CN103169946A - 一种Safenour环肽在治疗糖尿病的口服胰岛素药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环肽在治疗糖尿病的口服胰岛素药物中的应用，其步骤：1.Safenour环肽与胰岛素结合，起到保护作用；2.Safenour结合胰岛素后，可帮助胰岛素口服后抗胃肠道酸性环境及消化酶如胃蛋白酶和胰蛋白酶的降解；3.Safenour和胰岛素结合后口服，还可促进肠道对胰岛素的吸收；4.Safenour和胰岛素结合后口服，具有显著的治疗糖尿病降血糖的作用。安全性高，Safenour制备简单，本发明解决胰岛素口服后易被降解，不能口服和不便于携带的问题。以Safenour为辅料的口服胰岛素制剂易于携带，使用方便，解决了现有天然胰岛素和速效胰岛素类似物在酸性环境下不稳定、每日需早、晚注射两次的问题，用于治疗糖尿病，具有较好的降血糖效果。口服胰岛素抗消化道降解效果好，易于规模化生产。

Description

一种Safenour环肽在治疗糖尿病的口服胰岛素药物中的应用

技术领域

本发明属于糖尿病药物治疗的领域，更具体涉及一种环肽Safenour在治疗或预防糖尿病的口服胰岛素制剂(药物)中的应用。

背景技术

随着生物技术和遗传工程的发展，多肽和蛋白质类药物日益增多，用途越来越广。这类药物的共同特点是药效高、生物半衰期短、分子量大，同时大多有较好水溶性，因而不易通过生物膜。又由于易被胃肠道酶类破坏，目前多为注射给药，因其易受体内酶类的降解，生物半衰期均较短，仅为数分钟到十几分钟，需反复注射，为了克服频繁注射给药的不便与限制，非注射途径给药引起了国内外学者的极大兴趣。为增加肽类和蛋白质类药物的非注射途径给药的生物利用度，各国学者做了不懈的努力，除了采用吸收促进剂、酶抑制剂等给药***以外，还进行了一系列非注射途径的研究。

增加多肽和蛋白质药物吸收的途径：影响肽类和蛋白质药物非注射途径给药的生物利用度的主要因素有：(1)膜屏障：身体各部分的生物膜对大分子低通透性，这些肽类和蛋白质类药物分子量大，脂溶性差，对脂溶性的生物膜通透性差；(2)酶屏障：在给药部位与靶组织之间各个阶段有多种酶使肽类及蛋白质类药物降解。

为提高其生物利用度，曾试用以下方法：

(1)应用吸收促进剂，以促进这类药物的吸收。吸收促进剂是能够促进药物尤其是大分子或吸收差的药物通过生物屏障而被吸收的低分子量的化合物。吸收促进剂可以分为四种类型：①鳌合剂，如EDTA、构椽酸、水杨酸、胶原的N-乙酞衍生物、烯胺；②合成的表面活性剂，如十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯十六烷基醚；③天然的和半合成的表面活性剂，如胆酸盐、去氧胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠；④脂肪酸及其衍生物，如辛酸钠、癸酸钠、月桂酸钠、油酸等。

(2)应用酶抑制剂，保护它们不被酶类破坏。酶抑制剂的应用在服用多肽和蛋白质类药物时，同时或预先服用水解酶抑制剂，可增加药物的生物利用度。

(3)设计合理的给药***，如脂质体、微粒和毫微粒等，以借助于这些载体或保护药物免于酶类降解，或增加药物的吸收。

非注射给药的途径有鼻腔给药、直肠给药、肺部给药、眼部给药、口服给药，其中口服给药是最方便最常用的给药途径，肽类和蛋白质类口服给药需解决两个问题：(1)胃肠道各种酶对肽和蛋白质类分解作用，在胃有胃蛋白酶，在pH值2-3的环境中该酶活性最强。在小肠有糜蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶。(2)胃肠粘膜的低透过性，有粘液屏障、小肠绒毛刷状缘肤酶，有限制细胞通透性的上皮及内皮细胞膜紧密连接。许多研究致力于使肽及蛋白质类经口服进入循环***。

糖尿病是一种慢性代谢障碍性疾病，胰岛素一直是胰岛素依赖型和非胰岛素依赖型糖尿病患者的首选药物。糖尿病患者需要长期注射胰岛素，通常每天4次，带来了诸多的不便和巨大的痛苦。因此人们一直致力于研制非注射型的胰岛素制剂。从非注射型制剂的特点看，口服途径传统、方便和易于被患者接受，给药方式在药动学上模仿生理性胰岛素的分泌，有可能成为注射剂的替代剂型。尽管口服是胰岛素理想的给药方式，但自从人类发现胰岛素，这种给药途径一直未获成功，主要问题在于：(1)胰岛素为多肽链，直接口服将被胃肠道消化酶降解失活，口服生物利用度一般小于0.5％；(2)胰岛素与一般化学药物分子相比，分子量较大，难以通过肠道吸收屏障；(3)胰岛素具有复杂的决定其生物活性的内在结构，制备过程中破坏胰岛素构象稳定性都将导致胰岛素失活。因而口服胰岛素的研发焦点集中在分子修饰、使用酶抑制剂和吸收促进微粒等方面。蛋白酶抑制剂可缓解胃肠道消化酶降解胰岛素，胰岛素药物的口服剂型还需要克服肠黏膜上皮存在的对多肽蛋白质类药物的吸收屏障，使胰岛素避免被上消化道的各种蛋白酶分解、消化。胰岛素口服剂型的研究主要集中在脂质体、纳米粒、乳剂、油相溶液及分子修饰、使用酶抑制剂等方面。口服剂型的研制成功，将是胰岛素非注射剂型研究的革命性突破，并会产生进一步探讨的理论价值和良好的商业价值。

随着现代基因工程和组织工程等高技术的发展，基因工程人胰岛素将逐步取代动物胰岛素，胰岛素的研究会越来越深入，使用方法将越来越先进、越来越方便。今后胰岛素的新剂型、新方法还将陆续出现，为糖尿病治疗带来更大的方便，糖尿病治疗的前景广阔而光明。

尽管如此，在临床中胰岛素治疗糖尿病尚有若干缺点有待改善，如何研制出疗效好、服用方便、价格低廉的胰岛素及其类似物，特别是口服胰岛素等新的给药方式的研究，仍是广大医药工作者面临的迫切而又艰巨的任务。

发明内容

为解决现有胰岛素容易被降解，不易吸收口服等方面的缺陷，本发明的目的是在于提供了一种环肽Safenour在制备治疗或预防糖尿病的口服胰岛素的药物(制剂)中的应用，具有高效性、良好的安全性、低成本、性质稳定、使用方便，能起到较好的降血糖作用的胰岛素口服给药技术及相关制剂。本发明解决胰岛素易被酶降解，不能口服和不便于携带的问题。用于治疗糖尿病，具有较好的降血糖效果。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明提及的环肽Safenour，具有很强的热稳定性，对酸碱环境不敏感，可长期储存而且毒性低，且具有非常显著的抗蛋白酶降解的作用。Safenour可用作口服胰岛素的保护制剂，与胰岛素结合后，抵抗胃酸和胃蛋白酶等消化道蛋白酶的降解，促进小肠吸收。Safenour可以减少胰岛素的口服给药剂量，并能有效的降低高血糖状态，维持2-8h的正常血糖水平。

一种解淀粉芽胞杆菌WH3菌株的制备方法，其步骤是：

1.细菌的分离筛选与鉴定：从中国湖北省武汉市湖北农科院油菜田(任一油菜田)中选取3叶期的油菜苗分离具有抗油菜菌核病的细菌。对检测到具有显著抗真菌活性的细菌进行16S rDNA、生理生化和形态鉴定，确定分离得到的WH3菌株是一株解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

2.抗真菌活性物质Safenour的分离纯化及鉴定：对上述获得的解淀粉芽胞杆菌WH3培养2天后的发酵液用“两步萃取法”(见实施例2)提取抗菌活性物质，将萃取后液体经真空旋转蒸发浓缩，并溶于10ml蒸馏水中。用葡聚糖G-25柱进一步分离纯化，绘制洗脱曲线。利用洗脱曲线各峰值的组分进行抗菌活性检测。在抗真菌活性分析后，对有活性的抗菌物质进行真空冷冻干燥进行浓缩，并经MALDI-TOF质谱分析，得到抗菌物质的结构，发现为一种特殊的环状多肽(表面活性素)，含碱性氨基酸Arg，命名为赛弗诺(Safenour)。

实施结果：

从油菜苗中共分离得到细菌菌株86株，其中命名为WH3的菌株具有显著的抗油菜菌核病的抗性。WH3菌株经形态观察和16S rDNA分析，发现该菌株为革兰氏阳性，菌体杆状，菌体大小1-1.4μm×2.3-3.5μm，在PDA平板上能快速扩散，不形成特定的菌落形态，边缘不规则，呈灰白色，粘稠有荚膜，培养48h后表面有小皱褶。在LB平板上形成米白色的菌落，菌落直径3-5mm，表面干燥有皱褶，中间塌陷，边缘波状。37℃生长明显快于28℃。芽胞近端生，鞭毛周生。WH3菌株的接触酶、酪朊水解、厌氧生长、明胶水解、淀粉水解、V-P反应和硝酸盐还原均为阳性；酪氨酸水解、苯丙氨酸脱氨酶、吲哚产生、柠檬酸盐利用均为阴性；可利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麦芽糖、蔗糖。结合，上述形态特征及染色结果，判断WH3为芽孢杆菌属。再结合16S rDNA序列分析(与解淀粉芽胞杆菌的同源性为99.4％)表明为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WH3，保存于中国典型物保藏中心，保藏号为CCTCC：M2011266。

WH3产生的抗真菌物质经“两步萃取法”萃取后，再经凝胶柱分离，获得的具有抗真菌活性的物质进一步经MALDI-TOF-MS分析，发现其分子量为1065Da，为含精氨酸的环状多肽表面活性素，命名为赛弗诺(Safenour)，其特征为含有一个碱性氨基酸精氨酸，具有很强的热稳定性，对酸碱环境不敏感，可长期储存，结构式如下：

上述制备方法于2011年08月04日已申请，专利申请号：201110222697.3。

一种环肽Safenour在制备治疗或预防糖尿病的口服胰岛素制剂(药物)中的应用，其应用过程是：

环肽Safenour+胰岛素(INS)降血糖作用：

分别用不同剂量的环肽Safenour(100μg/只、500μg/只、1000μg/只)和INS 180IU/kg混合物灌胃给药(空腹12h)经四氧嘧啶诱导成功的糖尿病小鼠模型，于胃内一次给药后1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、24h自尾尖取血测定空腹血糖水平。用t检验进行统计分析每组各时间点的血糖有无显著差别。确定Safenour最佳给药剂量为100μg/只，逐次降低INS给药剂量，检测给药后INS的最佳有效降血糖剂量。当进一步中和胃酸后口服INS(45IU/kg)+Safenour(100μg/只)与单独口服INS(45IU/kg)进行比较，目的检测是否能有效地改善降低INS给药剂量。同时，申请人探讨了环肽Safenour能有效地帮助INS口服后降低血糖的可能机制：1，环肽Safenour是否可以有效地抗胃肠道蛋白酶降解，因为INS经过胰蛋白酶酶切后只切掉几个氨基酸残基，从蛋白胶图上并不能看出分子量大小的显著变化，所以申请人只检测了环肽Safenour是否能有效地帮助INS抗不同浓度的胃蛋白酶降解；2，Safenour是否有效地包裹了INS而形成大分子，免受胃肠道蛋白酶降解；3，环肽Safenour是否可以促进小肠吸收INS，且吸收后的INS仍具有生物学活性。

实施结果：

INS因其易被体内的蛋白酶降解，不易吸收，不能单独口服服用，而环肽Safenour和INS混合后形成大分子物质(图1)，且有效的保护INS抗体内胃蛋白酶的降解(图2)；同时，Safenour有效的降低了胰蛋白酶的活力(图3)，从而有效地保护了INS免受胰蛋白酶的降解；环肽Safenour同时还促进了小肠吸收INS(图4)，并且小肠吸收后的INS仍然具有降低血糖的生物学效应(图5)。四氧嘧啶诱导的I型糖尿病小鼠，经一次性灌胃给药不同剂量的环肽Safenour和INS后，明显的降低了糖尿病小鼠的高血糖状态。环肽Safenour剂量分别为100μg/只、500μg/只、1000μg/只，INS均为180IU/kg时，都不同程度的在短时间内达到降低血糖的效果，其中环肽Safenour剂量为100μg/只时，降血糖效果最好，且节约成本(图6)。具体：给药后1h，2h就有一只小鼠已经达到正常血糖水平，4h，6h有2只小鼠达到了正常血糖水平，当时间为8h时，已有50％的小鼠达到正常血糖水平，这种情况可持续时间为4h，其中环肽Safenour剂量为100μg/只时，在第8h和10h两个时间点的血糖值与单独口服INS和单独口服Safenour对照相比较有明显的差异(图6)。

当Safenour给药最佳剂量为100μg/只，降低INS给药剂量，INS为90IU/kg时，降血糖效果最好，给药后4h就有50％的小鼠达到正常血糖水平，这种情况可持续时间为8h(图7)。

中和胃酸后的环肽Safnour+INS口服给药糖尿病小鼠，可以明显的降低INS给药剂量，同时达到很好的降血糖效果(图8)。

本发明与现有口服胰岛素保护剂/辅助药物相比具有下列优点：

(1)环肽Safenour口服毒性低，生物安全性高；

(2)环肽Safenour生产成本低，易于制备，且稳定性高，便于长期保存和运输；

(3)环肽Safenour具有较强亲水性，可直接溶解使用，方便快捷；

(4)环肽Safenour能与胰岛素结合保护胰岛素免受胃蛋白酶等酶的降解，有效地保护了胰岛素的生物活性；

(5)环肽Safenour能和胰岛素按比例直接混合口服给药，达到有效的降血糖作用。

综上所述，本发明是将胰岛素和环肽Safenour按一定比例混合制成口服胰岛素。将上述口服胰岛素按一定比例给空腹12h的四氧嘧啶诱导的糖尿病模型小鼠灌胃服下，具有显著的降血糖效果，具有可替代肌肉注射人工合成胰岛素及其衍生物的应用前景和开发潜力。本发明生产口服胰岛素抗酶降解效果好，易于携带，使用方便，且生产成本低，解决现有天然胰岛素(猪、牛、人)和速效胰岛素类似物在酸性环境下不稳定，每日需早、晚注射两次的问题，使制剂安全性更高；Safenour制备简单，易于规模化生产。

附图说明

图1为Safenour和INS结合后INS表观分子量变大。

泳道1，3，5，7：INS+Safenour；

泳道2，4，6，8：INS。

图2为Safenour保护INS抗胃蛋白酶降解。结果表明，一定量的Safenour环肽有助于胰岛素抗胃肠道蛋白酶降解。

泳道1：0.1％pepsin+INS+Safenour；

泳道2：0.1％pepsin+INS；

泳道3：0.05％pepsin+INS+Safenour；

泳道4：0.05％pepsin+INS；

泳道5：0.025％pepsin+INS+Safenour；

泳道6：0.025％pepsin+INS。

图3为Safenour抑制胰蛋白酶活力测定示意图。结果表明，试验所用两个剂量的Safenour环肽都能显著抑制胰蛋白酶的活性。

图4为Safenour促进小肠吸收INS示意图。结果表明，Safenour环肽可显著促进小肠对胰岛素的吸收。

**表示差异极为显著，p＜0.01.

图5为小肠吸收后的INS注射给药四氧嘧啶造模成功的糖尿病小鼠降血糖示意图。结果表明，胰岛素口服后被小肠吸收，仍然具有显著的降血糖的生物活性。

图6为不同剂量Safenour与胰岛素(INS)混合后灌胃给药于糖尿病模型小鼠降血糖作用示意图。结果表明，100μg/只Safenour环肽的用量和胰岛素合用后降血糖作用最为明显。i.p为口服给药，s.c为皮下注射，INS为胰岛素，S为Safenour，下同。

图7为不同剂量INS与Safenour混合后灌胃给药于糖尿病模型小鼠降血糖效果示意图。结果表明，在Safenour环肽用量固定为100μg/只时，胰岛素的用量为90IU/kg降血糖效果较好。

图8为胃酸中和液中和胃酸后灌胃给药糖尿病模型小鼠，Safenour和INS混合物后降血糖与未加胃酸中和液的Safenour和INS混合物后降血糖比较结果。结果表明，给药前先中和胃酸，有助于提高胰岛素口服后的降血糖效果。

具体实施方式

结合实施对本发明做进一步描述和论证，但本发明之内容并不局限于此。

实施例1：

一种解淀粉芽胞杆菌WH3菌株的制备方法，其步骤是：

1.解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WH3的筛选分离：

从中国湖北省武汉市湖北农科院油菜田随机取三叶期的油菜苗数株，洗净后分离根部。将油菜根部外表面以自来水冲洗干净后，再以无菌水冲洗5次，然后以70％(V/V)乙醇浸泡消毒30s，取出，以无菌水冲洗5次后，用无菌剪刀将水稻根部切成约1mm大小的碎块，然后置于PDA培养基(含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，20g琼脂，加蒸馏水至1L)上于28℃培养48h。将分离得到的细菌以PD液体培养基(含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，加蒸馏水至1L)于28℃，200rpm摇床中振荡培养48h，离心，收集上清液并以0.22μm滤膜过滤后，与PDA培养基按体积比1∶9的比例混合倒平板接种油菜菌核病菌，检测抗菌活性。经抗菌活性测定，成功筛选到一株具有显著抗真菌活性的细菌菌株，命名为WH3。

2.WH3菌株的鉴定：

将WH3菌株在PDA平板上划线生长，观察单菌落的形态、大小、边缘、表面、凹凸度、透明度；对细菌进行革兰氏染色及芽孢染色观察菌株形态，测量细菌细胞的大小。结果发现菌株为革兰氏阳性，菌体杆状，菌体大小1-1.4μm×2.3-3.5μm，在PDA平板上能快速扩散，不形成特定的菌落形态，边缘不规则，呈灰白色，粘稠有荚膜，培养48h后表面有小皱褶。在LB平板上形成米白色的菌落，菌落直径3-5mm，表面干燥有皱褶，中间塌陷，边缘波状。37℃生长明显快于28℃。芽胞近端生，鞭毛周生。在形态观察的基础上，进一步参考《伯杰氏细菌分类手册》对WH3进行生理生化测定，包括接触酶、酪朊水解、厌氧生长、明胶水解、淀粉水解、V-P反应和硝酸盐还原、酪氨酸水解、苯丙氨酸脱氨酶、吲哚产生、柠檬酸盐利用、D-葡萄糖利用、D-甘露醇利用、麦芽糖利用和蔗糖利用等项目。结果发现WH3菌株的接触酶、酪朊水解、厌氧生长、明胶水解、淀粉水解、V-P反应和硝酸盐还原均为阳性；酪氨酸水解、苯丙氨酸脱氨酶、吲哚产生、柠檬酸盐利用均为阴性；可利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麦芽糖、蔗糖。在上述基础上，再进行WH3菌株的16S rDNA分析和形态鉴定，以PD液体培养基过夜培养分离到的细菌，用常规方法提取细菌的基因组DNA，以测定16S rDNA的通用引物(F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；R：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)进行PCR扩增(PCR反应体系为：双蒸水18.3μl，10×PCR缓冲液2.5μl，通用正反引物，dNTP各1μl，Taq酶0.2μl)。反应程序：94℃4min，再30循环的94℃45s，52℃45s，72℃90s，再72℃10min)，1％(W/V)琼脂糖电泳检测成功扩增到大小大约为1.5kb的DNA片段，并由上海生工生物工程技术有限公司进行序列测定后在NCBI中经Blast比较分析确定为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保存于中国典型物保藏中心，保藏号为CCTCC：M2011266。

实施例2：

Safenour的分离纯化和鉴定

接种保存的解淀粉芽胞杆菌WH3菌种10μl到10ml灭菌的PD培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜。然后接种2.5ml新鲜培养物到含250ml新鲜PD培养基的1L三角瓶中，28℃或者37℃，200rpm振荡培养48h。一般每次用4个三角瓶培养1L的培养物。然后8000g离心10min收集上清，用“两步萃取法”提取抗菌活性物质，具体步骤是：将培养物上清液首先用等体积的乙酸乙酯萃取后取水相，再以等体积的正丁醇萃取后，以8000g离心20min收集正丁醇相。将得到的正丁醇酯相用真空旋转蒸发器在65℃下蒸干，再用10ml的蒸馏水溶解。溶解后得到的溶液离心去沉淀后，将上清液用葡聚糖G-25柱进一步分离纯化，以双蒸水进行洗脱，收集各洗脱组分，每管收集6ml洗脱液，绘制洗脱峰图，分离得到5个组分，经过滤除菌后以10％的体积比与PDA培养基混合后用于培养油菜菌核病，进行抗菌活性检测，收集具有强烈抗真菌活性的组分经MALDI-TOF质谱分析(QTRAP3200，Applied Biosystems，CA，USA)，质谱条件以TurboIonspray参数进行优化后如下：正离子模式下，离子喷雾电压(IS)2600V，去簇电压60V，质量扫描范围为200-1500。离子源气体I(GSI)，气体II(GSII)，辅助雾化气(CUR)和加热温度(TEM)分别设定为40，5，30和175℃。结果见图1，抗菌物质Safenour分子量为1065Da，由一个脂肪链和8个氨基酸组成环肽结构，含有碱性氨基酸Arg，具有Asp-Val-Leu结构，为一种表面活性素。

实施例3：

一种环肽Safenour在制备治疗或预防糖尿病的口服胰岛素制剂(药物)中的应用，其步骤是：

1、一种解淀粉芽胞杆菌WH3菌株的制备方法，其步骤是：

(1)解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WH3的筛选分离：

从中国湖北省武汉市湖北农科院油菜田随机取三叶期的油菜苗数株，洗净后分离根部。将油菜根部外表面以自来水冲洗干净后，再以无菌水冲洗5次，然后以70％(V/V)乙醇浸泡消毒30s，取出，以无菌水冲洗5次后，用无菌剪刀将水稻根部切成约1mm大小的碎块，然后置于PDA培养基(含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，20g琼脂，加蒸馏水至1L)上于28℃培养48h。将分离得到的细菌以PD液体培养基(含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，加蒸馏水至1L)于28℃，200rpm摇床中振荡培养48h，离心，收集上清液并以0.22μm滤膜过滤后，与PDA培养基按体积比1∶9的比例混合倒平板接种油菜菌核病菌，检测抗菌活性。经抗菌活性测定，成功筛选到一株具有显著抗真菌活性的细菌菌株，命名为WH3。

(2)WH3菌株的鉴定：

将WH3菌株在PDA平板上划线生长，观察单菌落的形态、大小、边缘、表面、凹凸度、透明度；对细菌进行革兰氏染色及芽孢染色观察菌株形态，测量细菌细胞的大小。结果发现菌株为革兰氏阳性，菌体杆状，菌体大小1-1.4μm×2.3-3.5μm，在PDA平板上能快速扩散，不形成特定的菌落形态，边缘不规则，呈灰白色，粘稠有荚膜，培养48h后表面有小皱褶。在LB平板上形成米白色的菌落，菌落直径3-5mm，表面干燥有皱褶，中间塌陷，边缘波状。37℃生长明显快于28℃。芽胞近端生，鞭毛周生。在形态观察的基础上，进一步参考《伯杰氏细菌分类手册》对WH3进行生理生化测定，包括接触酶、酪朊水解、厌氧生长、明胶水解、淀粉水解、V-P反应和硝酸盐还原、酪氨酸水解、苯丙氨酸脱氨酶、吲哚产生、柠檬酸盐利用、D-葡萄糖利用、D-甘露醇利用、麦芽糖利用和蔗糖利用等项目。结果发现WH3菌株的接触酶、酪朊水解、厌氧生长、明胶水解、淀粉水解、V-P反应和硝酸盐还原均为阳性；酪氨酸水解、苯丙氨酸脱氨酶、吲哚产生、柠檬酸盐利用均为阴性；可利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麦芽糖、蔗糖。在上述基础上，再进行WH3菌株的16S rDNA分析和形态鉴定，以PD液体培养基过夜培养分离到的细菌，用常规方法提取细菌的基因组DNA，以测定16S rDNA的通用引物(F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；R：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)进行PCR扩增(PCR反应体系为：双蒸水18.3μl，10×PCR缓冲液2.5μl，通用正反引物，dNTP各1μl，Taq酶0.2μl)。反应程序：94℃4min，再30循环的94℃45s，52℃45s，72℃90s，再72℃10min)，1％(W/V)琼脂糖电泳检测成功扩增到大小大约为1.5kb的DNA片段，并由上海生工生物工程技术有限公司进行序列测定后在NCBI中经Blast比较分析确定为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保存于中国典型物保藏中心，保藏号为CCTCC：M2011266。

2、Safenour的分离纯化和鉴定

接种保存的解淀粉芽胞杆菌WH3菌种10μl到10ml灭菌的PD培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜。然后接种2.5ml新鲜培养物到含250ml新鲜PD培养基的1L三角瓶中，28℃或者37℃，200rpm振荡培养48h。一般每次用4个三角瓶培养1L的培养物。然后8000g离心10min收集上清，用“两步萃取法”提取抗菌活性物质，具体步骤是：将培养物上清液首先用等体积的乙酸乙酯萃取后取水相，再以等体积的正丁醇萃取后，以8000g离心20min收集正丁醇相。将得到的正丁醇酯相用真空旋转蒸发器在65℃下蒸干，再用10ml的蒸馏水溶解。溶解后得到的溶液离心去沉淀后，将上清液用葡聚糖G-25柱进一步分离纯化，以双蒸水进行洗脱，收集各洗脱组分，每管收集6ml洗脱液，绘制洗脱峰图，分离得到5个组分，经过滤除菌后以10％的体积比与PDA培养基混合后用于培养油菜菌核病，进行抗菌活性检测，收集具有强烈抗真菌活性的组分经MALDI-TOF质谱分析(QTRAP3200，Applied Biosystems，CA，USA)，质谱条件以TurboIonspray参数进行优化后如下：正离子模式下，离子喷雾电压(IS)2600V，去簇电压60V，质量扫描范围为200-1500。离子源气体I(GSI)，气体II(GSII)，辅助雾化气(CUR)和加热温度(TEM)分别设定为40，5，30和175℃。结果见图1和图2，抗菌物质Safenour分子量为1065Da，由一个脂肪链和8个氨基酸组成环肽结构，含有碱性氨基酸Arg，具有Asp-Val-Leu结构，为一种表面活性素。

3、四氧嘧啶诱导小鼠糖尿病模型：

体重约28g左右的昆明雄性小鼠购自湖北省疾病控制中心，在本实验室饲养5天，禁食12h，饮水不限，腹腔一次性注射新鲜配制的2％(v/w)四氧嘧啶生理盐水溶液200mg/kg体重。分别于给药后1天、2天、3天、4天、5天、7天自尾尖取血测定血中葡萄糖浓度。血糖测定用ACCU-CHEK Active(罗康全活力型)血糖测定仪及其所配的血糖试纸测定。1周后空腹12h血糖大于16.7mmol/L的小鼠被认为是糖尿病小鼠。

4、环肽Safenour和胰岛素混合物(S-INS)口服给药的降血糖作用研究：

4.1不同剂量Safenur和INS的口服给药：

四氧嘧啶诱导成功的糖尿病小鼠随机分为6组，每组6只，INS(皮下)组：含胰岛素制剂为25IU/kg。S-INS(口服)1-3组：胰岛素为180IU/kg，环肽Safenour分别为100μg/只、500μg/只、1000μg/只；INS(口服)组：180IU/kg；单独环肽Safenour(口服)组：1000μg/只。小鼠每天晚上6时取走饲料，饮水不限，次日早6时测血糖(空腹12h)，血糖的测定方法同前，测完血糖后再给小鼠饲料。小鼠灌胃前连续两天测定空腹血糖，取其均值作为用药前血糖。喂药前小鼠空腹12h，胃内一次给药，于喂药后1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、24h自尾尖取血测定空腹血糖水平。用t检验进行统计分析每组各时间点的血糖有无显著差别。

4.2不同剂量INS口服给药

在确定了环肽Safenour最佳口服给药剂量后，逐次降低INS含量，检测INS的最佳口服给药剂量。糖尿病小鼠随机分为5组，每组6只，小鼠空腹12h后分别胃内给药INS 90IU/kg和环肽Safenour 100μg/只的混合物，45IU/kg和环肽Safenour 100μg/只的混合物，单独INS 180IU/kg，单独环肽Safenour 100μg/只，及皮下注射INS 25IU/kg。给药前连续两天测小鼠空腹12h血糖，取其均值作为用药前血糖。喂药前小鼠空腹12h后，用灌胃针胃内一次给药，于喂药后1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、24h自尾尖取血测定空腹血糖水平。直到血糖恢复至给药前水平。用t检验分析每组中各时间点的血糖与对照组相比差别是否显著。

4.3中和胃酸后不同INS剂量给药

糖尿病小鼠随机分为4组，每组6只，小鼠空腹12h后灌胃胃酸中和液0.2ml/只，10分钟后分别胃内给药INS 45IU/kg和环肽Safenour 100μg/只的混合物及INS 45IU/kg。给药前连续两天测小鼠空腹12h血糖，取其均值作为用药前血糖。喂药前小鼠空腹12h后，用灌胃针胃内一次给药，于喂药后1h、2h、4h、6h、8h、10h自尾尖取血测定空腹血糖水平。直到血糖恢复至给药前水平。用t检验分析每组中各时间点的血糖与对照组相比差别是否显著。

4.4可能机制探讨：

(1)环肽Safenour保护INS抗酶解作用：

模拟体内胃蛋白酶环境，用PBS将INS及环肽Safenour分别稀释至10mg/mL并调pH至1.8备用，实验处理及对照如下：

处理一：环肽Safenour 2mg/mL+INS 0.5mg/mL+胃蛋白酶(pepsin)；

处理二：INS 0.5mg/mL+pepsin；

为了探索环肽Safenour抗胃蛋白酶酶解的临界酶浓度，上述处理中pepsin浓度设0.025％、0.5％和0.1％四个梯度。各实验组于37℃摇床180r/min酶解30min，置于沸水中煮5min后以Tricine-SDS-PAGE胶进行检测。

(2)胰岛素和环肽Safenour结合后分子量变大：

用PBS将环肽Safenour稀释至10mg/mL，实验处理及对照如下：

处理组：环肽Safenour 2mg/mL+INS 0.5mg/mL；

对照组：INS 0.5mg/mL；

各实验组于37℃摇床180r/min孵育30min，置于沸水中煮5min后，以Tricine-SDS-PAGE胶进行检测。

(3)环肽Safenour降低胰蛋白酶活力测定

a.标准曲线的制作：按下表加入试剂：

管号	1	2	3	4	5	6
							100ug/mL酪氨酸溶液	1	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
蒸馏水	1.0	0.8	0.6	0.4	0.2	0

各管中加0.5％(w/v)酪素2ml，于37℃水浴中反应15min，然后加入10％(w/v)三氯乙酸3ml，过滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37℃水浴中显色15min，测OD680。

以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。

b.样品测定：取6支干燥的试管，按下表加入试剂

根据公式样品中含酶活力单位＝A/15×F

A-样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸μg数

F-酶液稀释倍数

实验数据记录与处理：

(1)标准曲线实验数据：

(2)样品组实验数据：

管号	样1	样2	样3	样4	样5	样6
							OD680	0.530	0.066	0.529	0.080	0.594	0.093
OD680	0.531	0.066	0.529	0.080	0.594	0.093
							OD680	0.531	0.066	0.529	0.080	0.593	0.094

平均值

0.531

0.066

0.529

0.080

0.594

0.093

根据公式样品中含酶活力单位＝A/15×F

A-样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸μg数

F-酶液稀释倍数

(3)胰酶活力(U)计算：

胰酶的浓度为2mg/ml，故F＝500

当环肽Safenour为100μg时，OD680＝0.531-0.066＝0.465，胰酶活力＝13533

当环肽Safenour为1000μg时，OD680＝0.529-0.080＝0.449，胰酶活力＝12700

不加环肽Safenour时，OD680＝0.594-0.093＝0.501，胰酶活力＝14733

(4)环肽Safenour促进小肠吸收INS

翻转离体小肠囊的制作：昆明雄性小鼠，体重22～25g，禁食不禁水12h后断颈处死取出小肠，剪去约10cm的十二指肠部分，余下肠段用无糖台氏液冲洗3遍，均匀地剪成5cm长，将其黏膜面翻转，一端结扎后注入等体积的无糖台氏液，结扎另一端即可。

INS吸收试验：将5μg/μl的Safenour添加于含4μg/μl的INS的台氏液中，对照组不加环肽Safenour，只含有4μg/μl的INS的台氏液中，混匀后37恒温水浴30mm，然后将制作好的小肠囊置入其中，用硅胶管连接氧气罐通以氧气，1h后取出小肠囊内的液体，Insulin Elisa Kit检测INS浓度。

(5)环肽Safenour促进小肠吸收的INS仍有生物学活性

将上述小肠吸收后的INS皮下注射四氧嘧啶造模成功的糖尿病小鼠(空腹12h)，对照组为正常的没有任何处理的INS，并于给药后1h、2h、4h、自尾尖取血测定空腹血糖水平。用t检验分析实验组中各时间点的血糖与对照组相比差别是否显著。

Claims (1)

1.一种环肽Safenour在制备治疗或预防糖尿病的口服胰岛素药物中的应用。

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