CN103131736B - 高纯度溶血磷脂酰胆碱的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的有效地制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法，以及使用高纯度溶血磷脂酰胆碱预防和/或治疗代谢性骨病的用途。该新型制备方法使用磷脂酰胆碱在磷脂酶A2催化下转化为溶血磷脂酰胆碱，在转化过程中，加入一种新型的磷脂酶A2活性增强剂。减少了磷脂酶A2的用量，提高了溶血磷脂酰胆碱的收率，可制备高纯度溶血磷脂酰胆碱。制备的高纯度溶血磷脂酰胆碱可用于预防/和治疗代谢性骨病的药物组合物。

Description

高纯度溶血磷脂酰胆碱的制备及应用

技术领域

本发明涉及一种高纯度溶血磷脂酰胆碱的制备方法及其应用。

技术背景

溶血磷脂酰胆碱由磷脂酰胆碱去掉一个脂肪酰基而得到的产物。磷脂酰胆碱(亦称卵磷脂)，广泛存在于动植物体内，在动物的脑，肾上腺及细胞中含量较多。相比于磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰胆碱的HLB值大，不仅保留了亲油性，也因非极性基团的减少而使其亲水性能增加，其润湿能力、乳化性、乳化能力均优于磷脂酰胆碱。溶血磷脂酰胆碱在改善焙烤产品的组织结构上有着重要的作用。溶血磷脂酰胆碱亦有生物活性，对动脉粥样硬化的预防、诊断和治疗有着很重要的作用。目前，溶血磷脂酰胆碱在食品、化妆品、医药等方面有着越来越广泛的应用，所以有效地制备高纯度的溶血磷脂酰胆碱就显得至关重要。

早在二十世纪初人们就已经知道磷脂酰胆碱可以借助酶催水解转化成溶血磷脂酰胆碱。借助蛇毒提取物使磷脂酰胆碱降解的早期研究结果已经证明蛇毒的溶血作用发生在细胞膜的卵磷脂部分。1935年，Hughes用实验证明卵磷脂转化成溶血卵磷脂(溶血磷脂酰胆碱)的单分子膜水解与诸如pH值、温度和卵磷脂分子的表面浓度等因素有关。在单分子层中卵磷脂分子填充物大大降低了水解速度。Hanahan证明在鸡蛋卵磷脂与磷脂酶A2之间的醚溶性络合物导致释放不饱和脂肪酸和溶血磷脂酰胆碱。采用95％的乙醇、氯仿或石油醚作溶剂时，不能察觉磷脂酶A2对磷脂酰胆碱的水解作用。在1963年的报告中，Dawson完成的实验也发现了磷脂酶A2将磷脂酰胆碱水解成溶血磷脂酰胆碱和脂肪酸分子。Dawson曾确定酶的活性与钙离子存在与否有关，并且添加醚或丁醇将激发磷脂酶的活性。授权给Unilever Ltd.的英国专利第1,215,868号介绍了进一步方案改进，即在有脂肪存在的条件下进行有磷脂酶A2参与的磷脂的水解反应。

现有技术中常见的制备溶血磷脂酰胆碱的方法有多种，常用的方法都是将磷脂酰胆碱作为反应底物，加入合适的酶在一定条件下反应获得溶血磷脂酰胆碱。例如CN1197115A中让由磷脂酶A1或A2组成的水解酶作用于水合卵磷脂生产溶血卵磷脂，然后将丙酮搅拌加入所得溶血卵磷脂溶液，丙酮的比例为所述溶血卵磷脂溶液水量体积的1至4或5或更多倍，使该溶血卵磷脂相漂浮或沉淀，分离所述溶血卵磷脂相，接着重复进行丙酮提取过程，生产除掉了所述溶血卵磷脂生产中的游离脂肪酸副产品和来源于原料的油溶性杂质的高纯度植物溶血卵磷脂；再例如CN102277393A中将磷脂酰胆碱加入低碳醇溶液中，在一定温度下搅拌混合均匀后，加入脂肪酶，在恒温下搅拌将脂肪酶催化磷脂酰胆碱醇解生成溶血磷脂酰胆碱。在上述这些制备方法中，尚存在一些不足，例如磷脂酶A2的价格较贵，因此成本较高；磷脂酰胆碱的转化率不高，因此反应的终产物中存在未反应的原始物质和副产品的比例较高；或使用了脂肪酶，虽然降低了成本，但是所带来的副产品增多，对提纯工艺有了更高的要求。

代谢性骨病是一种在生物体内破骨细胞和成骨细胞的平衡被破坏而发生的疾病。最有代表性的骨疾病是骨质疏松症。骨质疏松症是因为破骨细胞的活性比成骨细胞的活性增加而引起骨量减少所致的症状。一旦发生骨质疏松症，皮质骨变薄、髓腔增大、骨小梁变细、骨逐渐变成多孔质结构。随着骨质疏松症的进展，骨强度下降，诱发腰痛和关节痛，对轻微的冲击也易发生骨折。代谢性骨病此外还有乳腺癌或***癌的癌骨转移、原发性骨癌(比如多发性骨髓瘤)、风湿性或者退行性关节炎、被引起牙周疾病的细菌感染后牙槽骨被破坏的牙周疾病、移植牙科用移植物后发生的炎症性牙槽骨吸收疾病、在整形外科领域，为了固定骨而移植移植物后引起的炎症性骨吸收疾病、由多种遗传因素而发生的Paget`s disease等。

近几年，对治疗骨质疏松症等代谢性骨病的分子生物学研究很活跃，开发了骨形成促进因子和破骨细胞抑制因子。骨形成促进因子有氟化物、甲状旁腺素、转化生长因子(TGF-β)、骨形成蛋白、***、降血钙素、维生素D和其衍生物、双磷酸盐(bisphosphonate)(Jardine et al.，Annual Reports inMedicinal Chemistry，31，211(1996))等。

现已有很多物质被开发为骨质疏松症的治疗药物，其中最常用的药物是***，但还没有完全鉴定其实际效能，有一生都要服用的缺点，而且长期服用时可增加乳腺癌和子宫癌的发病率。阿仑瞵酸钠(alrendronate)也具有其效能不明确，在消化道内的吸收缓慢，引起胃和食道粘膜炎症等问题。钙制剂虽然被认为副作用少而且效果优秀，但与其说是治疗药物倒不如说是预防制剂。此外还有降血钙素等维生素D制剂，但对其效能和副作用方面还缺乏充分的研究。

发明内容

本发明的目的正是针对上述现有技术中所存在的问题而提供了一种新的有效地制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法，以及使用高纯度溶血磷脂酰胆碱预防和/或治疗代谢性骨病的用途。该新型制备方法使用磷脂酰胆碱在磷脂酶A2催化下转化为溶血磷脂酰胆碱，在转化过程中，加入一种新型的磷脂酶A2活性增强剂。减少了磷脂酶A2的用量，提高了溶血磷脂酰胆碱的收率，可制备高纯度溶血磷脂酰胆碱。

本发明的第一方面，提供了高纯度溶血磷脂酰胆碱的制备方法：

将磷脂酰胆碱和磷脂酶A2活性增强剂的混合物在水-低级醚的溶液中形成分散体，让该分散体与磷脂酶A2接触，以形成反应混合物。反应完成后，回收溶血磷脂酰胆碱。

其中所述的磷脂酶A2活性增强剂可选自甘油三酯和蓖麻子提取物。

其中所述甘油三酯的分子由与三个脂肪酸的酰基相连的甘油基组成，甘油三酯的酰基的碳链具有8至20个碳原子和1至4个不饱和键。

其中所述蓖麻子提取物是先将蓖麻子经粉碎脱脂、再使用95％的乙醇提取获得的。具体为：将蓖麻子去壳、打碎，然后进行脱脂：按每克蓖麻子加入4mL***和石油醚混合液的比例加入***和石油醚的混合液混和均匀，再用布氏漏斗抽滤，滤纸上的物质再用上述脱脂方法脱脂3次，然后将滤纸上成分进行干燥，得到出油后的松散奶色蓖麻饼干粉，备用；其中所述的***和石油醚的混合液，其中***和石油醚的体积比为1∶1；

将制得的蓖麻饼干粉用滤纸包裹，放入索式提取器中，按照每克蓖麻饼干粉加入10mL乙醇的比例加入质量浓度为95％的乙醇，提取8h，得到黄褐色油状物提取液，再用旋转蒸发仪蒸馏至原体积的1/5，得到膏状物，然后按照每克膏状物20mL蒸馏水的比例，将得到的膏状物溶于80℃的蒸馏水中，冷却至25℃后再用4℃的***连续萃取3-4次，以除去少量残余油脂，萃取结束后，取下层褐色清亮溶液干燥，再用乙腈反复洗涤，合并洗涤液送入旋转蒸发仪中旋蒸后制得膏状蓖麻子提取物，备用。

其中磷脂酰胆碱和磷脂酶A2活性增强剂的质量比例为10∶1至1∶1之间，优选5∶1-7∶1。

其中所述的低级醚为C1-C4醚，优选是***。

其中所述的水-低级醚的溶液中，水与低级醚的体积比例约为5∶1-10∶1，优选7∶1-9∶1，更优选8∶1。

其中磷脂酶A2的用量为常规用量的1/3-1/2，约为0.5ml-1ml磷脂酶A2每kg磷脂酰胆碱。

其中所述的回收溶血磷脂酰胆碱的步骤包括使用丙酮萃取。

其中磷脂酰胆碱的转化率可达到95％以上，优选99％。

采取本发明的制备方法，减少了磷脂酶A2的用量，由现有技术中每kg磷脂酰胆碱需要2ml以上磷脂酶A2，减少为只需要0.5ml-1ml。提高了溶血磷脂酰胆碱的收率和磷脂酰胆碱的转化率，由现有技术中60-70％的转化率，提高为95％以上，甚至可以达到99％。另一方面，大大缩短了反应所需的时间，由现有技术中普遍需要48h缩短至只需要24-36小时。通过本发明的制备方法可以有效地降低反应成本、缩短反应时间、提高反应效率，获得更高纯度的溶血磷脂酰胆碱。

本发明的第二方面，提供了使用本发明制备方法获得的高纯度溶血磷脂酰胆碱在制备治疗代谢性骨病的药物组合物中的用途。本发明还提供一种用于预防和/或治疗代谢性骨病的药物组合物，其中包含有效剂量的由本发明制备方法获得的高纯度溶血磷脂酰胆碱和药学上可接受的载体。

术语“骨代谢性疾病”是指骨的破坏和吸收被增大，导致生理性病理状态的疾病。代谢性骨病包括骨质疏松症、乳腺癌和***癌等的癌骨转移、原发性骨癌、风湿性或者退行性关节炎、被引起牙周疾病的细菌感染后牙槽骨被破坏的牙周疾病、移植牙科用移植物后发生的炎症性牙槽骨吸收疾病、在整形外科领域，为了固定骨而移植移植物后引起的炎症性骨吸收疾病、由多种遗传因素而发生的Paget`s disease等。

本发明的药物制剂可通过口服、局部、注射或者非口服的方式来给药。这些剂型可包含0.5～20％重量百分比的有效治疗骨代谢性疾病的高纯度溶血磷脂酰胆碱。本发明的口服制剂包括丸剂、片剂、包衣片、散剂、颗粒剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、溶液剂、糖衣片、乳剂、混悬剂、气雾剂等剂型。非口服制剂可包括注射剂、微囊剂、经皮剂等剂型。

本发明的药物制剂中可加入药学上可接受的载体。例如，为了制备丸剂、片剂、包衣片、硬胶囊剂，可使用乳糖、玉米淀粉、预胶化淀粉、硬脂酸和其盐等赋型剂。软胶囊剂和栓剂可使用脂肪、蜡、半固体或液体形多元醇类、天然或固化的油等赋型剂。溶液剂和糖浆剂可使用水、蔗糖、淀粉、葡萄糖、多元醇类等赋型剂。注射剂可使用保存剂、止痛剂、溶解剂、稳定剂等赋型剂。微囊剂可使用共聚物、乙醇酸、乳酸等赋型剂。除了包括活性化合物和赋型剂外，还能包括其他添加剂，例如填剂、增量剂、崩解剂、结合剂、润滑剂、润湿剂、安定化剂、乳化剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、风味剂或芳香剂、浓缩剂、稀释剂、缓冲剂、另外的溶媒或者溶解剂、得到长效效果的物质、调节渗透压而加入的物质、包衣剂、抗氧化剂等。

具体实施方式

以下实例仅仅是进一步说明本发明，并不是限制本发明保护的范围。

制备实施例1：

将磷脂酰胆碱和甘油三酯混合，其中磷脂酰胆碱和甘油三酯的质量比为1∶1。将混合物加热到85℃，获得均匀的熔体。添加足量的水和***形成的溶液，其中水和***的体积比为10∶1，加热到80℃使反应物混合均匀。调节pH值为8-9。按照每公斤磷脂酰胆碱添加LecitaseTM10L一种磷脂酶A2的酶制剂0.5ml，保持搅拌和pH值的条件下，反应36小时，直至磷脂酰胆碱完全水解为止。在完全水解后，加热除去水和***，得到糊状物。

为了获得高纯度的溶血磷脂酰胆碱，用丙酮沉淀反应的终产物，其中丙酮将从上述的包含溶血磷脂酰胆碱、甘油三酯和脂肪酸的水解产物中将甘油三酯和脂肪酸两种成分萃取出来。在添加丙酮时，溶血磷脂酰胆碱将从溶液中沉淀出来，并且可以用标准方法回收。得到的溶血磷脂酰胆碱纯度为95.4％。

制备实施例2：

将磷脂酰胆碱和甘油三酯混合，其中磷脂酰胆碱和甘油三酯的质量比为7∶1。将混合物加热到85℃，获得均匀的熔体。添加足量的水和***形成的溶液，其中水和***的体积比为8∶1，加热到80℃使反应物混合均匀。调节pH值为8-9。按照每公斤磷脂酰胆碱添加LecitaseTM10L一种磷脂酶A2的酶制剂1ml，保持搅拌和pH值的条件下，反应36小时，直至磷脂酰胆碱完全水解为止。在完全水解后，加热除去水和***，得到糊状物。

为了获得高纯度的溶血磷脂酰胆碱，用丙酮沉淀反应的终产物，其中丙酮将从上述的包含溶血磷脂酰胆碱、甘油三酯和脂肪酸的水解产物中将甘油三酯和脂肪酸两种成分萃取出来。在添加丙酮时，溶血磷脂酰胆碱将从溶液中沉淀出来，并且可以用标准方法回收。得到的溶血磷脂酰胆碱纯度为96.2％。

制备实施例3：

将蓖麻子去壳、打碎，然后进行脱脂：按每克蓖麻子加入4mL***和石油醚混合液混和均匀，再用布氏漏斗抽滤，滤纸上的物质再用上述脱脂方法脱脂3次，然后将滤纸上成分进行干燥，得到出油后的松散蓖麻饼干粉，备用；其中所述的***和石油醚的混合液，其中***和石油醚的体积比为1∶1；

将制得的蓖麻饼干粉用滤纸包裹，放入索式提取器中，按照每克蓖麻饼干粉加入10mL乙醇的比例加入质量浓度为95％的乙醇，提取8h，得到黄褐色油状物提取液，再用旋转蒸发仪蒸馏至原体积的1/5，得到膏状物，然后按照每克膏状物20mL蒸馏水的比例，将得到的膏状物溶于80℃的蒸馏水中，冷却至25℃后再用4℃的***连续萃取3-4次，以除去少量残余油脂，萃取结束后，取下层褐色清亮溶液干燥，再用乙腈反复洗涤，合并洗涤液送入旋转蒸发仪中旋蒸后制得膏状蓖麻子提取物，备用；

将磷脂酰胆碱和上述蓖麻子提取物混合，其中磷脂酰胆碱和蓖麻子提取物的质量比为7∶1。将混合物加热到75℃，获得均匀的熔体。添加足量的水和***形成的溶液，其中水和***的体积比为6∶1，加热到80℃使反应物混合均匀。调节pH值为8-9。

降低温度至35℃，按照每公斤磷脂酰胆碱添加LecitaseTM10L一种磷脂酶A2的酶制剂0.5ml，保持搅拌和pH值的条件下，反应34小时，直至磷脂酰胆碱完全水解为止。在完全水解后，加热除去水和***，得到糊状物。

为了获得高纯度的溶血磷脂酰胆碱，用丙酮萃取糊状物。添加丙酮时，溶血磷脂酰胆碱将从溶液中沉淀出来，并且可以用标准方法回收。得到的溶血磷脂酰胆碱纯度为98.7％。

制备实施例4：

将磷脂酰胆碱和制备实施例3中获得的蓖麻子提取物混合，其中磷脂酰胆碱和蓖麻子提取物的质量比为5∶1。将混合物加热到75℃，获得均匀的熔体。添加足量的水和***形成的溶液，其中水和***的体积比为9∶1，加热到80℃使反应物混合均匀。调节pH值为8-9。

降低温度至35℃，按照每公斤磷脂酰胆碱添加LecitaseTM10L一种磷脂酶A2的酶制剂0.5ml，保持搅拌和pH值的条件下，反应36小时，直至磷脂酰胆碱完全水解为止。在完全水解后，加热除去水和***，得到糊状物。

为了获得高纯度的溶血磷脂酰胆碱，用丙酮萃取糊状物。添加丙酮时，溶血磷脂酰胆碱将从溶液中沉淀出来，并且可以用标准方法回收。得到的溶血磷脂酰胆碱纯度为97.7％。

制备实施例5

将磷脂酰胆碱和制备实施例3中获得的蓖麻子提取物混合，其中磷脂酰胆碱和蓖麻子提取物的质量比为6∶1。将混合物加热到70℃，获得均匀的熔体。添加足量的水和***形成的溶液，其中水和***的体积比为8∶1，加热到80℃使反应物混合均匀。调节pH值为8-9。

降低温度至35℃，按照每公斤磷脂酰胆碱添加Lec i taseTM10L一种磷脂酶A2的酶制剂0.5ml，保持搅拌和pH值的条件下，反应30小时，直至磷脂酰胆碱完全水解为止。在完全水解后，加热除去水和***，得到糊状物。

为了获得高纯度的溶血磷脂酰胆碱，用丙酮萃取糊状物。添加丙酮时，溶血磷脂酰胆碱将从溶液中沉淀出来，并且可以用标准方法回收。得到的溶血磷脂酰胆碱纯度为99.1％。

实验实施例

1、对破骨细胞分化的抑制：骨髓细胞

骨髓细胞的分离

出生6-7周的ICR雌性小鼠被脱颈锥骨处死后，用70％乙醇消毒后腿部位，无菌操作下分离出胫骨，置于3HBSS(Gibco BRL)，剥离去除软组织。剪断胫骨的两端，用1cc注射器把1×α-MEM注入到骨髓，得骨髓细胞。用吸液管充分分散细胞，在1600rpm离心5分钟，获得骨髓细胞成分(骨髓细胞和红血球)。细胞中加入15-20ml ACK缓冲液(155mM NH4Cl，11mM KHCO3，0.01mM EDTA)处理2分钟后加入磷酸缓冲液，把骨髓细胞的损伤减少到最小限度，溶解红血球，在1600rpm离心5分钟后把细胞悬浮于含10％FBS的α-MEM。

骨髓细胞的培养

按照上述方法分离得到的骨髓细胞，以4×105/孔的细胞密度接种于48孔培养板中，在10％FBS的α-MEM中共同培养。加入ODF(50ng/ml)和M-CSF(30ng/ml)后，再加入不同浓度的本发明制得的溶血磷脂酰胆碱，其浓度分别为0.825μm，1.65μm，3.3μm，6.6μm。培养3天后，交换新鲜的α-MEM培养液，这时跟上述一样加入ODF(50ng/ml)和M-CSF(30ng/ml)以及不同浓度的溶血磷脂酰胆碱。结束分化的破骨细胞是用TRAP染色法确认。TRAP染色是用抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒进行的(Sigma，Cat.No.387-A)。成熟破骨细胞用10％***固定5分钟。除掉***，加入0.1％胰蛋白胨-100，处理10秒钟。弃去胰蛋白胨-100后，进行TRAP染色5分钟。除掉TRAP染色溶液后，用蒸馏水清洗2次，干燥，在显微镜下数TRAP阳性的破骨细胞。

实验结果中可见，对照组的TRAP阳性破骨细胞数为240±44个。但按不同浓度处理溶血磷脂酰胆碱(0.825μm，1.65μm，3.3μm，6.6μm)的实验组的TRAP阳性破骨细胞数分别为185土12.9个，172±9.3个，87±3.5个，36±3.6个。实验结果表明，在骨髓细胞培养***中，溶血磷脂酰胆碱能抑制破骨细胞的分化，而且其抑制作用与浓度呈线型关系。

2、对破骨细胞分化的抑制：破骨细胞前体细胞

破骨细胞前体细胞的分离

出生5-6周的ICR雌性小鼠被脱颈骨处死后，用70％乙醇消毒后腿部位，无菌操作下分离出胫骨和大腿骨。分离的胫骨和大腿骨用上述实施例2相同的方法剥离去除软组织后数次注入3X HBSS(Gibco BRL)除掉骨髓细胞。用手术用剪刀剪成小块，放入含胶原酶的酶溶液(1mg/ml collagenase typeII，0.05％胰蛋白酶，4mM EDTA，Gibco BRL)中，在37℃消化15分钟，反复消化5次。第3次消化后，把骨剪成更小块。经过5次消化得到的细胞悬浮于α-MEM，在冰块中放置15分钟。然后用vortex混合1分钟，加入同量的冷α-MEM，在冰块中放置15分钟。这样处理后的骨悬浮液通过灭菌网，就能得到骨髓细胞，在含10％FBS的α-MEM中培养。

破骨细胞前体细胞的培养

得到的破骨细胞前体细胞，以0.5×106/孔的细胞密度接种于48孔培养板中，在10％FBS的α-MEM中共同培养。加入ODF(100ng/ml)和M-CSF(30ng/ml)后，再加入不同浓度的本发明制得的溶血磷脂酰胆碱，其浓度分别为0.825μm，1.65μm，3.3μm，6.6μm。对照组为没有加入溶血磷脂酰胆碱的共同培养细胞。培养3天后，交换新鲜的α-MEM培养液，这时跟上述一样加入ODF和M-CSF以及不同浓度的溶血磷脂酰胆碱。培养6天后，用相同的方法交换新鲜的α-MEM培养液。培养9天后，进行TRAP染色，用显微镜数TRAP阳性的破骨细胞。

实验结果中可见，对照组的TRAP阳性破骨细胞数344±43.7个。但按不同浓度处理溶血磷脂酰胆碱(0.825μm，1.65μm，3.3μm，6.6μm)的实验组的TRAP阳性破骨细胞数分别为318±19.3个，318±50.4个，267±24个，152±29.1个。实验结果表明，从骨中分离得到的骨髓细胞前体细胞培养***中，溶血磷脂酰胆碱能抑制破骨细胞的分化，而且其抑制作用与浓度呈线型关系。

3、结论

本发明的溶血磷脂酰胆碱在骨髓细胞的培养系中能够抑制破骨细胞的分化，其抑制作用呈现出剂量依赖关系。而且本发明的溶血磷脂酰胆碱在从骨中分离的破骨细胞前体的培养系中也抑制破骨细胞的分化，其抑制作用呈现出剂量依赖关系。本发明的溶血磷脂酰胆碱对成骨细胞，骨髓细胞，腹腔巨噬细胞以及肾脏细胞中均无细胞毒性。由此，本发明的溶血磷脂酰胆碱及其药物制剂可以用于骨代谢性疾病的预防和治疗。

制剂实施例1：片剂

将

按照常规方法压制成片剂。

制剂实施例2：滴丸

将

溶血磷脂酰胆碱     2.5g

聚乙二醇6000       13.4g

聚山梨酯80         0.2g

按照常规方法制成滴丸，共制成1000粒。

制剂实施例3：软膏剂

将

按常规方法制成软膏剂。

Claims (7)

1.一种制备溶血磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，包括下列步骤：将磷脂酰胆碱和磷脂酶A2活性增强剂的混合物在水-低级醚的溶液中形成分散体，让该分散体与磷脂酶A2接触，以形成反应混合物，反应完成后，回收溶血磷脂酰胆碱，得到高纯度溶血磷脂酰胆碱；

其中所述的磷脂酶A2活性增强剂选自蓖麻子提取物；

所述的蓖麻子提取物是通过下述方法制备得到：

将蓖麻子去壳、打碎，然后进行脱脂：按每克蓖麻子加入4mL***和石油醚混合液混和均匀，再用布氏漏斗抽滤，滤纸上的物质再用上述脱脂方法脱脂3次，然后将滤纸上成分进行干燥，得到出油后的松散蓖麻饼干粉，备用；其中所述的***和石油醚的混合液，其中***和石油醚的体积比为1∶1；

将制得的蓖麻饼干粉用滤纸包裹，放入索式提取器中，按照每克蓖麻饼干粉加入10mL乙醇的比例加入质量浓度为95％的乙醇，提取8h，得到黄褐色油状物提取液，再用旋转蒸发仪蒸馏至原体积的1/5，得到膏状物，然后按照每克膏状物20mL蒸馏水的比例，将得到的膏状物溶于80℃的蒸馏水中，冷却至25℃后再用4℃的***连续萃取3-4次，以除去少量残余油脂，萃取结束后，取下层褐色清亮溶液干燥，再用乙腈反复洗涤，合并洗涤液送入旋转蒸发仪中旋蒸后制得膏状蓖麻子提取物。

2.权利要求1所述的制备方法，其中磷脂酰胆碱和磷脂酶A2活性增强剂的质量比例为1∶1至10∶1之间。

3.权利要求2所述的制备方法，其中磷脂酰胆碱和磷脂酶A2活性增强剂的质量比例为5∶1-7∶1。

4.权利要求1所述的制备方法，其中水-低级醚的溶液中，水与低级醚的体积比例为5∶1-10∶1，其中所述的低级醚为***。

5.权利要求4所述的制备方法，其中水-低级醚的溶液中，水与低级醚的体积比例为7∶1-9∶1，其中所述的低级醚为***。

6.权利要求5所述的制备方法，其中水-低级醚的溶液中，水与低级醚的体积比例为8∶1，其中所述的低级醚为***。

7.权利要求1所述的制备方法，其中所述的回收溶血磷脂酰胆碱的步骤包括使用丙酮萃取。