CN103173427A - 一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法。该方法所用的黑曲霉在液体培养基中生长96小时，能够分泌表达β-甘露聚糖酶。甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃，最适pH值在2-6之间，在70℃时，保温20分钟，酶的催化活性损失不超过40％，具有较好的耐热性。在摇瓶条件下，发酵活力最高达到1200U/mL，具有用于饲料添加剂的潜在前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法，本发明还涉及一种饲料添加剂。
背景技术
玉米-豆粕型日粮是我国饲养单胃动物的主要日粮，大豆中所含有的甘露聚糖有很强的抗营养作用。目前，我国每年大豆进口量为4000万吨左右，其中80％以上用于饲料工业。甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，是由β-1，4-D吡喃甘露糖连接而成的线状多糖，豆粕中甘露聚糖的含量在1.2％以上。甘露聚糖具有高亲水性，在单胃动物的消化道内大量吸水，增加了消化道内容物的粘度，抵抗胃肠的蠕动，直接影响动物对营养物质的消化吸收，***物中因含有较多的有机物而造成养殖场环境污染。
甘露聚糖的完全酶解需要β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶等多种酶的协同作用。其中β-甘露聚糖酶能够高效降解甘露聚糖的粘度，在饲料中的应用比较广泛。β-甘露聚糖酶是一类能水解甘露聚糖的半纤维素酶类，广泛存在于动植物和微生物中。
β-甘露聚糖酶能降解饲料中的甘露聚糖，不仅可以消除甘露聚糖的抗营养作用，同时生成的甘露寡糖在动物生产中起着重要的作用。试验证明：甘露寡糖能提高仔猪日增重和饲料转化率，其原因可能是其提高了仔猪的免疫力，抑制了病原菌在胃肠道的增殖。另外，甘露寡糖还具有一定的免疫原性，能够刺激机体免疫应答，与病毒、毒素结合，减缓抗原的吸收，调节肠道的菌群平衡，干扰病原菌的定植。研究还发现，甘露寡糖能够显著提高无菌仔猪血清和肠粘膜中IgA、IgG和IgM的含量及血液中白细胞介素-2的水平，增强T淋巴细胞功能和小肠原始淋巴细胞的活性，增强小肠内白细胞的吞噬能力和促进淋巴细胞释放IFN-γ细胞素。邵良平等报道，甘露寡糖能极显著提高仔猪白细胞分化抗体CD3的水平。近年来，关于甘露寡糖吸附霉菌毒素的研究也越来越受到人们的重视，甘露寡糖可结合玉米赤霉烯酮，通过物理吸附或直接结合霉菌毒素，且不影响其他饲料成分。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法。
该黑曲霉(Aspergillus niger)YM33182，直接接来源于曹云鹤处，间接来源为陈有为，该菌种已于2006年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏 编号为：CCTCCNo M206113。
一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于，所述黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶方法的步骤如下：
(一)制备发酵菌种：将斜面培养的黑曲霉(Aspergillus niger)YM33182经液体菌种斜面菌种培养和一级液体培养后，得到发酵菌种；其具体过程是：
1)斜面菌种：使用土豆培养基，将4℃冰箱保存的菌种划线接种到培养基上，在30-35℃条件下，摇瓶种子培养基培养24-72小时，待孢子长满后，用无菌冷却水洗下；
2)一级液体培养：用一支斜面试管用10ml无菌水，制备孢子悬液，使得孢子含量在1×108CFU/ml以上，取1ml孢子悬液接种到250ml种子培养基中，在25-35℃、250rpm条件下瓶培养8-48小时，获得种子发酵液；
(二)利用上述得到的菌种发酵生产β-甘露聚糖酶：
3)、利用得到的菌种发酵生产β-甘露聚糖酶是采用液体发酵方法生产，使用的发酵培养基配方以重量份数计包括：玉米粉35-45份、豆粕11-14份、硫酸铵1-2份、K2HPO4 3.5-4.5份，魔芋粉0.5-1.0g，溶于1000mL，蒸馏水中，调节pH值，高压灭菌。
2、根据权利要求1所述的一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法，其特征在所述液体发酵培养基中测定甘露聚糖酶的活力在60-84小时，酶活力最高；所述液体发酵培养基酶的最佳催化pH在2-6.0有较高的催化活力；
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液体发酵培养基产生的酶在60-70度有较好的耐热性；
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述土豆培养基配方以重量份数计包括：土豆去皮切碎，15-25份；蔗糖，1.5-2.5份；琼脂1-2.0份；自来水100份，水∶原料＝1∶0.015-0.2；
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述灭菌条件是：115-125℃高压灭菌15-25分钟；
6、根据权利要求1所述的一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于利用 黑曲霉发酵得到的酸性β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖。
7、根据权利要求6所述的酸性β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖，其特征在于：所述甘露聚糖为魔芋精粉和玉米粉。
本发明的黑曲霉在液体培养基中生长96小时，能够分泌表达β-甘露聚糖酶。甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃，最适pH值在2-6之间，在70℃时，保温20分钟，酶的催化活性损失不超过40％，具有较好的耐热性。在摇瓶条件下，发酵活力最高达到1200U/mL，具有用于饲料添加剂的潜在前景。
附图说明
图1是发酵不同时间点的上清液甘露聚糖酶的酶活力(U/ml)；
图2是不同温度条件下甘露聚糖酶的相对活力(百分数％)；
图3是甘露聚糖酶在不同pH条件下的相对催化活力(百分数％)；
具体实施方式
DNS试剂的配制：称取酒石酸钾钠91.0g，溶于500mL水中，加入3，5-二硝基水杨酸3.15g、NaOH 20.0g，不超过50℃水浴溶解；再加入苯酚2.5g、无水亚硫酸钠2.5g，搅拌溶解，冷却后定容至1000mL；储存于棕色瓶中，放置一周后使用。
β-甘露聚糖酶酶活的测定(DNS法)：取待测溶液1mL，加入1mL 0.8％(质量百分含量)甘露聚糖溶液，恒温水浴中反应20min，然后加入2.5mL DNS试剂(终止反应)。沸水浴煮5min，然后冷却至室温，用蒸馏水定容至12.5mL，测OD540。
在pH6.0和37℃条件下，每分钟从底物半乳甘露聚糖(Sigma，G0753)中水解产生1μmol的甘露糖的所需的酶量定义为1个酶活单位，用U表示。
实施例1：制备黑曲霉发酵菌种
斜面培养基：土豆培养基(土豆去皮切碎，20g；蔗糖，2.0g；琼脂1.5g；自来水100mL，120℃高压灭菌20分钟)；摇瓶种子培养基：土豆培养基(不含琼脂)。将4℃冰箱保藏的菌种接种于斜面培养基，30℃培养48hr，待孢子长满后，用无菌冷却水洗下。一支斜面试管用10ml无菌水，制备孢子悬液，孢子的含量在108CFU/ml以上。在250mL种子培养基中接种1mL孢子悬液。30℃、250rpm摇瓶培养20hr，获得种子发酵液。
实施例2：黑曲霉摇瓶发酵生产β-甘露聚糖酶工艺
发酵培养基配方：玉米粉40g、豆粕12.5g、硫酸铵1.5g、K2HPO4 4.0g，魔芋粉0.75g，溶于1000mL，蒸馏水中，调节pH值至6.2，120℃高压灭菌20分钟。500mL摇瓶装液量 60mL。按照1∶1000的比例接种种子液，30℃、250rpm连续震荡培养96hr，每隔12hr取发酵液1mL，12000rpm离心，取上清液在pH6.0和37℃条件下测定甘露聚糖酶的活力。结果见图1。
实施例3：β-甘露聚糖酶的酶学性质
1、最适温度的测定：分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃条件下测定酶的相对催化活力。酶的最佳催化温度为40℃，在30-60℃范围内，均保持在最佳催化活性的60％以上。结果见图2。
2、最适催化pH值的测定：分别在2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0缓冲液中，测定酶的催化活性。酶的最佳催化pH4.0，在2.0-5.0范围内都有较高的催化活力。结果见图3。
3、温度稳定性的测定：把粗酶液分别在60℃、70℃和80℃保温20分钟，然后在最适催化条件下测定剩余酶。与未经加热处理的酶的活力相比较，计算残余酶活。该甘露聚糖酶在70℃保温20分钟还有55％的残余酶活，该酶具有较好的耐热性。结果见表1。
表1、甘露聚糖酶的耐热性
| 处理温度(℃) | 30 | 60 | 70 | 80 |
| 残余酶活(％) | 100 | 82 | 55 | 27 |
实施例4：粗酶液酶解魔芋粉制备甘露寡糖
准确称取10g魔芋粉，溶于灭菌水中，定容至100mL，边加热边搅拌，使之充分溶解，制备10％溶液。将50mL魔芋粉溶液与10mL发酵上清液(酶活力1000U/mL)混合，置于40℃水浴中保温5小时，期间每隔10分钟搅拌1次。另外50mL魔芋粉溶液中加入10mLNa2HPO4-柠檬酸缓冲液(pH6.0)为空白对照。反应完成后，取样品测定甘露寡糖的含量。结果表明，约70％的甘露聚糖降解成甘露寡糖。
Claims (7)
1.一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于，所述黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶方法的步骤如下：
(一)制备发酵菌种：将斜面培养的黑曲霉(Aspergillus niger)YM33182经液体菌种斜面菌种培养和一级液体培养后，得到发酵菌种；其具体过程是：
1)斜面菌种：使用土豆培养基，将4℃冰箱保存的菌种划线接种到培养基上，在30-35℃条件下，摇瓶种子培养基培养24-72小时，待孢子长满后，用无菌冷却水洗下；
2)一级液体培养：用一支斜面试管用10ml无菌水，制备孢子悬液，使得孢子含量在1×108CFU/ml以上，取1ml孢子悬液接种到250ml种子培养基中，在25-35℃、250rpm条件下瓶培养8-48小时，获得种子发酵液；
(二)利用上述得到的菌种发酵生产β-甘露聚糖酶：
3)、利用得到的菌种发酵生产β-甘露聚糖酶是采用液体发酵方法生产，使用的发酵培养基配方以重量份数计包括：玉米粉35-45份、豆粕11-14份、硫酸铵1-2份、K2HPO4 3.5-4.5份，魔芋粉0.5-1.0g，溶于1000mL，蒸馏水中，调节pH值，高压灭菌。
2.根据权利要求1所述的一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法，其特征在所述液体发酵培养基中测定甘露聚糖酶的活力在60-84小时，酶活力最高；所述液体发酵培养基酶的最佳催化pH在2-6.0有较高的催化活力；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液体发酵培养基产生的酶在60-70度有较好的耐热性；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述土豆培养基配方以重量份数计包括：土豆去皮切碎，15-25份；蔗糖，1.5-2.5份；琼脂1-2.0份；自来水100份，水∶原料＝1∶0.015-0.2；
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述灭菌条件是：115-125℃高压灭菌15-25分钟；
6.根据权利要求1所述的一种利用黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于利用黑曲霉发酵得到的酸性β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖。
7.根据权利要求6所述的酸性β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖，其特征在于：所述甘露聚糖为魔芋精粉和玉米粉。
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