CN103173427A - 一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法。该方法所用的黑曲霉在液体培养基中生长96小时,能够分泌表达β-甘露聚糖酶。甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃,最适pH值在2-6之间,在70℃时,保温20分钟,酶的催化活性损失不超过40%,具有较好的耐热性。在摇瓶条件下,发酵活力最高达到1200U/mL,具有用于饲料添加剂的潜在前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法,本发明还涉及一种饲料添加剂。
背景技术
玉米-豆粕型日粮是我国饲养单胃动物的主要日粮,大豆中所含有的甘露聚糖有很强的抗营养作用。目前,我国每年大豆进口量为4000万吨左右,其中80%以上用于饲料工业。甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分,是由β-1,4-D吡喃甘露糖连接而成的线状多糖,豆粕中甘露聚糖的含量在1.2%以上。甘露聚糖具有高亲水性,在单胃动物的消化道内大量吸水,增加了消化道内容物的粘度,抵抗胃肠的蠕动,直接影响动物对营养物质的消化吸收,***物中因含有较多的有机物而造成养殖场环境污染。
甘露聚糖的完全酶解需要β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶等多种酶的协同作用。其中β-甘露聚糖酶能够高效降解甘露聚糖的粘度,在饲料中的应用比较广泛。β-甘露聚糖酶是一类能水解甘露聚糖的半纤维素酶类,广泛存在于动植物和微生物中。
β-甘露聚糖酶能降解饲料中的甘露聚糖,不仅可以消除甘露聚糖的抗营养作用,同时生成的甘露寡糖在动物生产中起着重要的作用。试验证明:甘露寡糖能提高仔猪日增重和饲料转化率,其原因可能是其提高了仔猪的免疫力,抑制了病原菌在胃肠道的增殖。另外,甘露寡糖还具有一定的免疫原性,能够刺激机体免疫应答,与病毒、毒素结合,减缓抗原的吸收,调节肠道的菌群平衡,干扰病原菌的定植。研究还发现,甘露寡糖能够显著提高无菌仔猪血清和肠粘膜中IgA、IgG和IgM的含量及血液中白细胞介素-2的水平,增强T淋巴细胞功能和小肠原始淋巴细胞的活性,增强小肠内白细胞的吞噬能力和促进淋巴细胞释放IFN-γ细胞素。邵良平等报道,甘露寡糖能极显著提高仔猪白细胞分化抗体CD3的水平。近年来,关于甘露寡糖吸附霉菌毒素的研究也越来越受到人们的重视,甘露寡糖可结合玉米赤霉烯酮,通过物理吸附或直接结合霉菌毒素,且不影响其他饲料成分。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法。
该黑曲霉(Aspergillus niger)YM33182,直接接来源于曹云鹤处,间接来源为陈有为,该菌种已于2006年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏 编号为:CCTCCNo M206113。
一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法,其特征在于,所述黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶方法的步骤如下:
(一)制备发酵菌种:将斜面培养的黑曲霉(Aspergillus niger)YM33182经液体菌种斜面菌种培养和一级液体培养后,得到发酵菌种;其具体过程是:
1)斜面菌种:使用土豆培养基,将4℃冰箱保存的菌种划线接种到培养基上,在30-35℃条件下,摇瓶种子培养基培养24-72小时,待孢子长满后,用无菌冷却水洗下;
2)一级液体培养:用一支斜面试管用10ml无菌水,制备孢子悬液,使得孢子含量在1×108CFU/ml以上,取1ml孢子悬液接种到250ml种子培养基中,在25-35℃、250rpm条件下瓶培养8-48小时,获得种子发酵液;
(二)利用上述得到的菌种发酵生产β-甘露聚糖酶:
3)、利用得到的菌种发酵生产β-甘露聚糖酶是采用液体发酵方法生产,使用的发酵培养基配方以重量份数计包括:玉米粉35-45份、豆粕11-14份、硫酸铵1-2份、K2HPO4 3.5-4.5份,魔芋粉0.5-1.0g,溶于1000mL,蒸馏水中,调节pH值,高压灭菌。
2、根据权利要求1所述的一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法,其特征在所述液体发酵培养基中测定甘露聚糖酶的活力在60-84小时,酶活力最高;所述液体发酵培养基酶的最佳催化pH在2-6.0有较高的催化活力;
3、根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述液体发酵培养基产生的酶在60-70度有较好的耐热性;
4、根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述土豆培养基配方以重量份数计包括:土豆去皮切碎,15-25份;蔗糖,1.5-2.5份;琼脂1-2.0份;自来水100份,水∶原料=1∶0.015-0.2;
5、根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述灭菌条件是:115-125℃高压灭菌15-25分钟;
6、根据权利要求1所述的一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法,其特征在于利用 黑曲霉发酵得到的酸性β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖。
7、根据权利要求6所述的酸性β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖,其特征在于:所述甘露聚糖为魔芋精粉和玉米粉。
本发明的黑曲霉在液体培养基中生长96小时,能够分泌表达β-甘露聚糖酶。甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃,最适pH值在2-6之间,在70℃时,保温20分钟,酶的催化活性损失不超过40%,具有较好的耐热性。在摇瓶条件下,发酵活力最高达到1200U/mL,具有用于饲料添加剂的潜在前景。
附图说明
图1是发酵不同时间点的上清液甘露聚糖酶的酶活力(U/ml);
图2是不同温度条件下甘露聚糖酶的相对活力(百分数%);
图3是甘露聚糖酶在不同pH条件下的相对催化活力(百分数%);
具体实施方式
DNS试剂的配制:称取酒石酸钾钠91.0g,溶于500mL水中,加入3,5-二硝基水杨酸3.15g、NaOH 20.0g,不超过50℃水浴溶解;再加入苯酚2.5g、无水亚硫酸钠2.5g,搅拌溶解,冷却后定容至1000mL;储存于棕色瓶中,放置一周后使用。
β-甘露聚糖酶酶活的测定(DNS法):取待测溶液1mL,加入1mL 0.8%(质量百分含量)甘露聚糖溶液,恒温水浴中反应20min,然后加入2.5mL DNS试剂(终止反应)。沸水浴煮5min,然后冷却至室温,用蒸馏水定容至12.5mL,测OD540。
在pH6.0和37℃条件下,每分钟从底物半乳甘露聚糖(Sigma,G0753)中水解产生1μmol的甘露糖的所需的酶量定义为1个酶活单位,用U表示。
实施例1:制备黑曲霉发酵菌种
斜面培养基:土豆培养基(土豆去皮切碎,20g;蔗糖,2.0g;琼脂1.5g;自来水100mL,120℃高压灭菌20分钟);摇瓶种子培养基:土豆培养基(不含琼脂)。将4℃冰箱保藏的菌种接种于斜面培养基,30℃培养48hr,待孢子长满后,用无菌冷却水洗下。一支斜面试管用10ml无菌水,制备孢子悬液,孢子的含量在108CFU/ml以上。在250mL种子培养基中接种1mL孢子悬液。30℃、250rpm摇瓶培养20hr,获得种子发酵液。
实施例2:黑曲霉摇瓶发酵生产β-甘露聚糖酶工艺
发酵培养基配方:玉米粉40g、豆粕12.5g、硫酸铵1.5g、K2HPO4 4.0g,魔芋粉0.75g,溶于1000mL,蒸馏水中,调节pH值至6.2,120℃高压灭菌20分钟。500mL摇瓶装液量 60mL。按照1∶1000的比例接种种子液,30℃、250rpm连续震荡培养96hr,每隔12hr取发酵液1mL,12000rpm离心,取上清液在pH6.0和37℃条件下测定甘露聚糖酶的活力。结果见图1。
实施例3:β-甘露聚糖酶的酶学性质
1、最适温度的测定:分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃条件下测定酶的相对催化活力。酶的最佳催化温度为40℃,在30-60℃范围内,均保持在最佳催化活性的60%以上。结果见图2。
2、最适催化pH值的测定:分别在2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0缓冲液中,测定酶的催化活性。酶的最佳催化pH4.0,在2.0-5.0范围内都有较高的催化活力。结果见图3。
3、温度稳定性的测定:把粗酶液分别在60℃、70℃和80℃保温20分钟,然后在最适催化条件下测定剩余酶。与未经加热处理的酶的活力相比较,计算残余酶活。该甘露聚糖酶在70℃保温20分钟还有55%的残余酶活,该酶具有较好的耐热性。结果见表1。
表1、甘露聚糖酶的耐热性
处理温度(℃) | 30 | 60 | 70 | 80 |
残余酶活(%) | 100 | 82 | 55 | 27 |
实施例4:粗酶液酶解魔芋粉制备甘露寡糖
准确称取10g魔芋粉,溶于灭菌水中,定容至100mL,边加热边搅拌,使之充分溶解,制备10%溶液。将50mL魔芋粉溶液与10mL发酵上清液(酶活力1000U/mL)混合,置于40℃水浴中保温5小时,期间每隔10分钟搅拌1次。另外50mL魔芋粉溶液中加入10mLNa2HPO4-柠檬酸缓冲液(pH6.0)为空白对照。反应完成后,取样品测定甘露寡糖的含量。结果表明,约70%的甘露聚糖降解成甘露寡糖。
Claims (7)
1.一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法,其特征在于,所述黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶方法的步骤如下:
(一)制备发酵菌种:将斜面培养的黑曲霉(Aspergillus niger)YM33182经液体菌种斜面菌种培养和一级液体培养后,得到发酵菌种;其具体过程是:
1)斜面菌种:使用土豆培养基,将4℃冰箱保存的菌种划线接种到培养基上,在30-35℃条件下,摇瓶种子培养基培养24-72小时,待孢子长满后,用无菌冷却水洗下;
2)一级液体培养:用一支斜面试管用10ml无菌水,制备孢子悬液,使得孢子含量在1×108CFU/ml以上,取1ml孢子悬液接种到250ml种子培养基中,在25-35℃、250rpm条件下瓶培养8-48小时,获得种子发酵液;
(二)利用上述得到的菌种发酵生产β-甘露聚糖酶:
3)、利用得到的菌种发酵生产β-甘露聚糖酶是采用液体发酵方法生产,使用的发酵培养基配方以重量份数计包括:玉米粉35-45份、豆粕11-14份、硫酸铵1-2份、K2HPO4 3.5-4.5份,魔芋粉0.5-1.0g,溶于1000mL,蒸馏水中,调节pH值,高压灭菌。
2.根据权利要求1所述的一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法,其特征在所述液体发酵培养基中测定甘露聚糖酶的活力在60-84小时,酶活力最高;所述液体发酵培养基酶的最佳催化pH在2-6.0有较高的催化活力;
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述液体发酵培养基产生的酶在60-70度有较好的耐热性;
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述土豆培养基配方以重量份数计包括:土豆去皮切碎,15-25份;蔗糖,1.5-2.5份;琼脂1-2.0份;自来水100份,水∶原料=1∶0.015-0.2;
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述灭菌条件是:115-125℃高压灭菌15-25分钟;
6.根据权利要求1所述的一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法,其特征在于利用黑曲霉发酵得到的酸性β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖。
7.根据权利要求6所述的酸性β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖,其特征在于:所述甘露聚糖为魔芋精粉和玉米粉。
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