CN103173538B

CN103173538B - 用于检测hla-b*1301基因的试剂盒

Info

Publication number: CN103173538B
Application number: CN201310009785.4A
Authority: CN
Inventors: 王宝玺; 王洪生
Original assignee: INSTITUTE OF DERMATOLOGY CHINESE ACADEMY OF MEDICAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF DERMATOLOGY CHINESE ACADEMY OF MEDICAL SCIENCES
Priority date: 2013-01-11
Filing date: 2013-01-11
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2033-01-11
Also published as: CN103173538A

Abstract

本发明公开了用于检测HLA-B*1301基因的试剂盒，由以下组分组成：2*PCR Mix，目的基因检测 mix，内参基因检测 mix、阳性对照组pMED-B*1301和去离子水。其中，目的基因检测 mix包括5’-ggtctcacatcatccagagg-3’、下游引物5’-ttcctctgcgacgtcgcg-3’；内参基因检测 mix包括上游引物beta-F：5’- ctgggacgacatggagaaaa-3’，下游引物beta-R：5’- aaggaaggctggaagagtgc-3’。由于HLA-B*1301和DHS有着密切的关系，并有可能成为中国人群预测氨苯砜过敏综合症发病率的生物标志物。本发明通过研发试剂盒检测氨苯砜过敏综合症的预测标记HLA-B*1301，可以对麻风病患者氨苯砜过敏综合症监测，具有十分重要的临床意义。

Description

用于检测HLA-B*1301基因的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于对HLA-B*1301基因进行SYBR Green检测的试剂盒。

背景技术

麻风病是由麻风分枝杆菌引起的一种慢性疾病，它的特征是外周神经和皮肤缓慢进展性损伤，如果不及时治疗，可能会导致畸形衰弱。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)报道，2011年初有192246案例麻风病开始在全球流行注册，2010年有228474新病例在全球被发现。1949年以来，我国有超过49万麻风患者被确诊，在最近的一段时间里，每年大约1800名新病例被报道。

20世纪40年代，科学家发现氨苯砜(4，40-diaminodipheny-1sulfone，DDS)能有效地治疗麻风病。然而，在20世纪60年代，麻风分枝杆菌对此产生耐药性。1949年氨苯砜过敏综合症(Dapsone hyper sensitivity syndrome，DHS)首次被确诊，其症状包括发热、剥脱性皮炎及肝炎[LOWE J，SMITH M.Thechemotherapy of leprosy in Nigeria；with an appendix on glandular feverand exfoliative dermatitis precipitated by sulfones.Int J Lepr.1949Jul-Sep；17(3)：181-95]。麻风患者中氨苯砜过敏综合症的发生率约为2％，其药物不良反应会导致12.5％的死亡率，DHS能潜在威胁麻风病患者的生命[Pandey B，Shrestha K，Lewis J，Hawksworth RA，Walker SL.Mortality dueto dapsone hypersensitivity syndrome complicating multi-drug therapyfor leprosy in Nepal.Trop Doct2007；37(3)：162-3]。目前，DHS已经在中国被报道且成为一个重要的导致麻风病患者死亡的因素。

氨苯砜过敏综合症的原理仍知之甚少。一些学者提出了几种假设：DHS可能包括I型，IV型，也许是III型过敏症反应；或者，DHS也许会导致移植物抗宿主反应介导的T淋巴细胞的活化，一些严重的与各种药物相关的不良反应被报道[Knowles SR，Shapiro LE，Shear NH.Reactive metabolites andadverse drug reactions：clinical considerations.Clin Rev AllergyImmunol.2003；24：229-38]。通过对中国西南地区的1058个麻风病病人进行研究，发现HLA-B*1301单倍体的存在与DHS的发展有着紧密联系。已有报道的HLA-B*1301等位基因与三氯乙烯(trichloroethylene，TCE)作用所引起的过敏性皮炎有着紧密联系[Narasimha Rao P，Lakshmi TS.Increase in theincidence of dapsone hypersensitivity syndrome-an appraisal.LeprRev2001；72：57-62]。因此，开展HLA-B*1301基因的检测，对有可能发生氨苯砜过敏综合症具有十分重要的临床意义。

人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)***比较复杂，自1958年Jean Dausset发现第一个HLA抗原以来，HLA便成为免疫生物学和生物化学等学科中一个新兴研究领域。HLA按分布和功能分为I类抗原和II类抗原：HLA I类抗原由HLA-A、B、C位点编码；HLA II类抗原由HLA-D区编码。

人白细胞抗原等位基因HLA-B*1301位于人类第六条染色体上，属于HLA-B中的一型。目前，对该基因的检测方法主要包括：血清学检测、流式细胞仪检测及特异寡核苷酸探针(Sequence specific oligonucleotide probe，SSOP)检测法。血清学对HLA进行分型，但常因为高质量的抗血清难于获得或抗血清之间存在交叉反应而导致结果错误。流式细胞仪检测法主要检测细胞表面抗原的表达，通过抗原的表达量来确定是否有该基因的表型。该方法需对检测样本进行预处理，但处理方法或时间上的不同，有时会影响细胞表面抗原的表达，从而影响结果判断。SSOP是一种新型HLA中DNA分型方法，结果准确，但步骤繁琐、耗时长。因此临床上急需一种相对特异性高、灵敏度高及效率快的检测HLA-B*1301基因的试剂盒。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于对HLA-B*1301基因进行SYBRGreen检测的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：用于检测HLA-B*1301基因的引物在诊断麻风病患者氨苯砜过敏综合症制剂中的应用，所述引物包括上游引物5’-ggtctcacatcatccagagg-3’、下游引物3’-ttcctctgcgacgtcgcg-5’

本发明的有益效果是：

由于HLA-B*1301和DHS有着密切的关系，并有可能成为中国人群预测DHS发病率的生物标志物。通过研发试剂盒检测DHS的预测标记HLA-B*1301，可以对麻风病患者氨苯砜过敏综合症监测，具有十分重要的临床意义。

具体实施方式

一、实验方法

1、患者

2010年6月至2012年6月在中国西南地区，这项研究共有1058个积极的麻风病患者。在每次访问中，一位临床医生记录着患者治疗史和药物不良反应的细节。使用标准的诊断标准，DDS个人的医疗记录被临床医生(Yan LB)审查。临床形态学按照Richardus and Smith的诊断标准：(i)至少有两个迹象或症状，如发热、皮疹、***肿大或肝脏异常(肝肿大、黄疸、或肝功能测试错乱)；(ii)在氨苯砜治疗开始二和八周之间症状出现和停药后消失；(iii)症状不归属于任何其他药物的刺激；(iv)症状不引起麻风反应；(v)没有其他疾病可能引起类似的症状。

DHS、110DDS耐受对照和110健康对照的21病例被纳入病例对照研究。这项研究是由国家机构审查委员会的批准，并获得所有参与者的知情同意书。

2、实验

实验一DHS生物标志物的确定

(1)提取病例样本的基因组DNA。

(2)引物软件设计PCR引物(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)。用序列特异性引物扩增HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLADQB1型的HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DR所有外显子。

(3)纯化后的PCR产物用虾碱酶和核酸外切酶及ABI的BigDye3.1试剂盒用于测序，测序反应与乙醇纯化之后，产物进行毛细管电泳；

(4)获得20例DHS、102DDS耐受对照，和108名健康对照完整的测序数据。

(5)通过测序获得基因型信息，与已知的单倍型序列的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1和HLADQB1(http://hla.all-eles.org/)相比获得基因型信息和每个样品的等位基因；也可以参考这些等位基因的频率信息(http://www.allelefrequencies.net)。

(6)采用Fisher精确检验进行组间基因型频率比较。调整多重比较，对所有被观察的等位基因用Bonferroni’s方法计算p(pc)值。相对风险用优势率(odds ratios，OR)和95％置信区间(confidence intervals，CI)来估计。

实验二对HLA-B*1301基因引物的设计及重组质粒对照品制备

(1)参照GenBank收录的HLA-B*1301基因全序列，选择HLA-B*1301基因的第2和第3外显子设计合成引物。针对HLA-B*1301基因，共设计了一组目的基因上、下游引物(B-1301-F和B-1301-R)，同时还设计了用于检测beta-actin内参基因的上、下游引物，序列如下：

B-1301：上游引物(B-1301-F)：5’-ggtctcacatcatccagagg-3’；

下游引物(B-1301-R)：5’-tcctctgcgacgtcgcgcgcc-3’。

Beta：上游引物(Beta-F)：5’-ctgggacgacatggagaaaa-3’；

下游引物(Beta-R)：5’-aaggaaggctggaagagtgc-3’。

(2)上海生工公司合成HLA-B*1301基因序列，并克隆至pMED18-T载体(Novengen公司)，得到重组载体pMED-B*1301。

实验三HLA-B*1301基因的检测试剂盒的制备

本实施例用于对HLA-B*1301基因进行SYBR Green检测的试剂盒包括以下组分(20次反应量)：2*PCR Mix250uL，目的基因检测mix(包括上、下游引物、B-1301-F和B-1301-R，10un/uL)50uL，内参基因检测mix(该mix中已经包括上、下游引物beta-F和beta-R，10um/uL)50ul，去离子水150uL。另外阳性对照组pMED-B*1301附带于试剂盒内。以上组分共同包装，得到检测HLA-B*1301基因的SYBR Green试剂盒。本发明中试剂建议保存条件为-20℃保存。经实验，从-20℃中取出后，将试剂保存在4℃，长达一月未见性能下降。

实验四临床样本HLA-B*1301试剂盒PCR检测

(1)将DHS、DDS耐受对照和健康对照的9病例样本基因组DNA作为模板，以重组质粒pMED-B*1301为阳性对照，无菌水为阴性对照组。

(2)用B-1301引物和beta-actin内参基因引物进行HLA-B*1301基因的SYBR Green法检测。每份样本重复平行检测3次。检测体系为25uL，依次加入下列成分：2*PCR Mix(购自Thermo公司)12.5uL，目的基因检测mix(上、下游引物混合液，各1uL，10um/uL)或内参基因检测mix(上、下游引物混合液，各1.25uL，10um/uL)2.5ul，样品DNA2uL(25-100ng)，去离子水8uL。

(3)反应条件为：先热启动95℃10min，1个循环；然后变性95℃15sec，退火71℃1min，共35个循环；最后熔解95℃15s，60℃1min，95℃30sec，60℃15sec。

二、结果

1、基因分型确定DHS生物标志物

与对照组相比，等位基因DQB1和DRB1与DHS的发生没有显着的关联。然而，相对于对照组而言，等位基因B*1301在DHS患者中频率发生增加(表1)。特别是90％(18/20)的DHS病人，HLA-B*1301只存在于5.9％(6/103)的DDS耐受对照和13.0％(14/108)健康对照组。当控制DDS耐受组，B*1301阳性预测值为72％，阴性预测值为98％。对DHS筛选试验，HLA-B*1301等位基因有100％的敏感性和94.1％的特异性。分析结合点等位基因分布，找到紧密连接点保守基因。定义原始单体为B*1301。DHS患者体内存在95％的B*1301，而DDS耐受患者只有3.9％(表2)。

表1病例和对照组中HLA等位基因频率

个体频率(数量和百分比)或原始单体B*1301结合点在麻风病人中显示DHS(n＝20)、在DDS耐受者(n＝103)及正常受试者(n＝108)。

2、临床样本检测

结果首先看是否出现目的荧光扩增曲线，其次还需看CT值。以18份病例中，DHS病例组出现HLA-B*1301基因荧光曲线，而DD耐受组、健康组均无该目的荧光扩增曲线。根据CT值对结果做进一步的判段：出现荧光扩增曲线且当内参基因CT值小于或等于23，目的基因CT值小于或等于30时，如果两者的CT差值小于等于7，那么结果为HLA-B*1502阳性，若两者的CT差值大于7，则结果为阴性；当内参基因CT值小于或等于23时，目的基因CT值大于30或未出现荧光扩增曲线，那么结果为阴性；若内参基因的CT值大于23，提示DNA模板量不足，或存在PCR的抑制因素，需要重新提取DNA进行检测。因为当CT值大于30后，检测结果就不准确了，即使出现扩增曲线也无法判读为阳性。CT值检测结果如表2所示，与荧光扩增的检测结果一致，表明用本发明的方法可用于HLA-B*1301基因检测。

表2SYBR Green法检测HLA-B*1301基因的20份临床样本的CT值

样本	HLA-B*1301基因的CT值	内参基因的CT值	结果
				阳性对照	30.3	23.9	阳性
DHS病例一	26.7	21.8	阳性
				DHS病例二	27.1	22.1	阳性
DHS病例三	26.5	20.5	阳性
				DHS病例四	25.8	19.9	阳性
DHS病例五	26.1	20.7	阳性
				DHS病例六	27.3	21.2	阳性
DDS耐受组一	未检出	22.3	阴性
				DDS耐受组二	未检出	22.1	阴性
DDS耐受组三	未检出	21.6	阴性
				DDS耐受组四	未检出	21.9	阴性
DDS耐受组五	未检出	20.5	阴性
				DDS耐受组六	未检出	20.9	阴性
健康组一	未检出	19.7	阴性

健康组二	未检出	20.3	阴性
				健康组三	未检出	18.9	阴性
健康组四	未检出	20.5	阴性
				健康组五	未检出	21.4	阴性
健康组六	未检出	22.1	阴性
				阴性对照	未检出	21.6	阴性

3、讨论

DHS是一种严重危及生命的临床综合征。中国南方人口中，HLA-B*13中成员之一HLA-B*1301等位基因，是一个特定的亚洲人的等位基因，在白人和黑人中不存在。与之相比，在白人中HLA-B*1302是HLA-B*13组主要的等位基因。目前，DHS预防和管理的实践准则表明DDS开始治疗后，在一段时间间隔内准确识别早期暗示性症状，症断后需立即DDS治疗。在设计中，本研究支持的一个重要的和立即适用的HLA分型的临床作用，即阳性和阴性预测值(分别为82.6％和99％)与HLA-B*1301单倍型的存在相关。因此，本研究希望DHS基因检测的预测值可以适当用于检查和普及。

通过对中国西南地区的1058个连续处理DDS的麻风病病人进行研究，主要发现HLA-B*1301单倍体的存在与DHS的发展有着紧密联系。这一数据发现为麻风病患者防止药物过敏诊断具有十分重要意义。对此，本实施例根据所得数据，特研制荧光定量PCR试剂盒进行检测HLA-B*1301基因的表达量，对样本进行检测，结果表明，在DHS患者体内HLA-B*1301基因阳性率很高，而DDS耐受组和健康组该基因则阳性率很低，这足以说明试剂盒检测HLA-B*1301基因可行性。检测结果与统计数据十分吻合，这为我们进一步用于临床用药提供依据。

总之，HLA-B*1301已经展示出和DHS有着密切的关系，并有可能成为中国人群预测DHS发病率的生物标志物。通过本实施例所研发的试剂盒检测DHS的预测标记HLA-B*1301，可以对麻风病患者氨苯砜过敏综合症监测，具有十分重要的临床意义。

本实施例所使用的RT-PCR(Real time Polymerase Chain Reaction)技术兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱精确定量的优点，能直接监测PCR过程中的变化。产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险。

本实施例所用到的SYBR Green荧光染料，它是能与DNA双链结合，并发出荧光；脱离DNA双链时，荧光信号又会急剧减弱。因此，反应体系内，信号强度代表了双链DNA分子的数量。荧光PCR检测的基本过程是：1、开始阶段，SYBR Green染料与DNA双链结合发出荧光。2、变性阶段，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减弱。3、聚合延伸阶段，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成阶段，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR***检测到荧光的净增量加大。5、融解曲线的检测，确保DNA产物的特异性。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims

1.用于检测HLA-B*1301基因的引物在制备诊断麻风病患者氨苯砜过敏综合症制剂中的应用，其特征在于，所述引物包括上游引物5’-ggtctcacatcatccagagg-3’、下游引物3’- ttcctctgcgacgtcgcg -5’。