膜、聚偏二氟乙烯电纺丝薄膜、表面经化学修饰的镀金玻璃片、聚苯胺薄膜或聚吡咯薄膜制成，优选地，所述基底由聚偏二氟乙烯膜制成。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多相微流控免疫印迹芯片，其特征在于，所述蛋白质条带为从聚丙烯酰胺凝胶中转移到基底上的蛋白质条带，优选地，所述转移为电转移，更优选地，所述蛋白质条带转移到由聚偏二氟乙烯膜制成的基底上。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多相微流控免疫印迹芯片，其特征在于，所述片体为高分子材料经热塑或热固化而成的片体，优选地，所述片体由聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯制成，更优选地，所述片体由聚二甲基硅氧烷制成。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多相微流控免疫印迹芯片，其特征在于，所述片体上的微流凹槽的宽度为50-200μm，深度为50-200μm，长度为10cm-50cm。
7.根据权利要求1至6任一项所述的多相微流控免疫印迹芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：制备固定有分离的蛋白质条带的基底；
步骤2：制备设有至少一个微流凹槽的片体，优选地，所述微流凹槽包括多个平行分布的第一凹槽，所述多个平行分布的第一凹槽的端部通过第二凹槽依次连接，所述多个平行分布的第一凹槽与基底上的蛋白质条带相垂直，优选地，所述多个平行分布的第一凹槽与第二凹槽相垂直；
步骤3：组装步骤1制备的基底与步骤2制备的片体，即得。
8.根据权利要求7所述的相微流控免疫印迹芯片的制备方法，其特征在于，在步骤1中，所述基底为聚偏二氟乙烯膜、聚偏二氟乙烯电纺丝薄膜、表面经化学修饰的镀金玻璃片、聚苯胺薄膜或聚吡咯薄膜的基底，优选地，所述基底为聚偏二氟乙烯膜的基底，优选地，所述蛋白质条带为从聚丙烯酰胺凝胶中转移到基底上的蛋白质条带，优选地，所述转移为电转移，更优选地，所述蛋白质条带转移到由聚偏二氟乙烯膜制成的基底上。
9.根据权利要求7或8所述的相微流控免疫印迹芯片的制备方法，其特征在于，在步骤2中，所述片体为高分子材料经热塑或热固化而成的片体，优选地，所述片体由聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯制成，更优选地，所述片体由聚二甲基硅氧烷制成，优选地，所述片体上的微流凹槽的宽度为50-200μm，深度为50-200μm，长度为10cm-50cm。
10.根据权利要求9所述的相微流控免疫印迹芯片的制备方法，其特征在于，在步骤2中，当所述片体由聚二甲基硅氧烷制成时，具体通过包括以下步骤的方法进行：将聚二甲基硅氧烷与固化剂混合并倒入具有微流管道的模板，再将其烘干后，将固化的聚二甲基硅氧烷从模板上切下，在预设计的进样口和出样口处打孔，即得；
优选地，所述聚二甲基硅氧烷与固化剂按18∶1-24∶1的质量比混合；于80℃下烘烤10-50分钟，更优选地，所述聚二甲基硅氧烷与固化剂按20∶1的质量比混合，于80℃下烘烤25分钟，最优选地，所述模板为硅片。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的多相微流控免疫印迹芯片的制备方法，其特征在于，在步骤3中，具体通过包括以下步骤的方法进行：
步骤3.1：将固定按分子量分离的蛋白条带的基底烘干，所述烘干条件为37℃，60分钟；
步骤3.2：将设有至少一个微流凹槽的片体盖在步骤3.1得到的基底上，优选地，将设有至少一个微流凹槽的片体按多个平行分布的第一凹槽方向与基底上的蛋白质条带垂直的方向盖在步骤3.1得到的基底上，轻按压紧，即得。
12.根据权利要求1至6中任一项所述的多相微流控免疫印迹芯片或权利要求7至11中任一项所述方法制得的多相微流控免疫印迹芯片在蛋白质检测中的应用或在用于制备蛋白质检测的试剂盒中的应用，优选地，所述蛋白质检测为优化免疫反应抗体浓度。
13.一种用于检测蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1至6中任一项所述的多相微流控免疫印迹芯片或权利要求7至11中任一项所述方法制得的多相微流控免疫印迹芯片。
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