CN103173365B - 一种用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法 - Google Patents
一种用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法，所述方法包括如下步骤：（1）采集葡萄霜霉病菌菌样；（2）孢子囊悬浮液的制备；（3）葡萄品种及叶片的选择；（4）孢子囊悬浮液的接种；（5）叶片保湿培养。该方法简单易学，容易操作，对试验仪器要求不高，叶片发病后仍可以在相同环境条件下培养7-10天，且克服了以往葡萄霜霉病接种后难于成活、在室内不能对菌样进行大量繁殖、得不到充足孢子囊悬浮液的缺陷，可用于葡萄霜霉病的监测、致病性测定、药剂筛选等大型试验，具有较高的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法。
背景技术
目前葡萄霜霉病（Grape downy mildew）是葡萄种植中最重要的病害，在我国各葡萄产区均有分布，多发生在雨水较多的地区和年份，在5-6月份开始发生，7-9月为发病盛期。主要危害叶片，也能侵染嫩梢、花序、幼果等幼嫩组织。病害流行年份，病叶焦枯早落，病梢扭曲，发育不良，对树势和产量影响严重。截止2010年，全国葡萄栽培面积达到了552,000hm2，重病区的发病率在70%以上。
葡萄霜霉菌是专性寄生真菌，叶片发病部位产生白色霜状霉层，即病菌的孢子囊及孢子囊梗。自气孔伸出的孢子囊梗上生孢子囊，孢子囊呈卵形或椭圆形，顶端有***状突起，在水中萌发时产生游动孢子。游动孢子呈肾形，在扁平的一侧生有两根鞭毛，能在水中游动，在水中游动变成圆形静止孢子，并同时长出芽管，经气孔侵入寄主。
自然环境中，游动孢子通过雨水溅到葡萄幼嫩组织上，通过气孔侵入组织细胞进行初侵染。经过一定的潜育期，形成初次病斑-组织上的油状斑点，在初次病斑上形成孢子囊梗和孢子囊，孢子囊萌发产生的游动孢子又通过雨露进行再侵染。在整个生长季过程中，只要条件适宜，病菌就会不断进行重复侵染，使病害流行。
葡萄霜霉病菌是专性寄生菌，在培养基上不能分离培养且在室内不能够大量繁殖，这严重限制了葡萄霜霉病菌室内监测抗药性、新药剂的筛选、新药剂抗药性风险评估及致病性分化等研究工作的开展。研究人员不得不只能在短时间内不断地去田间采集该病菌用于试验的需求，这样不但增加了工作量，试验成本也大大提高。因此，迫切需要发明一种简单易行的方法用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌，保证葡萄霜霉病菌的研究工作顺利展开。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法，该方法可在室内大量培养繁殖葡萄霜霉病菌，且简单、易行。
本发明的技术方案是利用葡萄霜霉病菌的侵染循环原理建立的该病菌的培养繁殖方法。具体的，该方法包括如下步骤：
（1）采集葡萄霜霉病菌菌样：在不同地区的葡萄种植区采集葡萄霜霉病菌的病叶，低温0℃-10℃保存带回室内；
（2）孢子囊悬浮液的制备：（A1）将病叶表面杂质和葡萄霜霉病菌表面老熟的孢子囊冲洗掉，在18℃-20℃下黑暗培养24h-32h诱导产生新生的孢子囊；
（A2）将新生孢子囊冲下制成孢子囊含量为1×105个-1.5×105个/mL的孢子囊悬浮液；
（A3）将新生孢子囊悬浮液于4℃预冷20min-30min，室温放置待悬浮液温度为室温时用于接种；
（3）葡萄品种及叶片的选择：葡萄品种采用易感霜霉病品种；叶片选择所述易感品种植株叶龄一致、枝条顶端第一至第三片完全展开的健康叶片；同时，所述葡萄植株及叶片生长期均未用过药且无霜霉病发生；
（4）孢子囊悬浮液的接种：将孢子囊悬浮液用喷雾法离体接种（3）中所述健康葡萄叶片；
（5）叶片保湿培养：（A1）在培养皿中铺有两层无菌水浸湿的滤纸上放置玻璃棒，待叶片接种后立即将接种后的叶片正面朝下放在玻璃棒上，叶片不与滤纸直接接触，叶柄用脱脂棉保湿，将培养皿密封；
（A2）将上述装有叶片的培养皿置于18℃-20℃下黑暗、RH100%条件下培养24h-32h后进行光照培养12h，再进行黑暗培养12h，按此顺序以后每天18℃-20℃下进行12小时光照/黑暗交替培养至霜霉病菌侵染叶片发病产生大量孢子囊，此期间保证足够湿度RH100%。
优选地，本发明的用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法还包括如下步骤：
（6）菌种纯化：待葡萄霜霉病菌侵染叶片开始形成病斑后，剪取某一病斑（病斑面积大小一定）进行单独培养，冲洗单一病斑孢子囊成孢子囊悬浮液，过滤离心，将孢子囊悬浮液稀释成孢子囊含量为1×105个-1.5×105个/mL的孢子囊悬浮液，4℃低温诱导20min-30min，室温下放置一定时间，待孢子囊悬浮液温度为室温时，分散喷于葡萄叶片，逐天进行观察叶片发病情况，待霜霉病斑发生初期，继续对单一病斑进行剪切独立培养，连续重复两次，得到相对比较纯的菌系，同样方法继续扩繁2代获得大量的孢子囊含量为1×105个-1.5×105个/mL葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液；
（7）将（6）中纯化后的孢子囊悬浮液按步骤（4）进行接种，并按步骤（5）进行叶片保湿培养至霜霉病菌侵染叶片发病产生大量孢子囊。
纯化后的霜霉病菌可提高葡萄霜霉病的监测、致病性测定、药剂筛选等大型试验的可重复性和准确性。
优选地，步骤（1）中在我国不同省份的不同葡萄种植区采集葡萄霜霉病菌的病叶，用保温箱低温0℃-10℃保存带回室内。
进一步优选地，步骤（1）中，所述葡萄霜霉病菌菌样的采集是在我国不同省份的不同葡萄种植区采用5点法取样，每点取10个葡萄霜霉病菌的病叶，用保温箱低温0-10℃保存带回室内，进行进一步繁殖。
葡萄霜霉病菌菌样的采集过程中必须低温0-10℃保存带回室内来保证病菌的生活力。
优选地，步骤（2）中（A1）中在18℃下黑暗培养24h诱导产生新生的孢子囊。
具体地，步骤（2）中（A1）中在压力0.08Mpa下用无菌水将病叶表面杂质和霜霉病菌表面老熟的孢子囊冲洗掉，将病叶置于放有湿润滤纸的培养皿中，用保鲜膜将培养皿封口，在18℃下黑暗保湿培养24h诱导产生新生的孢子囊。
所述培养皿可用塑料盒或其他本领域常用的器皿代替。
进一步优选地，步骤（2）中（A1）中用压力0.08MPa的QWJ-150型空压机带动喉头喷雾器将病叶表面杂质和霜霉病菌表面老熟的孢子囊用无菌水冲洗掉。
优选地，步骤（2）中（A2）中在压力0.08Mpa下用无菌水将新生孢子囊洗下来，4号定性滤纸过滤，以2000r/min离心5min，重复离心2次，配制成孢子囊含量为1×105个-1.5×105个/mL的孢子囊悬浮液。
所述4号定性滤纸属于定性滤纸的一种，优选为WhatmanGrade4定性标准滤纸，其加快了流速和增加了负载力，大颗粒和胶状沉淀物保留能力强，可以使孢子囊与杂质充分分离，也可以使用除Grade4定性标准滤纸外的其它型号的滤纸，但有可能分离孢子囊时有一部分不能很好的被过滤或者有些杂质会在过滤时一起进入孢子悬浮液中。
进一步优选地，步骤（2）中（A2）中用压力0.08MPa的QWJ-150型空压机带动喉头喷雾器用无菌水将新生孢子囊洗下来。
优选地，将孢子囊悬浮液的浓度用血球计数板调整为1×105个-1.5×105个/mL。
在压力0.08Mpa下冲洗老熟的孢子囊和新生的孢子囊此时叶片损害程度较轻且孢子囊受到的撞击较小，利于病菌繁殖。新生孢子囊洗下后，离心来提高孢子囊浓度和去杂。
优选地，步骤（2）中（A3）中于4℃20min低温处理，室温放置一段时间待悬浮液温度为室温时用于接种。
制成孢子囊悬浮液后经4℃20min-30min低温处理能够促进游动孢子释放，待悬浮液温度为室温后即可进行接种。
优选地，步骤（3）中，菌种接种及培养过程需严格注意葡萄品种和叶片选择。葡萄品种多采用易感霜霉病品种如欧亚种群赤霞珠，或者采用部分欧美杂交种巨峰、高妻等；叶片有选择性的采集供试葡萄品种叶龄一致、枝条顶端第一至第三片完全展开的健康叶片，此部位叶片接种霜霉病菌最易被霜霉病菌侵染并保证菌种的纯度。需注意的是，所述葡萄植株及叶片生长期均未用过药且无霜霉病发生。
优选地，步骤（4）中所述霜霉病菌混合孢子悬浮液的接种方法为:用压力0.08MPa的QWJ-150型空压机带动喉头喷雾器将孢子囊悬浮液均匀喷雾于叶片背面，液滴在叶片刚好不滑落为宜。
其中，步骤（5）中（A1）中叶片接种后立即将接种后的叶片正面朝下放在玻璃棒上防止叶片短时间内被水浸泡变烂，叶片不与滤纸直接接触，每天注意向培养皿中加水保持滤纸和脱脂棉湿润来保证足够的湿度，用封口膜将培养皿封严确保每个叶片都被均匀保湿。所用培养皿优选为Φ15cm的培养皿。
所述培养皿可用塑料盒或其他本领域常用的器皿代替。
培养过程中叶片正面不与滤纸及皿内无菌水的接触，使得叶片更容易保鲜，叶片为病菌的生长提供更好的营养条件，病菌可以在叶片上长时间生长。
其中，优选地，步骤（5）中（A2）中将所述培养皿置于18℃黑暗条件下保湿RH100%条件下培养24h后进行光照培养12h，使霜霉病菌孢子完成萌发和侵染过程，再进行黑暗培养12h，按此顺序以后每天18℃下进行12h光照/黑暗交替培养，霜霉病菌侵染叶片发病大量产生孢子囊，此期间保证足够湿度RH100%，叶片开始发病后可以维持7-10天，可用于试验或扩繁，保证充足的孢子囊数量。
接种后于18-20℃黑暗条件下保湿RH100%条件下24-32h培养，利于游动孢子的侵染。
本发明的另一目的是提供所述方法在葡萄霜霉病的监测、致病性测定、药剂筛选中的应用。
本发明利用葡萄霜霉病菌的侵染循环原理提供了一种室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法，通常葡萄霜霉病菌不易人工培养，且培养过程中一般发病不均匀，如果继续继代培养生活力会明显下降。本发明提供了一种简单、易行的霜霉菌培养繁殖方法，有效地解决了专性寄生的葡萄霜霉菌培养繁殖的难点，克服了目前常规离体繁殖方法不能用于专性寄生的葡萄霜霉病菌离体大量繁殖的缺点。该方法简单易学，容易操作，对试验仪器要求不高，叶片发病后仍可以在相同环境条件下培养7-10天，且克服了以往葡萄霜霉病接种后难于成活、在室内不能对菌样进行大量繁殖、得不到充足孢子囊悬浮液的缺陷，本发明的方法可用于葡萄霜霉病的监测、致病性测定、药剂筛选等大型试验，为霜霉病科研工作提供了极大的便利，具有较高的实际应用价值。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
所使用的4号定性滤纸为Whatman Grade4定性标准滤纸，货号为1004-090。
若未特别指明，本发明实施例中所用的材料和仪器均可市售获得，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明所述用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法中各处理条件的确定实验如下：
实施例1游动孢子释放的条件
1、材料和方法
（1）采集葡萄霜霉病菌菌样：以河北保定葡萄霜霉病菌菌样为代表，采用5点法取样，每点取10个葡萄霜霉病菌的病叶，用保温箱低温0-10℃保存带回室内；
（2）孢子囊悬浮液的制备：用压力0.08MPa的QWJ-150型空压机带动喉头喷雾器用无菌水将病叶表面杂质和霜霉病菌表面老熟的孢子囊冲洗掉，将病叶置于放有湿润滤纸的培养皿中，用保鲜膜将培养皿封口，在18℃下黑暗保湿培养24小时诱导产生新生的孢子囊；用压力0.08MPa的QWJ-150型空压机带动喉头喷雾器用无菌水将新鲜的孢子囊冲洗下来，Whatman Grade4定性标准滤纸过滤，以2000r/min离心5min，重复离心2次，配制成孢子囊含量为1×105个-1.5×105个/mL的孢子囊悬浮液，置于2mL离心管；
（3）孢子囊悬浮液处理：将（2）中新生孢子囊悬浮液分别进行4℃低温诱导处理0、10、20、30min，处理后于18℃温度下分别采用24h光照、24h黑暗及12h光照/黑暗交替培养；
（4）24h后光学显微镜下10×10倍下观察游动孢子释放情况，调查空孢囊率。
2、试验结果
孢子囊经不同时间低温处理于不同培养条件下的游动孢子释放情况如表1所示，结果表明，葡萄霜霉病菌的孢子囊经4℃低温诱导处理20min后黑暗培养24h，其空孢囊率达到95%，游动孢子基本上全部释放出来，远高于其他培养条件。4℃低温诱导处理20min黑暗培养24h利于游动孢子的释放，可知此方法处理葡萄霜霉病菌孢子囊接种后利于短时间内所有游动孢子侵入叶片气孔进行全面侵染叶片，使得叶片发病均匀。
表1 孢子囊经不同时间低温处理于不同培养条件下的游动孢子释放情况
注：采用邓肯新复极方差分析方法进行显著差异分析。字母代表不同低温处理时间下空孢囊率的显著差异水平；±值代表试验重复之间的标准偏差。
实施例2葡萄品种及叶片的选择
以河北保定葡萄霜霉病菌菌样为代表，葡萄品种选择欧美杂交种高妻。采集葡萄植株每个枝条上枝条顶端第一至第六片完全展开的健康叶片，所述叶片叶龄一致且所述葡萄植株及叶片生长期均未用过药且无霜霉病发生；用无菌水清洗3次，配制孢子囊含量为1×105个-1.5×105个/mL的悬浮液（方法同实施例1），于4℃冰箱20min低温处理后室温放置一段时间，待悬浮液温度为室温时用于接种葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液。接种时用压力0.08MPa的QWJ-150型空压机带动喉头喷雾器将孢子囊悬浮液均匀喷雾于叶片背面，液滴在叶片刚好不滑落为宜。在培养皿中铺有两层无菌水浸湿滤纸上放置玻璃棒，然后将接种后的叶片正面朝下放在玻璃棒上，叶柄用脱脂棉保湿。每天注意向培养皿中加水保持滤纸和脱脂棉湿润来保证足够的湿度，用封口膜将培养皿封严，相同部位叶片各取3片，试验重复3次,18℃黑暗条件下保湿培养24h后进行光照培养12h，再进行黑暗培养12h,按此顺序以后每天进行12h光照/黑暗交替培养。病情不再扩展时进行调查。比较不同部位叶片上葡萄霜霉病菌发病的严重度。
葡萄不同部位叶片对葡萄霜霉病菌侵染的影响结果如表2所示，表明不同部位上叶片对葡萄霜霉病菌侵染有明显影响，即枝条顶端第一至第三片完全展开的健康叶片之间病斑发病百分率没有显著差异，而第四、五、六片完全展开的健康叶片发病百分率明显降低，表明随着叶片所在位置离冠梢越远，叶片对葡萄霜霉病菌的侵入具有一定的抵抗能力。葡萄霜霉病最易侵染枝条顶端第1-3片完全展开的的健康叶片。
表2 葡萄不同部位叶片对葡萄霜霉病菌侵染的影响
注：采用邓肯新复极方差分析方法进行显著差异分析。字母代表不同叶片上葡萄霜霉病发病情况的显著差异水平；±值代表试验重复之间的标准偏差。
实施例3接种浓度的选择
以河北保定葡萄霜霉病菌菌样为代表，葡萄品种选择欧美杂交种高妻。采集葡萄植株枝条顶端第1-3片完全展开的健康叶片，所述叶片叶龄一致且所述葡萄植株及叶片生长期均未用过药且无霜霉病发生；配制孢子囊含量1×103、1×104、1×105、1.5×105个/mL的悬浮液（方法同实施例1），于4℃冰箱20min低温处理后室温放置一段时间，待悬浮液温度为室温时用于接种葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液（方法同实施例2）。在培养皿中铺有两层无菌水浸湿滤纸上放置玻璃棒，然后将接种后的叶片正面朝下放在玻璃棒上，叶柄用脱脂棉保湿。每天注意向培养皿中加水保持滤纸和脱脂棉湿润来保证足够的湿度，用封口膜将培养皿封严，相同部位叶片各取3片，试验重复3次,18℃黑暗条件下保湿培养24h后进行光照培养12h，再进行黑暗培养12h,按此顺序以后每天18℃下进行12h光照/黑暗交替培养，此期间保证足够湿度RH100%，病情不再扩展时进行调查。比较不同接种浓度对葡萄霜霉病菌发病的影响。
接种浓度对葡萄霜霉病菌侵染的影响结果如表3所示，对发病（面积）百分率进行统计，接种浓度为1×105和1.5×105个孢子囊/mL的悬浮液的叶片发病情况之间没有显著差异，而接种浓度为1×103、1×104孢子囊/mL的叶片发病严重度明显降低，表明接种浓度也会对发病的严重程度产生影响，因此，选择1×105-1.5×105个孢子囊/mL的浓度进行接种。
表3 接种浓度对葡萄霜霉病菌侵染的影响
注：采用邓肯新复极方差分析方法进行显著差异分析。字母代表不同浓度接种葡萄霜霉病发病情况的显著差异水平；±值代表试验重复之间的标准偏差。
实施例4河北保定葡萄霜霉病菌培养繁殖过程
1、材料和方法
（1）采集葡萄霜霉病菌菌样：以河北保定葡萄霜霉病菌菌样为代表，采用5点法取样，每点取10个新鲜葡萄霜霉病菌的发病叶片，用保温箱低温0℃-10℃保存带回室内进行进一步繁殖；
（2）孢子囊悬浮液的制备：用压力0.08MPa的QWJ-150型空压机带动喉头喷雾器将病叶表面杂质和霜霉病菌层表面老熟的孢子囊用无菌水冲洗掉，将病叶置于放有湿润滤纸的培养皿中，用保鲜膜将培养皿封口，18℃黑暗条件下保湿培养24h，至产生大量新生孢子囊，用压力0.08MPa的QWJ-150型空压机带动喉头喷雾器冲洗叶片用无菌水洗下新鲜孢子囊，Whatman Grade4定性标准滤纸过滤，以2000r/min离心5min，重复离心2次，配制成孢子囊含量为1×105个-1.5×105个/mL的孢子囊悬浮液，于4℃冰箱20min低温处理后室温放置一段时间，待悬浮液温度为室温时用于接种。
（3）葡萄品种及叶片的选择：从育种基地购买高纯度欧亚种群赤霞珠和欧美杂交种高妻，于大棚内种植成为一年扦插苗，大棚随时注意通风及温湿度管理，葡萄植株全生育期未用药且无霜霉病发生。采集供试葡萄品种和叶龄一致、枝条顶端第一至第三片完全展开的健康叶片，此部位叶片接种霜霉病菌易侵染。
（4）孢子囊悬浮液的接种：用压力0.08MPa的QW-150型空压机带动喉头喷雾器在叶片背面均匀集中喷洒制备好的霜霉菌孢子囊悬浮液，液滴在叶片刚好不滑落为宜。
（5）叶片保湿培养：在培养皿中铺有两层无菌水浸湿滤纸上放置玻璃棒，然后将接种后的叶片立即正面朝下放在玻璃棒上，叶片不与滤纸直接接触，叶柄用脱脂棉保湿。每天注意向培养皿中加水保持滤纸和脱脂棉湿润来保证足够的湿度，用封口膜将培养皿封严，每个品种3片叶子，试验重复3次,将所述装有叶片的培养皿置于18℃黑暗条件下保湿RH100%条件下培养24h后进行光照培养12h，使霜霉病菌孢子完成萌发和侵染过程，再进行黑暗培养12h,按此顺序以后每天18℃下进行12h光照/黑暗交替培养，此期间保证足够湿度RH100%。
（6）菌种纯化：待葡萄霜霉病菌侵染叶片开始形成病斑后，剪取某一病斑（病斑面积大小一定）进行单独培养。冲洗单一病斑孢子成孢子囊悬浮液，游动孢子逐渐产生，Whatman Grade4定性标准滤纸过滤，离心观察孢子囊情况，将孢子囊悬浮液稀释成孢子囊含量为1×105个-1.5×105个/mL的孢子囊悬浮液，4℃低温诱导20min，室温下放置一定时间，悬浮液温度为室温时，分散喷于葡萄叶片，逐天进行观察叶片发病情况，待霜霉病斑发生初期，继续对单一病斑进行剪切独立培养，连续重复两次，得到相对比较纯的菌系，相同方法继续扩繁2代获得大量的孢子囊含量为1×105个-1.5×105个/mL葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液。
（7）再次孢子囊悬浮液的接种：将纯化好的浓度为1×105个-1.5×105个/mL葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液4℃低温诱导20min，室温下放置一定时间，悬浮液温度为室温时，用压力0.08MPa的QW-150型空压机带动喉头喷雾器在叶片背面均匀集中喷洒制备好的霜霉菌孢子囊悬浮液，液滴在叶片刚好不滑落为宜。
（8）叶片保湿培养：同步骤（5）。
（9）葡萄霜霉病发病情况调查：同一地区来源的霜霉菌侵染叶片后在叶片开始发病后记录潜育期（lp）、6天后病情不再扩展调查侵染率（IF）和病斑面积（LA）、产孢能力（SC）及病菌在叶片上的分布情况等。分别将不同品种叶片上的孢子囊用无菌水冲洗下来，使用血球计数板计数，获得单位面积的累积产孢子囊数量。采用DPSv6.55进行统计分析。
侵染率%=发病叶数/叶片总数×100
病斑面积调查：将叶片正面病斑轮廓印在由上海胡卷印刷厂提供，规格为35×50cm的透明的米格纸上，每格0.01cm2，计算每个病菌的发病面积。
发病面积百分率%=病斑总面积/叶片总面积×100
孢子囊总个数/mL=100个小格内孢子囊数/100×400×104×稀释倍数
产孢能力（个/cm2）=孢子囊总个数/叶片总面积
2、试验结果
试验结果如表4所示，结果表明叶片发病较快，发病均匀稳定，产孢能力极高，此种方法又可以在培养箱内控制温湿度,利于保持叶片活力使病菌持续侵染发病。大田整个生长季过程中，只要条件适宜，病菌就会不断进行重复侵染，使病害流行，在室内创造利于病菌侵染循环的条件可以提高葡萄霜霉病的发病能力。
表4 一种用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法在河北保定葡萄霜霉病菌验证结果
注：±值代表试验三次重复的标准偏差。
实施例5河南新乡葡萄霜霉病菌培养繁殖过程
1、材料和方法
（1）采集葡萄霜霉病菌菌样：以河南新乡葡萄霜霉病菌菌样为代表，采用5点法取样，每点取10个新鲜葡萄霜霉病菌的发病叶片，用保温箱低温0℃-10℃保存带回室内进行进一步繁殖；
（2）步骤（2）-（9）的操作步骤同实施例4。
2、试验结果
所述方法在河南新乡葡萄霜霉病菌验证结果如表5所示，不同地区的葡萄霜霉病菌采用同样的培养繁殖方法，其发病情况与河北保定葡萄霜霉病菌基本一致，说明此种用于室内葡萄霜霉病菌培养繁殖方法适合于不同来源的葡萄霜霉病菌的培养繁殖。
表5 一种用于培养繁殖室内葡萄霜霉病菌的方法在河南新乡葡萄霜霉病菌验证结果
注：±值代表试验三次重复的标准偏差。
实施例6河北保定与河南新乡葡萄霜霉病菌继代培养
1、材料和方法
1.1、河北保定葡萄霜霉病菌继代培养
（1）采集葡萄霜霉病菌菌样：以河北保定葡萄霜霉病菌菌样为代表，采用5点法取样，每点取10个新鲜葡萄霜霉病菌的发病叶片，用保温箱低温0-10℃保存带回室内进行进一步繁殖；
（2）葡萄品种及叶片的选择：从育种基地购买高纯度欧亚种群赤霞珠和欧美杂交种高妻，于大棚内种植成为一年扦插苗，大棚随时注意通风及温湿度管理，葡萄植株全生育期未用药且无霜霉病发生。采集供试葡萄品种和叶龄一致且枝条顶端第一至第三片完全展开的健康叶片，此部位叶片接种霜霉病菌易侵染。
（3）继代培养：将实施例4纯化好的1×105个-1.5×105个/mL葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液4℃低温诱导20min，室温下放置一定时间，悬浮液温度为室温时用压力0.08MPa的QWJ-150型空压机带动喉头喷雾器在叶片背面均匀集中喷洒制备好的霜霉菌孢子囊悬浮液，液滴在叶片刚好不滑落为宜。培养条件同实施例4。待叶片发病后病情不再扩展后将孢子囊用压力0.08MPa的QWJ-150型空压机带动喉头喷雾器用无菌水冲洗下来，离心，继续配置成1×105个-1.5×105个/mL葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液4℃低温诱导20min，室温下放置一定时间，悬浮液温度为室温时，用压力0.08MPa的QWJ-150型空压机带动喉头喷雾器在叶片背面均匀集中喷洒制备好的霜霉菌孢子囊悬浮液，液滴在叶片刚好不滑落为宜，继续培养。用相同方法继代培养16代对霜霉病菌发病情况进行调查。
1.2、河南新乡葡萄霜霉病菌继代培养
采用相同方法进行河南新乡葡萄霜霉病菌继代培养实验，采集葡萄霜霉病菌菌样时以河南新乡葡萄霜霉病菌菌样为代表，继代培养采用实施例5纯化好的1×105个-1.5×105个/mL葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液进行实验，其他方法步骤与河北保定葡萄霜霉病菌继代培养实验相同。
河北保定与河南新乡葡萄霜霉病菌继代培养后在叶片上的发病情况如表6所示。
表6 葡萄霜霉病菌继代培养后在叶片上的发病情况
续表6 葡萄霜霉病菌继代培养后在叶片上的发病情况
2、试验结果
由表6可知，葡萄霜霉病菌继代培养16代，其叶片发病程度和产孢囊能力降低不明显。可见，本发明的用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法是比较合理且有效的。
综上所述，本发明的用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法简单易学，容易操作，对试验仪器要求不高，叶片发病后仍可以在相同环境条件下培养7-10天，且克服了以往葡萄霜霉病接种后难于成活、在室内不能对菌样进行大量繁殖、得不到充足孢子囊悬浮液、培养过程中发病不均匀、继代培养生活力会明显下降的缺陷，本发明的方法可用于葡萄霜霉病的监测、致病性测定、药剂筛选等大型试验，为霜霉病科研工作提供了极大的便利，具有较高的实际应用价值。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）采集葡萄霜霉病菌菌样：在不同地区的葡萄种植区采集葡萄霜霉病菌的病叶，低温0℃-10℃保存带回室内；
（2）孢子囊悬浮液的制备：（A1）将病叶表面杂质和葡萄霜霉病菌表面老熟的孢子囊冲洗掉，在18℃-20℃下黑暗培养24h-32h诱导产生新生的孢子囊；
（A2）将新生孢子囊冲下制成孢子囊含量为1×105个-1.5×105个/mL的孢子囊悬浮液；
（A3）将新生孢子囊悬浮液于4℃预冷20min-30min，室温放置待悬浮液温度为室温时用于接种；
（3）葡萄品种及叶片的选择：葡萄品种采用易感霜霉病品种；叶片选择所述易感品种植株叶龄一致、枝条顶端第一至第三片完全展开的健康叶片；同时，所述葡萄植株及叶片生长期均未用过药且无霜霉病发生；
（4）孢子囊悬浮液的接种：将孢子囊悬浮液用喷雾法离体接种（3）中所述健康葡萄叶片；
（5）叶片保湿培养：（A1）在培养皿中铺有两层无菌水浸湿的滤纸上放置玻璃棒，待叶片接种后立即将接种后的叶片正面朝下放在玻璃棒上，叶片不与滤纸直接接触，叶柄用脱脂棉保湿，将培养皿密封；
（A2）将上述装有叶片的培养皿置于18℃-20℃下黑暗、RH100%条件下培养24h-32h后进行光照培养12h，再进行黑暗培养12h，按此顺序以后每天18℃-20℃下进行12小时光照/黑暗交替培养至霜霉病菌侵染叶片发病产生大量孢子囊，此期间保证湿度RH100%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，本发明的用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法还包括如下步骤：
（6）菌种纯化：待葡萄霜霉病菌侵染叶片形成病斑后，剪取某一病斑进行单独培养，冲洗单一病斑孢子囊成孢子囊悬浮液，过滤离心，将孢子囊悬浮液稀释成孢子囊含量为1×105个-1.5×105个/mL的孢子囊悬浮液，4℃低温诱导20min-30min，待孢子囊悬浮液温度为室温时，分散喷于葡萄叶片，待霜霉病斑发生初期，继续对单一病斑进行剪切独立培养，连续重复两次，得到相对比较纯的菌系，同样方法继续扩繁2代获得孢子囊含量为1×105个-1.5×105个/mL的孢子囊悬浮液；
（7）将（6）中纯化后的孢子囊悬浮液按步骤（4）进行接种，并按步骤（5）进行叶片保湿培养至霜霉病菌侵染叶片发病产生大量孢子囊。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述葡萄霜霉病菌菌样的采集是在我国不同省份的不同葡萄种植区采用5点法取样，每点取10个葡萄霜霉病菌的病叶，用保温箱低温0-10℃保存带回室内。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中（A1）中在压力0.08Mpa下用无菌水将病叶表面杂质和霜霉病菌表面老熟的孢子囊冲洗掉，将病叶置于放有湿润滤纸的培养皿中，用保鲜膜将培养皿封口，在18℃下黑暗保湿培养24h诱导产生新生的孢子囊。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中（A1）中用压力0.08MPa的QWJ-150型空压机带动喉头喷雾器将病叶表面杂质和霜霉病菌表面老熟的孢子囊用无菌水冲洗掉。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中（A2）中在压力0.08Mpa下用无菌水将新生孢子囊洗下来，4号定性滤纸过滤，以2000r/min离心5min，重复离心2次，配制成孢子囊含量为1×105个-1.5×105个/mL的孢子囊悬浮液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）中（A2）中用压力0.08MPa的QWJ-150型空压机带动喉头喷雾器用无菌水将新生孢子囊洗下来。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述易感霜霉病品种为欧亚种群赤霞珠、欧美杂交种巨峰或欧美杂交种高妻。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述孢子囊悬浮液的接种方法为:用压力0.08MPa的QWJ-150型空压机带动喉头喷雾器将孢子囊悬浮液均匀喷雾于叶片背面，液滴在叶片刚好不滑落为宜。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（5）中（A2）中将上述装有叶片的培养皿置于18℃下黑暗、RH100%条件下培养24h后进行光照培养12h，再进行黑暗培养12h，按此顺序以后每天18℃下进行12小时光照/黑暗交替培养至霜霉病菌侵染叶片发病产生大量孢子囊，此期间保证湿度RH100%。
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