CN103134935B - 一种检测胎膜早破免疫层析试纸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种免疫层析试纸的制备方法,具体涉及一种检测胎膜早破免疫层析试纸的制备方法。所述制备方法中的胶体金为按以下方法制备所得:将氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为0.5-2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2-3mL,煮沸3-10分钟,冷却后用K2CO3水溶液调节pH值至6.0-7.0得胶体金;将所得胶体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体制备成胶体金结合垫;本发明制备方法制备所得的检测胎膜早破免疫层析试纸的灵敏性和特异性有较明显的提高,分别可达到97%以上和93%以上,从而减少误诊的发生率。
Description
技术领域
本发明涉及一种免疫层析试纸的制备方法,具体涉及一种检测胎膜早破免疫层析试纸的制备方法。
背景技术
免疫层析试纸是一种利用层析原理将待检测液中的目标检测分子或成分等在试纸条上流动至检测线(T线)和质控线(C线),当检测线发生颜色变化则说明检测结果为阳性,否则为阴性,当质控线发生颜色变化时,则说明检测结果有效,否则无效。
免疫层析试纸在检测或诊断某些疾病时具有非常便利的优点,因此其已被充分运用到多种疾病或症状的检测或诊断过程中,例如早孕试纸。一般情况下,免疫层析试纸包含有以下几种构成:样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫、胶板,所述样品垫、胶体金结合垫、层析膜和吸水垫依次粘贴在胶板上;所述层析膜上依次设置有检测线和质控线;其工作原理为:将待测液滴加至样品垫上,待测液利用层析原理流向胶体金结合垫,待测液溶解胶体金结合垫中的胶体金结合物,并与其共同依次流向层析膜上的检测线和质控线;当待测液中含有目标检测分子,则目标检测分子、胶体金结合物会与检测线内包含的抗体成分结合从而形成免疫复合物,同时检测线颜色发生变化;当待测液流至质控线时,质控线内包含的抗体成分会与胶体金结合物结合,从而质控线颜色发生变化。
胎膜破裂(Rupture of Fetal Membrane,简称ROM)在孕期可能随时发生,在临产前发生的胎膜破裂称为胎膜早破(PROM)。足月后(37孕周后)PROM的发生率约为10%,足月前(37孕周前)PROM的发生率为2-3.5%。胎膜早破是引起产科病人产前、产后并发症的主要因素,也是导致胎儿早产和新生儿必须入住重症监护室的主要原因。由于医务人员不得不在延长孕周与宫内及孕妇感染的风险和胎儿肺发育问题之间求平衡,因而对胎膜早破患者的管理成本高、难度大,准确及时诊断孕妇是否发生胎膜早破至关重要。
现有检测胎膜早破的方法中除以往的临床询问病史等方法外,主要以妊娠妇***道分泌物中的细胞间粘附分子-1(简称ICAM-1)为检测指标的检测工具为较新的方法。其中以ICAM-1为检测指标的检测胎膜早破免疫层析试纸对于产科病人及时诊断是否发生胎膜早破起到了较好的效果;所述免疫层析试纸的检测线内包被有羊抗人ICAM-1多克隆抗体工作液,质控线内包被有羊抗鼠IgG工作液,胶体金结合物中含有鼠抗人ICAM-1单克隆抗体。
现有的以sICAM-1为检测指标的检测胎膜早破免疫层析试纸虽然为产科病人提供了便利,但其灵敏性、特异性以及准确度均不够理想,从而容易造成误诊,对产科病人来说同样会造成不便。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种检测胎膜早破免疫层析试纸的制备方法,该制备方法制备所得的检测胎膜早破免疫层析试纸的灵敏性和特异性有较明显的提高,分别可达到97%以上和93%以上,从而减少误诊的发生率。
为解决以上技术问题,本发明的技术方案是采用一种检测胎膜早破免疫层析试纸的制备方法,所述制备方法包括有以下步骤:
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.005g-0.03g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为0.5-2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2-3mL,煮沸3-10分钟,冷却后用K2CO3水溶液调节pH值至6.0-7.0得胶体金;将所得胶体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体制备成胶体金结合垫;
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸。
优选的,所述B步骤中氯金酸水溶液的浓度为0.01g/100mL。
优选的,所述B步骤中加入的柠檬酸三钠水溶液的浓度为2g/100mL。
优选的,所述B步骤中加入的柠檬酸三钠水溶液的量为2.5mL。
优选的,所述B步骤中K2CO3水溶液的浓度为0.1-0.3mol/L。
优选的,所述B步骤所得胶体金中加入鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体标记20-50min后,加入牛血清白蛋白封闭20-50min后离心分离,所得离心产物为胶体金结合物;将所得胶体金结合物溶于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中,所述磷酸盐缓冲液中含有10-30mg/100mL的叠氮钠。
优选的,所述磷酸盐缓冲液中含有20mg/100mL的叠氮钠。
优选的,所述加入的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体的量占胶体金的比例为150-180μg/100mL。
优选的,所述加入的牛血清白蛋白的量占胶体金的比例为150-200mg/100mL。
优选的,所述C步骤中样品垫为采用以下方法制备而成:将玻璃纤维浸泡于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中2-6小时后,于36-38℃干燥8-12小时得样品垫。
优选的,所述C步骤中磷酸盐缓冲液中还含有0.5-3.0mL/100mL的Triton-X100和0.5-2g/100mL的BSA。
本发明与现有技术相比,其详细说明如下:
本发明采用的技术方案为:检测胎膜早破免疫层析试纸的制备方法,所述制备方法包括有以下步骤:
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为0.5-2g/mL的柠檬酸三钠水溶液2-3mL,煮沸3-10分钟,冷却后用K2CO3水溶液调节pH值至6.0-7.0得胶体金;将所得胶体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体制备成胶体金结合垫;
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸。
首先,细胞间粘附分子(intercellular adhesive molecule1,简称ICAM-1)是一种参与细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间相互作用的分子统称,包括有存在于体液中的可溶性细胞间粘附分子(soluble intercellular adhesive molecule1,简称sICAM-1)和存在于细胞表面的膜型细胞间粘附分子(简称膜型ICAM-1)。其中,sICAM-1不仅保留了膜型ICAM-1的生物学特性,其还是膜型ICAM-1在体液中的可溶形式。本发明人经过充分的研究发现,发生胎膜早破的妊娠妇女受胎膜和羊水中的单核细胞上ICAM-1的表达和中性粒细胞的影响,其***分泌物中的ICAM-1含量明显升高,包括膜型ICAM-1和sICAM-1的含量。现已有将ICAM-1为目标分子来检测胎膜早破的检测工具,但在实际应用过程中,其灵敏性和特异性均较低,容易产生误诊。
本发明人经过充分的研究发现,在发生胎膜早破的妊娠妇女的***分泌物中导致ICAM-1含量升高的原因主要在于sICAM-1含量的变化,而不是含量变化较小的膜型ICAM-1;本发明人通过实验发现,sICAM-1是妊娠晚期出现在羊水中的主要蛋白质之一,含量一般为14ng/mL左右;而发生胎膜早破时,除了胎膜表面细胞上的膜型ICAM-1会随羊水流至***外,主要还是以羊水为主,而羊水中含量较多的的sICAM-1则会出现在***分泌物中。因此,采用妊娠妇***道分泌物中的sICAM-1作为检测目标分子相对于以ICAM-1为检测目标分子来检测胎膜早破可以有更好的灵敏性和特异性。
鉴于上述实验结果和本发明人的充分研究,本发明技术方案所述的检测胎膜早破免疫层析试纸的制备方法中采用羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线工作液。
免疫层析试纸用于检测疾病时的灵敏性为患病人群中得出阳性检测的样本占病人总数的百分比,特异性为健康人群中得出阴性检测的样本占健康人总数的百分比。影响灵敏性和特异性的因素较多,包括有试纸本身的制造工艺的区别以及个人操作是否规范等等,但基本还是以试纸本身的制造工艺为主。在免疫层析试纸的制造工艺中包括有几个关键步骤,主要为层析膜、胶体金、胶体金结合垫以及样品垫的制备。
本发明经过蛋白芯片筛选试验发现,确诊的胎膜早破产妇与确诊的非胎膜早破产妇相比(两组产妇的年龄与妊娠周龄匹配,无基础疾病,无妊娠合并症),其***分泌物样本中sICAM-1的浓度具有明显差异;其中,确诊的胎膜早破产妇***分泌物样本中sICAM-1的浓度90%以上均在2ng/mL以上,而确诊的非胎膜早破产妇***分泌物样本中sICAM-1的浓度90%以上均在1ng/mL以下。
鉴于上述实验结果,为了让免疫层析试纸能够正确检测出妊娠妇女是否发生胎膜早破,免疫层析试纸的制备方法就需要经过一定的调整,本发明则是以调整其中胶体金的制备方法来提高免疫层析试纸的灵敏性和特异性。
本发明所述氯金酸为四氯金酸,化学式为AuCl3·HCl·4H2O。
本发明所述胶体金可以采用现有已知的制备方法来获得,还可以采用购买市售胶体金的方式获取;现有已知的制备胶体金的方法包括有将氯金酸水溶液在还原剂如白磷、抗坏血酸、柠檬酸三钠、鞣酸等任意一种或多种的作用下,还原聚合成一定大小的金颗粒,所得金颗粒在静电作用下呈稳定的胶体状态,也即胶体金。其中,所加入还原剂的浓度以及加入量均可以采用现有的制备条件和方法进行。
本发明经过充分的研究发现,本发明制备方法中为了使所得胶体金结合垫中的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子单克隆抗体能够与胶体金更好的结合,本发明优选采用胶体金的制备方法为:将氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为0.5-2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液,煮沸3-10分钟,冷却后用K2CO3水溶液调节pH值至6.0-7.0得胶体金。
本发明所述制备方法中采用柠檬酸三钠作为氯金酸的还原剂,其浓度和加入量是通过大量的试验研究所得。柠檬酸三钠作为氯金酸的还原剂,所得胶体金的金颗粒分散均匀程度主要取决于氯金酸水溶液与还原剂的反应条件,其中以加入的柠檬酸三钠水溶液的浓度以及加入量为主。本发明柠檬酸三钠的加入时间为氯金酸水溶液加热至沸时,这种方式可以使加入的柠檬酸三钠在足够温度的条件下能够快速分散于氯金酸水溶液中,从而所得胶体金的金颗粒大小均匀。
当柠檬酸三钠水溶液的浓度过高时,其加入氯金酸水溶液中容易产生局部浓度过高,就不易达到快速分散于其中的目的,从而导致所得胶体金的金颗粒大小不够均匀;当柠檬酸三钠水溶液的浓度偏小时,其加入氯金酸水溶液的量就不够,这时就需要多次重复加入柠檬酸三钠水溶液,所得胶体金中金颗粒的颗粒大小仍然会不够均匀。
同样的,柠檬酸三钠水溶液的加入量也对所制备的胶体金的颗粒均匀程度有一定的影响。鉴于上述原因,本发明制备方法中优选采用加入氯金酸水溶液中的还原剂柠檬酸三钠水溶液的浓度为0.5-2.0g/100mL,加入量为2mL-3mL。柠檬酸三钠水溶液的浓度与加入量的组合并不是简单的组合,需要经过大量的实验才能得到较佳效果。
另外,本发明制备方法中胶体金的制备过程中,经还原后的氯金酸水溶液冷却后需要调节pH值至6.0-7.0,从而获得胶体金。该制备过程中溶液pH值同样会对所制得试纸的灵敏性和特异性有一定的影响。
进一步的,本发明优选采用所述B步骤中加入的氯金酸水溶液的浓度为0.01g/100mL。
进一步的,本发明优选采用所述加入的柠檬酸三钠水溶液的浓度为0.5-2g/100mL。本发明优选采用当所述柠檬酸三钠水溶液的浓度为0.5-2g/100mL时,其加入量为2.5mL;本发明优选采用上述方式可以使所得胶体金中的金颗粒大小更加均匀。
进一步的,本发明优选采用所述K2CO3水溶液的浓度为0.1-0.3mol/L。本发明优选采用上述方式可以便于调节溶液的pH值;浓度过高的K2CO3溶液在调节溶液pH的过程中容易出现过量的情况,而浓度过低的K2CO3溶液在调节溶液pH值的耗时会太长,因此本发明制备方法优选采用K2CO3溶液的浓度为0.1-0.3mol/L。
进一步的,本发明优选采用所述B步骤所得胶体金中加入鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体标记20-50min后,加入牛血清白蛋白封闭20-50min后离心分离,所得离心产物为胶体金结合物;将所得胶体金结合物溶于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中,所述磷酸盐缓冲液中含有10-30mg/100mL的叠氮钠。
本发明胶体金结合物采用上述制备方法,所得胶体金结合物的保存时间较为理想的同时,其制备的胶体金结合垫的层析效果也较为理想,从而所得免疫层析试纸的灵敏性和特异性能够得到较为明显的提高。
本发明胶体金结合物为鼠抗人可溶性细胞间粘附分子单克隆抗体与胶体金的结合物。现有胶体金结合物的制备方法中通常会加入氯化钠溶液来延长其保存期限,同时会在磷酸盐缓冲液中加入叠氮钠来更好的起到延长保存期限的目的。氯化钠和叠氮钠的加入虽然会延长胶体金结合物的保存期限,但两者的加入会在一定程度上降低所得胶体金结合垫的层析能力,从而降低免疫层析试纸的灵敏性和特异性。
本发明胶体金结合物的制备方法中并未加入氯化钠溶液,而且叠氮钠的浓度调整为10-30mg/100mL,该制备条件对所得胶体金结合垫的层析能力影响较小,所得免疫层析试纸的灵敏性和特异性得到有效的提高,与此同时,所得胶体金结合物的保存期限不会受到影响。
进一步的,本发明优选采用所述磷酸盐缓冲液中含有20mg/100mL的叠氮钠。本发明在上述制备条件的基础上,可以进一步对磷酸盐缓冲液中叠氮钠的浓度进行调整,具体优选为20mg/mL。
进一步的,本发明优选采用所述加入的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体的量占胶体金的比例为150-180μg/100mL。本发明所述胶体金结合物的制备过程中可进一步优选鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体的的量占胶体金的比例为150-180mg/100mL,在所述优选实施方式下所得胶体金结合垫的层析能力较好,所得免疫层析试纸的灵敏性和特异性有一定的提高。更进一步的,本发明优选采用所述加入的牛血清白蛋白的量占胶体金的比例为150-200mg/100mL。
进一步的,本发明优选采用所述C步骤中样品垫为采用以下方法制备而成:将玻璃纤维浸泡于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中2-6小时后,于36-38℃干燥8-12小时得样品垫。本发明样品垫可以采用现有已知的制备方法进行制备所得,也可以采用购买市售的产品;本发明优选采用所述样品垫为采用上述优选方式制备所得,该法所得样品垫对于所得试纸的灵敏性和特异性有一定的提高作用。
进一步的,本发明优选采用所述C步骤中磷酸盐缓冲液中还含有0.5-3.0mL/100mL的Triton-X100和0.5-2g/100mL的BSA。本发明所述Triton-X100为聚乙二醇辛基苯基醚,其是一种表面活性剂;BSA为牛血清白蛋白;本发明中采用将上述两种物质共同配制于磷酸盐缓冲液中并用于浸泡玻璃纤维,其制备所得的样品垫对于待测样品的缓冲作用效果更佳,从而对试纸的灵敏性和特异性有明显的提高。
附图说明
图1是胎膜早破组***分泌物样本的细胞因子/趋化因子抗体芯片检测结果图;
图2是健康对照组***分泌物样本的细胞因子/趋化因子抗体芯片检测结果图;
图3是健康妊娠妇女羊水样本的细胞因子/趋化因子抗体芯片检测结果图;
图4是sICAM-1的酶联免疫吸附法的检测结果图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
胎膜早破组:110例胎膜早破妊娠妇女(其中80例足月胎膜早破和30例足月前胎膜早破);
健康对照组:110例分娩前的胎膜完整妊娠妇女;
羊水样本组:30例行剖宫产的胎膜完整妊娠妇女。
实验对象临床筛选标准:
胎膜早破组—(i)临产前观察到羊水漏出;
(ii)***分泌物样本pH试纸检测阳性;
(iii)羊齿植物叶状结晶检测阳性。
健康对照组—(i)临产前未观察到羊水漏出;
(ii)***分泌物样本pH试纸检测阴性;
(iii)羊齿植物叶状结晶检测阴性。
实验对象年龄分布:80例足月胎膜早破平均年龄28岁(年龄范围19-35岁),30例足月前胎膜早破平均年龄31岁(年龄范围19-45岁),健康对照组平均年龄30岁(年龄范围18-43岁)。
样本收集方法:妊娠妇女取膀胱截石位(以平仰卧位躺下,双下肢分开屈曲,暴露外阴),窥开***后,用一次性无菌棉签伸入***后穹窿处,旋转5圈取样。将棉签头***1mL样本稀释液(磷酸盐缓冲***)中,旋转5次后,紧贴管壁挤压旋转2次,获得样本。
A、实验方法:细胞因子/趋化因子抗体芯片定性检测
实验条件:
1)将预先标记有174个细胞因子抗体的膜(RayBiotech,美国)放入检测盒中,然后加入2ml封闭液,室温封闭6小时;
2)弃去封闭液,加入1.2ml待检样本1份,4℃过夜孵育;
3)弃去样本,用2ml洗涤缓冲液清洗5次;
4)加入1ml生物素偶联的检测抗体,室温孵育2小时;
5)弃去抗体,用2ml洗涤缓冲液清洗5次;
6)加入2ml辣根过氧化物酶(HRP)偶联的链霉素亲和素,室温孵育2小时;
7)弃去液体,用2ml洗涤缓冲液清洗5次;
8)在膜上加入化学发光试剂500μl,避光作用2分钟,观察结果。
从胎膜早破组、健康对照组和羊水样本组中各收集的待测样本均采用上述
实验条件进行检测,所得结果如图1、图2和图3所示。
实验结果:图1、图2和图3中的标记1为IGFBP-1的表达信号,标记2为sICAM-1的表达信号,标记3为Axl的表达信号。从图1、图2和图3中可以看出,胎膜早破组的***分泌物和羊水样本组中IGFBP-1、sICAM-1、Axl的表达较强,而健康妊娠妇***道分泌物样本中上述三者的表达较弱,上述三者中,又以sICAM-1的表达最强。
B、实验方法:酶联免疫吸附法定量检测
实验条件:
实验材料:sICAM-1ELISA检测试剂盒(R&D公司)
1.试剂的配制
洗涤缓冲液(Wash Buffer)
底物溶液(Substrate Solution):使用前,将试剂盒中的显色剂A和显色剂B等量、避光混合15分钟,每个孔需要两种显色剂的混合物200μl。
sICAM-1标准品:用1ml去离子水将sICAM-1标准品稀释。稀释后的标准品原液浓度为250ng/ml。为确保标准品充分混匀,在进一步稀释前,将标准品放于摇床上轻轻晃动混匀至少15分钟以上。
分别将250ng/ml的标准品配置成浓度为50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.13ng/ml、1.56ng/ml的sICAM-1检测标准品;RD5-7校准稀释剂作为空白对照(0ng/ml)
2.检测程序
向每个微孔中加入100μl sICAM-1Conjugate;标准品、对照物、样本的加入量为100μl,并加入到对应的微孔中。将微孔用试剂盒提供的胶条盖好。将微孔板在室温条件下置于水平摇床上500±50转/分钟培育1.5小时。洗板;每孔加底物溶液(Substrate Solution)200μl,室温条件下,避光、平放培育30分钟;每孔加50μl终止液(Stop Solution)。孔中溶液的颜色将由蓝色变为黄色。如果孔中溶液颜色为绿色或颜色变化不一致,轻轻拍打平板,以确保溶液充分混匀;30分钟内测450nm吸光值。
3.制作标准曲线,计算样本含量。
4.将计算所得的每个待测样本的含量统计并绘制成图表,所得图表见附图4。
实验结果:图4中,AF of control为羊水样本,CVF of PROM为胎膜早破组的***分泌物,CVF of control为健康对照组的***分泌物。从图4可以看出,sICAM-1在健康妊娠妇女羊水样本中的浓度最高,平均可达到80ng/mL;sICAM-1在胎膜早破组***分泌物样本中的浓度90%以上可达到2ng/mL以上;sICAM-1在健康对照组***分泌物样本中的浓度90%以上在1ng/mL以下。
从实施例1的实验结果可知,发生胎膜早破妊娠妇女的***分泌物中主要发生含量变化之一的是可溶性细胞间粘附分子sICAM-1,而sICAM-1主要来自于胎膜破裂的羊水中。
以下是以妊娠妇***道分泌物中sICAM-1为检测目标分子,并按照不同的制备方法制备所得的免疫层析试纸的对照例,各对照例的制备方法如下:
对照例1
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.03g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为9g/100mL的柠檬酸三钠水溶液1.2mL,煮沸3-10分钟,冷却后用K2CO3水溶液调节pH值至7.0-8.0得胶体金;将所得胶体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体制备成胶体金结合垫;
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得对照例1-检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫、吸水垫均为购买市售的产品。
对照例2
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.003g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为10g/100mL的柠檬酸三钠水溶液1.2mL,煮沸3-10分钟,冷却后用K2CO3水溶液调节pH值至7.0-8.0得胶体金;将所得胶体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体制备成胶体金结合垫;
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得对照例2-检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫、吸水垫均为购买市售的产品。
对照例3
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.005g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为9g/100mL的柠檬酸三钠水溶液1.5mL,煮沸3-10分钟,冷却后用K2CO3水溶液调节pH值至7.0-8.0得胶体金;将所得胶体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体制备成胶体金结合垫;
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得对照例3-检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫、吸水垫均为购买市售的产品。
对照例4
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.005g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为0.5g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2mL,煮沸3-10分钟,冷却后用K2CO3水溶液调节pH值至7.0-8.0得胶体金;将所得胶体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体制备成胶体金结合垫;
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得对照例4-检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫、吸水垫为购买市售的产品。
对照例5
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.01g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2.5mL,煮沸3-10分钟,冷却后用K2CO3水溶液调节pH值至7.0-8.0得胶体金;将所得胶体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体制备成胶体金结合垫;
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得对照例5-检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫、吸水垫均为购买市售的产品。
对照例6
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.02g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为0.5g/100mL的柠檬酸三钠水溶液3mL,煮沸3-10分钟,冷却后用K2CO3水溶液调节pH值至7.0-8.0得胶体金;将所得胶体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体制备成胶体金结合垫;
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫、吸水垫均为购买市售的产品。
对照例7
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.01g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2mL,煮沸3-10分钟,冷却后用K2CO3水溶液调节pH值至7.0-8.0得胶体金;将所得胶体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体制备成胶体金结合垫;
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫、吸水垫均为购买市售的产品。
对照例8
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.01g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2.5mL,煮沸3-10分钟,冷却后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液调节pH值至6.0得胶体金;将所得胶体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体制备成胶体金结合垫;
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫、吸水垫均为购买市售的产品。
对照例9
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.01g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2.5mL,煮沸3-10分钟,冷却后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液调节pH值至7.0得胶体金;将所得胶体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体制备成胶体金结合垫;
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫、吸水垫均为购买市售产品。
对照例10
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.01g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2.5mL,煮沸3-10分钟,冷却后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液调节pH值至6.5得胶体金;将所得胶体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体制备成胶体金结合垫;
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫、吸水垫均为购买市售产品。
对照例11
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.01g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2.5mL,煮沸3-10分钟,冷却后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液调节pH值至6.5得胶体金;所得胶体金中按比例每100mL加入200μg的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体标记20min后,并按比例每100mL加入140mg的牛血清白蛋白封闭20min后离心分离,所得离心产物为胶体金结合物;将所得胶体金结合物溶于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液后制成胶体金结合垫,所述磷酸盐缓冲液中含有10mg/100mL的叠氮钠。
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫、吸水垫均为购买市售产品。
对照例12
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.01g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2.5mL,煮沸3-10分钟,冷却后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液调节pH值至6.5得胶体金;所得胶体金中按比例每100mL加入120μg的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体标记50min后,并按比例每100mL加入200mg的牛血清白蛋白封闭50min后离心分离,所得离心产物为胶体金结合物;将所得胶体金结合物溶于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液后制成胶体金结合垫,所述磷酸盐缓冲液中含有30mg/100mL的叠氮钠。
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫、吸水垫均为购买市售产品。
对照例13
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.01g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2.5mL,煮沸3-10分钟,冷却后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液调节pH值至6.5得胶体金;所得胶体金中按比例每100mL加入150μg的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体标记20min后,并按比例每100mL加入150mg的牛血清白蛋白封闭20min后离心分离,所得离心产物为胶体金结合物;将所得胶体金结合物溶于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液后制成胶体金结合垫,所述磷酸盐缓冲液中含有10mg/100mL的叠氮钠。
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫、吸水垫均为购买市售产品。
对照例14
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.01g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2.5mL,煮沸3-10分钟,冷却后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液调节pH值至6.5得胶体金;所得胶体金中按比例每100mL加入180μg的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体标记50min后,并按比例每100mL加入150mg的牛血清白蛋白封闭50min后离心分离,所得离心产物为胶体金结合物;将所得胶体金结合物溶于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液后制成胶体金结合垫,所述磷酸盐缓冲液中含有30mg/100mL的叠氮钠。
对照例15
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.01g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2.5mL,煮沸3-10分钟,冷却后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液调节pH值至6.5得胶体金;所得胶体金中按比例每100mL加入150μg的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体标记20min后,并按比例每100mL加入200mg的牛血清白蛋白封闭20min后离心分离,所得离心产物为胶体金结合物;将所得胶体金结合物溶于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液后制成胶体金结合垫,所述磷酸盐缓冲液中含有20mg/100mL的叠氮钠。
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫、吸水垫均为购买市售产品。
对照例16
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.01g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2.5mL,煮沸3-10分钟,冷却后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液调节pH值至6.5得胶体金;所得胶体金中按比例每100mL加入150μg的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体标记50min后,并按比例每100mL加入200mg的牛血清白蛋白封闭50min后离心分离,所得离心产物为胶体金结合物;将所得胶体金结合物溶于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液后制成胶体金结合垫,所述磷酸盐缓冲液中含有20mg/100mL的叠氮钠。
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫、吸水垫均为购买市售产品。
对照例17
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.01g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2.5mL,煮沸3-10分钟,冷却后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液调节pH值至6.5得胶体金;所得胶体金中按比例每100mL加入150μg的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体标记50min后,并按比例每100mL加入200mg的牛血清白蛋白封闭50min后离心分离,所得离心产物为胶体金结合物;将所得胶体金结合物溶于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液后制成胶体金结合垫,所述磷酸盐缓冲液中含有20mg/100mL的叠氮钠。
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫为采用以下方法制备而成:将玻璃纤维浸泡于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中2小时后,于36℃干燥8小时得样品垫;所述吸水垫为购买市售产品。
对照例18
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.01g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2.5mL,煮沸3-10分钟,冷却后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液调节pH值至6.5得胶体金;所得胶体金中中按比例每100mL加入150μg的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体标记50min后,并按比例每100mL加入200mg的牛血清白蛋白封闭50min后离心分离,所得离心产物为胶体金结合物;将所得胶体金结合物溶于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液后制成胶体金结合垫,所述磷酸盐缓冲液中含有20mg/100mL的叠氮钠。
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫为采用以下方法制备而成:将玻璃纤维浸泡于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中6小时后,于38℃干燥12小时得样品垫;所述吸水垫为购买市售产品。
对照例19
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.01g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2.5mL,煮沸3-10分钟,冷却后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液调节pH值至6.5得胶体金;所得胶体金中中按比例每100mL加入150μg的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体标记50min后,并按比例每100mL加入200mg的牛血清白蛋白封闭50min后离心分离,所得离心产物为胶体金结合物;将所得胶体金结合物溶于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液后制成胶体金结合垫,所述磷酸盐缓冲液中含有20mg/100mL的叠氮钠。
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫为采用以下方法制备而成:将玻璃纤维浸泡于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中2-6小时后,于36-38℃干燥8-12小时得样品垫;所述磷酸盐缓冲液中含有0.5mL/100mL的Triton-X100和0.5g/100mL的BSA;所述吸水垫为购买市售产品。
对照例20
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.01g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2.5mL,煮沸3-10分钟,冷却后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液调节pH值至6.5得胶体金;所得胶体金中中按比例每100mL加入150μg的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体标记50min后,并按比例每100mL加入200mg的牛血清白蛋白封闭50min后离心分离,所得离心产物为胶体金结合物;将所得胶体金结合物溶于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液后制成胶体金结合垫,所述磷酸盐缓冲液中含有20mg/100mL的叠氮钠。
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸;所述样品垫为采用以下方法制备而成:将玻璃纤维浸泡于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中2-6小时后,于36-38℃干燥8-12小时得样品垫;所述磷酸盐缓冲液中含有3.0mL/100mL的Triton-X100和2g/100mL的BSA;所述吸水垫为购买市售产品。
上述对照例1-20中的材料来源如下:
羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体:购自R&D公司;
羊抗鼠IgG多克隆抗体:购自上海派坤生物工程有限公司;
鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体:购自R&D公司;
样品垫(市售):购自Ahlstrom公司
吸水垫(市售):购自上海杰一生物科技有限公司
胶体金(市售):购自上海捷宁生物科技有限公司
牛血清白蛋白(BSA):Roche公司
实施例2
将不同方法制备而成的对照例1-20免疫层析试纸分别用于检测同样的妊娠妇***道分泌物的临床样本,包括有胎膜早破组和健康对照组,其中胎膜早破组为240例,健康对照组为260例,试验对象均采用实施例1的方法进行临床诊断和筛选。
样本收集:妊娠妇女取膀胱截石位(以平仰卧位躺下,双下肢分开屈曲,暴露外阴),窥开***后,用一次性无菌棉签伸入***后穹窿处,旋转5圈取样。将棉签头***1mL样本稀释液(磷酸盐缓冲***)中,旋转5次后,紧贴管壁挤压旋转2次,获得样本。
样本试验对象年龄分布:
利用对照例1-20分别对所收集的500例样本进行检测,所得检测结果的阴性和阳性例数统计见表一:
表一
上表一中,对照例1-3为现有制备方法所制备的免疫层析试纸;对照例4-7相对于对照例1-3为仅调整胶体金的制备方法的层析试纸;对照例8-10为本发明主要制备方法;对照例11-20为本发明进一步改进的制备方法,其中对照例11-16主要进一步改进了胶体金结合物的制备方法,对照例17-20主要进一步改进了样品垫的制备方法。
从上表一数据和对照例的不同可以得出,本发明制备方法可以明显提高所得免疫层析试纸的灵敏性和特异性;同样的,本发明进一步改进的制备方法所得的免疫层析试纸的灵敏性和特异性也有较明显的提高。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种检测胎膜早破免疫层析试纸的制备方法,其特征在于:所述制备方法包括有以下步骤:
A、羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体作为检测线的工作液,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线的工作液;检测线工作液浓度为1-3mg/mL,质控线工作液浓度为1-3mg/mL,将所述检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得层析膜;
B、将0.005g-0.03g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸,搅拌下加入浓度为2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液2.5mL,煮沸3-10分钟,冷却后用K2CO3水溶液调节pH值至6.0-7.0得胶体金;所述K2CO3水溶液的浓度为0.1-0.3mol/L;将所得胶体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体标记20-50min后,加入牛血清白蛋白封闭20-50min后离心分离,所得离心产物为胶体金结合物;将所得胶体金结合物溶于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液后制成胶体金结合垫,所述磷酸盐缓冲液中含有20mg/100mL的叠氮钠;所述加入的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体的量占胶体金的比例为150-180μg/100mL;所述加入的牛血清白蛋白的量占胶体金的比例为150-200mg/100mL;
C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸;样品垫为采用以下方法制备而成:将玻璃纤维浸泡于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中2-6小时后,于36-38℃干燥8-12小时得样品垫;该步骤中所述磷酸盐缓冲液中还含有0.5-3.0mL/100mL的Triton-X100和0.5-2g/100mL的BSA。
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