CN103175932B - 高效液相色谱测定橡胶树中四种激素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效液相色谱测定橡胶树中四种激素的方法。本发明所提供的方法包括如下步骤：（1）样品前处理：将橡胶树组织用液氮研磨后，置于抽提液中抽提，离心，从离心后的上清液中分离得到水相，将所述水相过层析柱，用甲醇洗脱，获得待测样品；（2）高效液相色谱检测：采用反相C18色谱柱，以甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲液的混合液为流动相，以254nm为检测波长，检测步骤（1）获得的待测样品中的生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素。本发明所提供的方法可一次检测出四种激素，提取流程时间短，测定准确率和精确性高，提高测定和分析效率。本发明是研究巴西橡胶树高产速生机制及植物激素在形成层分化过程中的良好方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效液相色谱测定橡胶树中四种激素的方法，特别涉及一种利用高效液相色谱同时测定巴西橡胶树叶片、枝条或树皮中生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素的方法。
背景技术
天然橡胶产业长期以收集胶乳作为工业原料为主，以木材、种子等其它生物量开发利用为辅。橡胶树叶片和树皮中的内源激素生长素（IAA），赤霉素（GA3），脱落酸（ABA）和玉米素（ZT）的含量、活性以及信号路径调控胶乳产量和木材生长发育。然而，橡胶树上述四种内源激素含量极低，性质不稳定，橡胶树叶片和树皮存在多种成分干扰，造成橡胶树激素测定存在困难。传统的测定橡胶树内源激素的方法如下：用80%甲醇采取新鲜的胶乳，低温高速离心后用酶联免疫技术测定生长素（IAA），脱落酸（ABA）和细胞***素（iPAs）的含量（曹建华，林卫夫.巴西橡胶树胶乳中4种植物生长物质的测定.热带作物学报.2004.25（3）：1-4）。其中提取和分离纯化的过程对激素保护不利，稍有操作不当极易造成样品中待测激素的浪费，并且不能同时进行多种植物内源激素的测定。采用透吸法收集样品，将取得的透析液在高效液相色谱仪上进样，分离并测定出其中的激素含量（姜波，李日红，金华，姜国斌，国家发明专利CN101738441A）。其活体取样虽具有基本不干扰生物体内正常生命活动，实现活体取样的优点，但是无法穿透老的枝条和树皮组织中，不适用巴西橡胶树这种高大乔木。
ProElut PXC小柱含有混合型强阳离子交换反向吸附剂，由PLS吸附剂键合磺酸基团得到，兼具阳离子交换和反相两种保留模式，适用于其共轭酸的pKa值处于2-10之间的碱性化合物，主要为胺基化合物。主要用途是：食品安全检测三聚氰胺分析；动物样品中碱性药物残留的分析，比如磺胺类药物、盐酸克伦特罗等药物；蔬菜、水果以及果汁中碱性农药的分析，比如多菌灵、噻菌灵等杀菌剂；生物样品：血液、尿液中碱性药物的分析等等。
高效液相色谱（HPLC）是测定植物激素的有效测定方法之一，并在热带水果作物荔枝、椰子中等样品中成功的测定了多种植物激素。然而，在色谱分析过程中，仅用甲醇、乙腈两种有机溶剂容易出现拖峰现象，洗脱效果不好，造成测定结果的误差。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效液相色谱测定橡胶树中生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素的方法。
一种高效液相色谱测定橡胶树中生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素的方法，包括如下步骤：
（1）样品前处理：将待检测的橡胶树组织用液氮研磨后，置于抽提液中抽提，离心，从离心后的上清液中分离得到水相，将所述水相过层析柱，用甲醇洗脱，获得待测样品；
所述抽提液的溶质为2,6-二叔丁基对甲苯酚，溶剂为体积百分含量为80%的甲醇水溶液；所述2,6-二叔丁基对甲苯酚在所述抽提液中的含量为每100mL所述抽提液中含有0.1g所述2,6-叔丁基对甲苯酚；
（2）高效液相色谱检测：采用C18反相色谱柱，以甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲液的混合液为流动相，以254nm为检测波长，检测步骤（1）获得的待测样品中的生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸。
在上述方法中，所述流动相中，所述甲醇、所述乙腈和所述磷酸盐缓冲液的体积比为15：15：70；所述流动相的pH为3.5。
所述磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：磷酸二氢钠40g/L，pH3.5。具体配制方法如下：将40g磷酸二氢钠溶于1000mL超纯水中，用HCl调节pH值到3.5。
步骤（1）中，所述层析柱为PXC反相保留阳离子交换柱。
在本发明的一个实施例中，所述PXC反相保留阳离子交换柱具体为北京迪马公司的产品，其产品目录号为Cat.No.:68203A。
在上述方法中，步骤（1）所述的样品前处理于黑暗条件下进行，同时保持低温（4℃）。所述黑暗为光照强度小于20μmol m-2s-1。
在上述方法中，步骤（1）中，所述抽提液的用量具体可为每0.5g所述待测橡胶树组织样品（鲜重）加入15mL抽提液。
在上述方法中，步骤（1）中，所述置于抽提液中抽提，抽提2次。
在上述方法中，步骤（1）中，所述离心具体可为18000g离心10min。所述离心温度可为4℃。
在上述方法中，步骤（1）中，所述从离心后的上清液中分离得到水相是通过包括如下步骤的方法实现的：向所述上清液中加入相当于所述上清液体积1/300的氨水后，过滤（0.22μm针式过滤器过滤）后，用旋转蒸发仪真空蒸发，去除有机相，得到所述水相。用0.1mol/L盐酸调节所述水相pH为3.0，用0.22μm针式过滤器过滤。
在上述方法中，步骤（1）中，所述“将所述水相过层析柱，用甲醇洗脱”，具体包括如下步骤：
（1）活化柱子：用甲醇（如10mL）活化所述层析柱（PXC反相保留阳离子交换柱）；
（2）平衡柱子：用水（超纯水，经0.22μm针式过滤器过滤，10mL）平衡所述层析柱（PXC反相保留阳离子交换柱）；
（3）上样：将所述水相（pH3.0，经0.22μm针式过滤器过滤）加到步骤（2）中平衡后的所述层析柱（PXC反相保留阳离子交换柱）；
（4）淋洗：用0.1mol/L HCL（10mL）淋洗所述层析柱（PXC反相保留阳离子交换柱）；
（5）洗脱：用甲醇（10mL）洗脱。
在上述方法中，步骤（2）所述的高效液相色谱检测，柱温为30℃。
在上述方法中，步骤（2）所述的高效液相色谱检测，洗脱方式为等度洗脱，流速为1mL/min，进样量为10μL。
在本发明的一个实施例中，步骤（2）所述反相C18色谱柱具体为美国Waters公司生产的CNWSIL C18液相色谱柱4.6×150mm5μm。
在上述方法中，所述橡胶树组织具体可为橡胶树的叶片、枝条或树皮。在本发明中，所述橡胶树具体为巴西橡胶树。
所述方法既可用于定性检测橡胶树组织中的生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素，也可用于定量检测橡胶树组织中的生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素的含量。
在本发明中，进行定量检测时，HPLC检测已知系列浓度的激素标准品溶液，以峰面积(Y)对标准品浓度(x，mg/L)进行回归计算，得该激素的标准曲线方程，再根据待测样品中该激素的实测峰面积，计算该激素在待测样品中的含量。
本发明所提供的高效液相色谱测定橡胶树中生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素的方法，可一次检测出四种激素，提取流程时间短，测定准确率和精确性高，提高测定和分析效率。本发明是研究巴西橡胶树高产速生机制及植物激素在形成层分化过程中的良好方法。
附图说明
图1为四种激素混合标准品的高效液相色谱图。其中，峰1为玉米素（ZT），峰2为赤霉素（GA3），峰3为生长素（IAA），峰4为脱落酸（ABA）。
图2为橡胶树叶片中的四种激素检测的高效液相色谱图。其中，峰1为玉米素（ZT），峰2为赤霉素（GA3），峰3为生长素（IAA），峰4为脱落酸（ABA）。
图3为橡胶树枝条中的四种激素检测的高效液相色谱图。其中，峰1为玉米素（ZT），峰2为赤霉素（GA3），峰3为生长素（IAA），峰4为脱落酸（ABA）。
图4为橡胶树树皮中的四种激素检测的高效液相色谱图。其中，峰1为玉米素（ZT），峰2为生长素（IAA），峰3为脱落酸（ABA）。
图5为橡胶树叶片中的四种激素检测的高效液相色谱图（样品前处理方法1）。
图6为橡胶树叶片中的四种激素检测的高效液相色谱图（样品前处理方法2）。
图7为橡胶树叶片中的四种激素检测的高效液相色谱图（样品前处理方法3）。
图8为橡胶树叶片中的四种激素检测的高效液相色谱图（样品前处理方法4）。
图9为混合标准品中的四种激素检测的高效液相色谱图（流动相1）。
图10为混合标准品中的四种激素检测的高效液相色谱图（流动相2）。
图11为混合标准品中的四种激素检测的高效液相色谱图（流动相3）。
图12为混合标准品中的四种激素检测的高效液相色谱图（流动相4）。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）无性系热研7-33-97：是中国热带农业科学院橡胶研究所品种，记载在“袁坤,周雪梅,李建辉等.死皮防治剂对死皮橡胶树胶乳生理的影响.湖北农业科学,2011年17期”一文中，由中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种植资源圃提供。
生长素（IAA）、玉米素（ZT）、赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）标准品：均购自Sigma Chemical Co（St Louis,MO,USA)，ZT（产品目录号：Z0876）、IAA（产品目录号：H8876）、GA3（产品目录号：48880）、ABA（产品目录号：A1049）。
下述实施例中所涉及的各种溶液的配方如下：
（1）磷酸盐缓冲液：磷酸盐缓冲液是将40g磷酸二氢钠溶于1000mL超纯水中，用HCl调节pH值到3.5。用于配制HPLC检测流动相。
（2）抽提液：溶质为2,6-二叔丁基对甲苯酚（购自Sigma公司，货号B1378），溶剂为体积百分含量为80%的甲醇水溶液；所述2,6-二叔丁基对甲苯酚在所述抽提液中的含量为每100mL所述抽提液中含有0.1g所述2,6-二叔丁基对甲苯酚。
下述实施例中涉及的HPLC检测生长素（IAA）、玉米素（ZT）、赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）四种激素标准曲线的绘制，均具体如下：
色谱柱为美国Waters公司生产的CNWSIL C18液相色谱柱（4.6×150mm5μm），柱温30℃；流动相为甲醇、乙腈、磷酸盐缓冲液（体积比为15∶15∶70，pH3.5）等度洗脱；流速为1mL/min；进样量为10μL；检测波长为254nm。其中，生长素、玉米素和脱落酸浓度范围均为0.001、0.01、0.1、0.5、1、2、10mg/L的标准品系列浓度，赤霉素浓度范围为1.07、2.14、5.35、10.7、21.4、107、214、856mg/L的标准品系列浓度。在上述条件下经液相色谱仪检测后，以生长素（或玉米素、或赤霉素、或脱落酸）的峰面积(Y)对生长素（或玉米素、或赤霉素、或脱落酸）的标准品浓度(x，mg/L)进行回归计算，得回归方程。四种激素标准曲线方程及其相关系数具体如表1所示。
表1四种激素标准曲线方程及其相关系数
下述实施例中所涉及的待测橡胶树组织样品的前处理方法，均具体如下：
将待测橡胶树组织样品（叶片、枝条或树皮）称重后，0.5g样品（鲜重）采用150mL液氮精细研磨。研磨后，按照每0.5g所述待测橡胶树组织样品（鲜重）加入15ml抽提液的用量，在4℃黑暗（光照强度<20μmol m-2s-1）条件下反复提取2次，合并提取液，18000g4℃离心10分钟，取上清液，向所述上清液中加入相当于所述上清液体积50μL/15mL的氨水后，用旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂RE-52旋转蒸发仪）40℃真空蒸发，去除有机相，得到水相。并用0.1mol/L稀盐酸调节所述水相的pH值到3.0，0.22μm针式过滤器过滤后备用。
采用10ml甲醇活化PXC反相保留阳离子交换柱（北京迪马公司ProElut PXC60mg/3mL），采用10ml经0.22μm针式过滤器过滤的超纯水平衡所述PXC反相保留阳离子交换柱。将上述得到的过滤后的水相样品加到平衡好的柱子中，用10ml浓度为0.1mol/L的HCl淋洗，再用10ml甲醇洗脱。收集洗脱液，用旋转蒸发仪40℃真空蒸发至尽干，用1mL色谱甲醇溶解，过0.2μm微孔滤膜，得到进行HPLC检测的待上样样品。
实施例1、高效液相色谱测定巴西橡胶树叶片中生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素的含量
1、巴西橡胶树叶片的采集及前处理
巴西橡胶树叶片采自种植于中国热带农业科学院试验场的巴西橡胶树（Heveabrasiliensis）无性系热研7-33-97。其样品前处理参照上文所述进行，获得待测样品。
2、高效液相色谱检测待测样品中四种激素含量
色谱条件：色谱柱为美国Waters公司生产的CNWSIL C18液相色谱柱（4.6×150mm5μm），柱温30℃；流动相为甲醇、乙腈、磷酸盐缓冲液（体积比为15∶15∶70，pH3.5）等度洗脱；流速为1mL/min；进样量为10μL；检测波长为254nm。
（1）利用四种激素混合标准品测定各激素出蜂时间
分别准确称取ZT、IAA，GA和ABA标准品各5mg，分别用流动相（甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲液的体积比为15∶15∶70的混合液，pH3.5）定容至50ml，配制成终浓度均为100mg/L的4种标准溶液，再将上述4种标准溶液按照一定比例混合配制成混合标准溶液，使得ZT的终浓度为0.1μg/mL、IAA的终浓度为0.1μg/mL、GA的终浓度为0.1μg/mL、ABA的终浓度为0.1μg/mL。按照上述色谱条件检测混合标准溶液。实验重复三次。
色谱图如图1所示，玉米素（ZT）的保留时间为2.166min，赤霉素（GA3）的保留时间为3.871min，生长素（IAA）的保留时间为8.133min，脱落酸（ABA）的保留时间为13.405min。注：以下实施例中每次对待测样品进行检测前均进行标样测定，对照标样测定的保留时间来定性待测样品中的相应组分，由于实验误差，每次测定的标样保留时间会与图1的结果有微小的差异，均在实验误差允许范围内。
（2）高效液相色谱检测待测样品中四种激素含量
按照上述色谱条件检测步骤1中制备得到的待测样品中生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸的含量。以标样出峰时间定性，外标法峰面积定量（即根据峰面积检测值与相应的标准曲线计算激素含量）。实验重复三次，定量结果取三次重复的平均值。
色谱图如图2所示，进一步根据标准曲线测定巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）无性系热研7-33-97叶片中的激素含量如下：玉米素（ZT）的含量为21.6μg/g鲜重；赤霉素（GA3）的含量为42.2μg/g鲜重；生长素（IAA）的含量为0.0033μg/g鲜重；脱落酸（ABA）的含量为0.084μg/g鲜重。
3、四种激素的样品加标回收率测定
（1）样品前处理
将采自种植于中国热带农业科学院试验场的巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）无性系热研7-33-97的叶片粉碎均匀后称量成四个0.1g小份，每个0.1g小份加入生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素标准品中的一种10μg，混匀后静置30min，接着进行样品前处理（参照上文所述进行），获得待测样品（加标试样）。同时以未加四种激素标准样品的等量叶片粉末作为空白对照（未加标试样）。
（2）高效液相色谱检测
按照步骤2中所述色谱条件检测步骤（1）中制备得到的待测样品中生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸的含量，计算平均回收率。实验重复6次，定量结果取6次重复的平均值。
回收率=（加标试样测定值-未加标试样测定值）/加标量×100%
结果如表2所示，可以看出，加入标准品后的平均回收率：GA，105.2%；ZT，85.6%；IAA，90.9%；ABA，109.1%。这一结果证实了高效液相色谱检测待测样品中四种激素含量这一分析方法的有效性和准确性。
表2加入各标准品后平均回收率测定结果
实施例2、高效液相色谱测定巴西橡胶树枝条中生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素的含量
1、巴西橡胶树枝条的采集及前处理
巴西橡胶树枝条采自种植于中国热带农业科学院试验场的巴西橡胶树（Heveabrasiliensis）无性系热研7-33-97。其样品前处理参照上文所述进行，获得待测样品。
2、高效液相色谱检测待测样品中四种激素含量
操作方法同实施例1中步骤2。
色谱图如图3所示，进一步根据标准曲线测定巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）无性系热研7-33-97枝条中的激素含量如下：玉米素（ZT）的含量为1581.6μg/g鲜重；赤霉素（GA3）的含量为5.067μg/g鲜重；生长素（IAA）的含量为0.118μg/g鲜重；脱落酸（ABA）的含量为65.856μg/g鲜重。
实施例3、高效液相色谱测定巴西橡胶树树皮中生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素的含量
1、巴西橡胶树树皮的采集及前处理
巴西橡胶树树皮采自种植于中国热带农业科学院试验场的巴西橡胶树（Heveabrasiliensis）无性系热研7-33-97。其样品前处理参照上文所述进行，获得待测样品。
2、高效液相色谱检测待测样品中四种激素含量
操作方法同实施例1中步骤2。
色谱图如图4所示，进一步根据标准曲线测定巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）无性系热研7-33-97树皮中的激素含量如下：玉米素（ZT）的含量为102.9μg/g鲜重；赤霉素（GA3）的含量为0μg/g鲜重；生长素（IAA）的含量为0.022μg/g鲜重；脱落酸（ABA）的含量为0.45μg/g鲜重。
对比例1、不同样品前处理方法的比较
一、样品前处理方法1
（1）巴西橡胶树叶片的采集及前处理
巴西橡胶树叶片采自种植于中国热带农业科学院试验场的巴西橡胶树（Heveabrasiliensis）无性系热研7-33-97。其样品前处理方法如下：
待测橡胶树组织样品（叶片）称重后，0.1g样品（鲜重）采用15mL液氮精细研磨。研磨后，按照每0.1g所述待测橡胶树组织样品（鲜重）加入15ml80%预冷甲醇的用量，在4℃黑暗（光照强度<20μmol m-2s-1）条件下提取，18000g4℃离心10分钟，取上清液，过滤，滤液用0.1mol/L HCl调pH至3.0，用等量的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相；用旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂RE-52旋转蒸发仪）40℃真空蒸干，加pH3.5的乙酸洗涤蒸馏瓶2次，每次2mL，合并洗液。
洗液过PXC反相保留阳离子交换柱（北京迪马公司ProElut PXC60mg/3mL）（柱子先用10mL甲醇活化，再用10mL水平衡），用10mL10%甲醇洗涤，5mL水洗涤，最后用4mL100%乙腈洗脱。收集洗脱液，用旋转蒸发仪40℃真空蒸发至尽干，用1mL色谱甲醇溶解，得到进行HPLC检测的待上样样品。
（2）高效液相色谱检测待测样品中四种激素含量
操作方法同实施例1中步骤2。
色谱图如图5所示，经液相色谱检测，无法检测到待测四种激素。
二、样品前处理方法2
（1）巴西橡胶树叶片的采集及前处理
巴西橡胶树叶片采自种植于中国热带农业科学院试验场的巴西橡胶树（Heveabrasiliensis）无性系热研7-33-97。其样品前处理方法如下：
待测橡胶树组织样品（叶片）称重后，0.1g样品（鲜重）采用15mL液氮精细研磨。研磨后，按照每0.1g所述待测橡胶树组织样品（鲜重）加入15ml80%预冷甲醇的用量，在4℃黑暗（光照强度<20μmol m-2s-1）条件下提取，18000g4℃离心10分钟，取上清液，过滤；用旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂RE-52旋转蒸发仪）40℃真空蒸干，加pH3.5的乙酸洗涤蒸馏瓶2次，每次2mL，合并洗液。
洗液过PXC反相保留阳离子交换柱（北京迪马公司ProElut PXC60mg/3mL）（柱子先用10mL甲醇活化，再用10mL水平衡），用10mL10%甲醇洗涤，5mL水洗涤，最后用4mL100%乙腈洗脱。收集洗脱液，用旋转蒸发仪40℃下真空蒸发至尽干，用1mL色谱甲醇溶解，得到进行HPLC检测的待上样样品。
（2）高效液相色谱检测待测样品中四种激素含量
操作方法同实施例1中步骤2。
色谱图如图6所示，经液相色谱检测，无法检测到待测四种激素。
三、样品前处理方法3
（1）巴西橡胶树叶片的采集及前处理
巴西橡胶树叶片采自种植于中国热带农业科学院试验场的巴西橡胶树（Heveabrasiliensis）无性系热研7-33-97。其样品前处理方法如下：
待测橡胶树组织样品（叶片）称重后，0.1g样品（鲜重）采用15mL液氮精细研磨。研磨后，按照每0.1g所述待测橡胶树组织样品（鲜重）加入15ml80%预冷甲醇的用量，在4℃黑暗（光照强度<20μmol m-2s-1）条件下提取，18000g4℃离心10分钟，取上清液，过滤，滤液用0.1mol/L HCl调pH至3.0；用旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂RE-52旋转蒸发仪）40℃真空蒸干，加pH3.5的乙酸洗涤蒸馏瓶2次，每次2mL，合并洗液。
洗液过PXC反相保留阳离子交换柱（北京迪马公司ProElut PXC60mg/3mL）（柱子先用10mL甲醇活化，再用10mL水平衡），用10mL10%甲醇洗涤，5mL水洗涤，最后用4mL100%乙腈洗脱。收集洗脱液，用旋转蒸发仪40℃下真空蒸发至尽干，用1mL色谱甲醇溶解，过0.22μm有机相针式滤器，得到进行HPLC检测的待上样样品。
（2）高效液相色谱检测待测样品中四种激素含量
操作方法同实施例1中步骤2。
色谱图如图7所示，经液相色谱检测，无法检测到待测四种激素。
四、样品前处理方法4
（1）巴西橡胶树叶片的采集及前处理
巴西橡胶树叶片采自种植于中国热带农业科学院试验场的巴西橡胶树（Heveabrasiliensis）无性系热研7-33-97。其样品前处理方法如下：
待测橡胶树组织样品（叶片）称重后，0.1g样品（鲜重）采用15mL液氮精细研磨。研磨后，按照每0.1g所述待测橡胶树组织样品（鲜重）加入15ml80%预冷甲醇的用量，在4℃黑暗（光照强度<20μmol m-2s-1）条件下提取，18000g4℃离心10分钟，取上清液，过滤。
洗液过PXC反相保留阳离子交换柱（北京迪马公司ProElut PXC60mg/3mL）（柱子先用5mL甲醇活化，再用5mL水平衡），上样后，用10mL0.1mol/L HCl淋洗，用10mL甲醇洗脱，用旋转蒸发仪40℃下真空蒸发至没有甲醇残余，得到水相。并用0.1mol/L稀盐酸调节所述水相的pH值到3.0，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相；用旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂RE-52旋转蒸发仪）40℃真空蒸干，用1mL色谱甲醇溶解，过0.22μm有机相针式滤器，得到进行HPLC检测的待上样样品。
（2）高效液相色谱检测待测样品中四种激素含量
操作方法同实施例1中步骤2。
色谱图如图8所示，经液相色谱检测，无法检测到待测四种激素。
对比例2、不同流动相的比较
一、流动相1
（1）标准品混合溶液的配制
分别准确称取ZT、IAA，GA和ABA标准品各5mg，用甲醇定容至50ml，配制成终浓度均为100mg/L的4种标准溶液，再将上述4种标准溶液按照一定比例混合配制成混合标准溶液，使得ZT的终浓度为0.1μg/mL、IAA的终浓度为0.1μg/mL、GA的终浓度为0.1μg/mL、ABA的终浓度为0.1μg/mL。
（2）高效液相色谱检测混合标准品
色谱条件：色谱柱为美国Waters公司生产的CNWSIL C18液相色谱柱（4.6×150mm5μm），柱温30℃；流动相为甲醇、0.5%（体积分数）乙酸（体积比为50∶50，pH3.5）等度洗脱；流速为1mL/min；进样量为10μL；检测波长为254nm。
色谱图如图9所示，不能将四种待测激素有效分开。
二、流动相2
（1）标准品混合溶液的配制
同步骤一中（1）。
（2）高效液相色谱检测混合标准品
色谱条件：色谱柱为美国Waters公司生产的CNWSIL C18液相色谱柱（4.6×150mm5μm），柱温30℃；流动相为甲醇、0.5%（体积分数）乙酸（体积比为40∶60，pH3.5）等度洗脱；流速为1mL/min；进样量为10μL；检测波长为254nm。
色谱图如图10所示，不能将四种待测激素有效分开。
三、流动相3
（1）标准品混合溶液的配制
同步骤一中（1）。
（2）高效液相色谱检测混合标准品
色谱条件：色谱柱为美国Waters公司生产的CNWSIL C18液相色谱柱（4.6×150mm5μm），柱温30℃；流动相为乙腈、0.5%（体积分数）乙酸（体积比为50∶50，pH3.5）等度洗脱；流速为1mL/min；进样量为10μL；检测波长为254nm。
色谱图如图11所示，不能将四种待测激素有效分开。
四、流动相4
（1）标准品混合溶液的配制
同步骤一中（1）。
（2）高效液相色谱检测混合标准品
色谱条件：色谱柱为美国Waters公司生产的CNWSIL C18液相色谱柱（4.6×150mm5μm），柱温30℃；流动相为甲醇、乙腈、0.5%（体积分数）乙酸（体积比为30：10∶60，pH3.5）等度洗脱；流速为1mL/min；进样量为10μL；检测波长为254nm。
色谱图如图12所示，不能将四种待测激素有效分开。
Claims (7)
1.一种高效液相色谱测定橡胶树中生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素的方法，包括如下步骤：
(1)样品前处理：将待检测的橡胶树组织研磨后，置于抽提液中抽提，离心，向离心后的上清液中加入相当于所述上清液1/300体积的氨水后，用旋转蒸发仪40℃真空蒸发，去除有机相，得到水相，并用0.1mol/L稀盐酸调节所述水相的pH值到3.0，0.22μm针式过滤器过滤后过层析柱，用甲醇洗脱，获得待测样品；
所述层析柱为PXC反相保留阳离子交换柱；
所述抽提液的溶质为2,6-二叔丁基对甲苯酚，溶剂为体积百分含量为80％的甲醇水溶液；所述2,6-二叔丁基对甲苯酚在所述抽提液中的含量为每100mL所述抽提液中含有0.1g所述2,6-二叔丁基对甲苯酚；
(2)高效液相色谱检测：采用C18反相色谱柱，以甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲液的混合液为流动相，以254nm为检测波长，检测步骤(1)获得的待测样品中的生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸；
所述流动相中，所述甲醇、所述乙腈和所述磷酸盐缓冲液的体积比为15：15：70；所述流动相的pH为3.5。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的样品前处理于黑暗条件下进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述抽提液的用量为每0.5克所述待测橡胶树组织样品加入15ml所述抽提液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的高效液相色谱检测，柱温为30℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的高效液相色谱检测，洗脱方式为等度洗脱，流速为1mL/min，进样量为10μL。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述橡胶树组织为橡胶树的叶片、枝条或树皮。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述橡胶树为巴西橡胶树。
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