CN103145722B - 一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法，所述方法的步骤如下：制备构成高速逆流色谱仪固定相和流动相的溶剂体系；将高速逆流色谱仪填充满固定相，设置恒温循环器的温度，调节高速逆流色谱仪主机转速，最后泵入流动相，至整个体系建立动态平衡；将埃博霉素粗提物溶解于流动相中，有进样阀进样；根据紫外检测器图谱或高效液相色谱，收集目标产物。本发明对于埃博霉素粗提物的分离度高，且提纯后获得的目标产物纯度高，同时适合自动化生产，具有很高的经济效益。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法。
【背景技术】
埃博霉素(epothilone，)是目前临床上继紫杉醇(paclitaxel,)之后最为成功的抗肿瘤化疗药物。1993年赫弗勒(Hofle)等报道从南非Zambesi河岸的泥土中找到一种黏细菌纤维素堆囊菌(SorangiumcellulosumMyxococcales)菌株，并从其培养物中分离得到新的16元大环内酯化合物埃博霉素A和B。获得的埃博霉素的示意图由赫弗勒(Hofle)等在WO93/10121中描述。埃博霉素(epothilone)A和B具有以下结构式：
1995年博拉格(Bollag)等人发现埃博霉素是一种具有类似紫杉醇的促微管蛋白聚合特性(Bollag,D.M.,CancerRes55,2325-2333,1995)。在治疗用途实例中，国际申请WO99/43320描述了埃博霉素作为抗增生疾病、尤其是抗肿瘤疾病药物制剂的各种给药方式。WO99/39694公开了埃博霉素、尤其是埃博霉素A和B的一些具体制剂。与已经确立的治疗相比，埃博霉素比紫杉醇有更好的水溶性，毒副作用很小(施用会伴随一些临床的副作用，如中性白细胞减少症、外周神经病变、脱发与过敏反应等)，而且埃博霉素不是P2糖蛋白的底物，对多药耐药细胞有很强的细胞毒性，尤其是用治疗已经产生耐药性的情况下，埃博霉素、尤其是埃博霉素A且最优选埃博霉素B仍然有很强的细胞毒作用。因此，为了满足临床的需要，迫切需要生产大量高纯度的埃博霉素。
迄今为止，生产埃博霉素最有效的方法至少包括由粘细菌生物合成步骤和从其发酵培养基分离纯化的步骤。赫弗勒(Hofle)等在WO93/10121中描述，在纤维堆囊菌培养过程中加入了吸附树脂，然后将埃博霉素从吸附树脂洗脱下来，进一步通过反相色谱法分离各种埃博霉素并使其结晶。然而，赫弗勒(Hofle)等承认这种方法只能生产低数量的埃博霉素，以及纯埃博霉素的回收率低。其它的如硅胶柱层析法同样存在分离周期长、回收率低、分离效果差等问题。因此，在技术上需要有生产埃博霉素以及分离和纯化埃博霉素的改进方法。
高速逆流色谱(High-speedCounter-currentChromatograph,HSCCC)是国际上于20世纪80年代以来在液－液分配色谱基础上发展起来的新型分离技术，它具有传统液－固色谱无法比拟的优势。首先，它的流动相、固定相都是液体，不需要固体支撑或载体而避免对样品的不可逆吸附，可以保证样品在不损失的情况下进行各组分的分离，理论上样品的回收率是非常高的，因此可以节省样品和溶剂消耗，对于珍贵样品的分离是最佳的选择；其次，它的分离效率高，分离时间短，一般一次分离只需几个小时；此外，它还具有操作便捷、液－液分配体系选择广泛、分离量大及重现性好等优点，易形成自动化，已成功应用于生物、医药、化工等领域各种物质的制备分离和纯化。
利用粘细菌产生埃博霉素并进一步分离提取埃博霉素的描述见于WO93/10121、WO99/42602等，但现有文献中，未见有高速逆流色谱用于埃博霉素A/B分离的国内外报道。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法，该方法对于埃博霉素粗提物的分离度高，且提纯后获得的目标产物纯度高，同时适合自动化生产，具有很高的经济效益。
本发明是这样实现的：
一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法，所述方法以高速逆流色谱仪为分离提纯设备，以粘细菌发酵产生的埃博霉素粗提物为原料进行分离提纯；所述方法的步骤如下：
步骤1、制备构成高速逆流色谱仪固定相和流动相的溶剂体系；
步骤2、将高速逆流色谱仪填充满固定相，设置恒温循环器的温度，调节高速逆流色谱仪主机转速，最后泵入流动相，至整个固定相-流动相体系建立动态平衡；
步骤3、将埃博霉素粗提物溶解于流动相中，由进样阀进样；
步骤4、根据紫外检测器图谱或高效液相色谱，收集目标产物。
进一步地，所述高速逆流色谱仪是分析型、半制备型或制备型高速逆流色谱仪。
进一步地，所述步骤1的溶剂体系包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水，将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水混合、摇匀后静置，取分层后的上相为固定相，下相为流动相。
进一步地，所述溶剂体系中正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水体积比为0.6～1.5：0.8～2.0：0.8～1.5：1。
进一步地，所述步骤2设置的恒温循环器的温度为15～25℃。
进一步地，所述恒温循环器的温度设置为20℃。
进一步地，所述步骤2泵入的流动相流速为1.0～2.5ml/min。
进一步地，所述流动相流速为1.5ml/min。
进一步地，所述步骤2的高速逆流色谱仪主机转速为800～880rpm。
进一步地，所述高速逆流色谱仪主机转速850rpm。
本发明具有如下优点：
1.本发明可以有效避免因固体分离介质不可逆吸附作用引起的样品损失、样品组分的化学变性；
2.本发明可通过调节溶剂体系的配比关系、主机转速和流动相流速等工艺条件，以实现同时或分别分离出高纯度的不同种类的埃博霉素单体组分。另外可以根据分离目标产物的需要量，选用分析型、半制备型或制备型高速逆流色谱仪；
3.本发明分离纯化过程条件温和、分离过程高效便捷、分离制备量大、分离度高，且提纯后获得的目标产物纯度高，同时本发明节约溶剂、适合自动化生产，具有很高的经济效益。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1是实施例1的高速逆流色谱图谱。
图2是实施例1制备的埃博霉素A的高效液相及紫外全波段扫描检测图谱。
图3是实施例1制备的埃博霉素B的高效液相及紫外全波段扫描检测图谱。
图4是实施例1制备的埃博霉素A的液相质谱检测图谱。
图5是实施例1制备的埃博霉素B的液相质谱检测图谱。
【具体实施方式】
请参阅图1～5所示，对本发明的实施例进行详细的说明。
如图1～5所示，一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法，所述方法以高速逆流色谱仪为分离提纯设备，以粘细菌发酵产生的埃博霉素粗提物为原料进行分离提纯；所述方法的步骤如下：
步骤1、制备构成高速逆流色谱仪固定相和流动相的溶剂体系；
步骤2、将高速逆流色谱仪填充满固定相，设置恒温循环器的温度，调节高速逆流色谱仪主机转速，最后泵入流动相，至整个固定相-流动相体系建立动态平衡；
步骤3、将埃博霉素粗提物溶解于流动相中，由进样阀进样；
步骤4、根据紫外检测器图谱或高效液相色谱，收集目标产物。
所述高速逆流色谱仪是分析型、半制备型或制备型高速逆流色谱仪。
所述步骤1的溶剂体系包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水，将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水混合、摇匀后静置，取分层后的上相为固定相，下相为流动相；所述溶剂体系中正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水体积比为0.6～1.5：0.8～2.0：0.8～1.5：1。
所述步骤2设置的恒温循环器的温度为15～25℃，较优为20℃。
所述步骤2泵入的流动相流速为1.0～2.5ml/min，较优为1.5ml/min。
所述步骤2的高速逆流色谱仪主机转速为800～880rpm，较优为850rpm。
以下结合实施例对本发明作进一步地说明。
粗提物样品的获得：在粘细菌发酵过程中，加入XAD-16大孔吸附树脂，发酵结束后收集大孔树脂，进行甲醇浸泡，浸泡液浓缩至无醇味后，加入乙酸丁酯与水(1：1)配制的溶液，萃取3次，收集乙酸丁酯相，浓缩得到粗提物。
高速逆流色谱仪：TBE-300A高速逆流色谱仪，上海同田生物技术有限公司。
实施例一
配制溶剂体系，其中正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水的体积比1：1：1：1，共1500ml混溶于分液漏斗中，摇匀后静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气后，先将固定相泵入分离柱，设定恒温循环器的温度为20℃，然后开启高速逆流色谱仪主机，调节主机转速850rpm，流动相以1.5ml/min流速泵入分离柱，至整个固定相-流动相体系建立动态平衡，平衡10min。
计算得平衡时本溶剂体系的保留率ρ为78.8％(ρ＝(V总-V出)/V总×100％，其中V总：分离柱体管路总体积(ml)，V出：平衡过程中流动相推出的固定相体积(ml))。将50mg埃博霉素粗提物样品溶解于20ml流动相，由进样阀进样，然后根据紫外检测器图谱，分别收集埃博霉素A和埃博霉素B。
目标产物鉴定：将收集的目标产物经紫外全波段扫描、液相质谱联用、核磁共振谱验证其结构，经高效液相色谱分析(HPLC)纯度，由图1～5可知，目标产物分别为埃博霉素A，纯度95.6％；埃博霉素B，纯度97.8％。
实施例二
配制溶剂体系，其中正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水的体积比1.2：1.2：1：1，共1500ml混溶于分液漏斗中，摇匀后静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气后，先将固定相泵入整个分离柱体，设定恒温循环器的温度为20℃，然后开启高速逆流色谱仪主机，调节主机转速850rpm，流动相以1.5ml/min流速泵入分离柱体，至整个固定相-流动相体系建立动态平衡，平衡10min。
计算得平衡时本溶剂体系的保留率ρ为80.5％(ρ＝(V总-V出)/V总×100％，其中V总：分离柱体管路总体积(ml)，V出：平衡过程中流动相推出的固定相体积(ml))。将60mg埃博霉素粗提物样品溶解于20ml流动相，由进样阀进样，然后根据紫外检测器图谱，分别收集埃博霉素A和埃博霉素B。
目标产物鉴定：将收集的目标产物经紫外全波段扫描、液相质谱联用、核磁共振谱验证其结构，并经高效液相色谱(HPLC)分析纯度，最后可得，目标产物分别为埃博霉素A，纯度97.5％；埃博霉素B，纯度96.8％。
实施例三
配制溶剂体系，其中正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水的体积比1：0.8：0.8：1，共1500ml混溶于分液漏斗中，摇匀后静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气后，先将固定相泵入整个分离柱体，设定恒温循环器的温度为20℃，然后开启高速逆流色谱仪主机，调节主机转速850rpm，流动相以1.5ml/min流速泵入分离柱体，至整个固定相-流动相体系建立动态平衡，平衡10min。
计算得平衡时本溶剂体系的保留率ρ为82.5％(ρ＝(V总-V出)/V总×100％，其中V总：柱体管路总体积(ml)，V出：平衡过程中流动相推出的固定相体积(ml))。将40mg埃博霉素粗提物样品溶解于20ml流动相，由进样阀进样，然后根据紫外检测器图谱，分别收集埃博霉素A和埃博霉素粗提物B。
目标产物鉴定：将收集的目标产物经紫外全波段扫描、液相质谱联用、核磁共振谱验证其结构，并经高效液相色谱(HPLC)分析纯度，最后可得，目标产物分别为埃博霉素A，纯度96.2％；埃博霉素B，纯度97.3％。
本发明可以有效避免因固体分离介质不可逆吸附作用引起的样品损失、样品组分的化学变性；本发明可通过调节溶剂体系的配比关系、主机转速和流动相流速等工艺条件，以实现同时或分别分离出高纯度的不同种类的埃博霉素单体组分。另外可以根据分离目标产物的需要量，选用分析型、半制备型或制备型高速逆流色谱仪；本发明分离纯化过程条件温和、分离过程高效便捷、分离制备量大、分离度高，且提纯后获得的目标产物纯度高，同时本发明节约溶剂、适合自动化生产，具有很高的经济效益。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
Claims (8)
1.一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于：所述方法以高速逆流色谱仪为分离提纯设备，以粘细菌发酵产生的埃博霉素粗提物为原料进行分离提纯；所述方法的步骤如下：
步骤1：制备构成高速逆流色谱仪固定相和流动相的溶剂体系；
步骤2：将高速逆流色谱仪填充满固定相，设置恒温循环器的温度，调节高速逆流色谱仪主机转速，最后泵入流动相，至整个固定相-流动相体系建立动态平衡；
步骤3：将埃博霉素粗提物溶解于流动相中，由进样阀进样；
步骤4：根据紫外检测器图谱或高效液相色谱，收集目标产物；
所述步骤1的溶剂体系包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水，将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水混合、摇匀后静置，取分层后的上相为固定相，下相为流动相；所述溶剂体系中正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水体积比为0.6～1.5：0.8～2.0：0.8～1.5：1。
2.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于：所述高速逆流色谱仪是分析型、半制备型或制备型高速逆流色谱仪。
3.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于：所述步骤2设置的恒温循环器的温度为15～25℃。
4.根据权利要求3所述的一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于：所述恒温循环器的温度设置为20℃。
5.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于：所述步骤2泵入的流动相流速为1.0～2.5ml/min。
6.根据权利要求5所述的一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于：所述流动相流速为1.5ml/min。
7.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于：所述步骤2的高速逆流色谱仪主机转速为800～880rpm。
8.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于：所述高速逆流色谱仪主机转速850rpm。
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