CN103131703A - 一种siRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种RNA干扰片段，通过QPCR和MTT染色检测发现本发明的干扰片段能高效特异性地抑制相应核糖体蛋白基因RPL21的mRNA水平表达，进而能抑制胰腺癌细胞panc-1的生长。因此，本发明的siRNA可用于制备特异性强的抗胰腺癌药物。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传和基因治疗学领域，具体地说，本发明是关于一种能抑制胰腺癌细胞生长的siRNA及其应用。
背景技术
胰腺癌恶性程度极高，早期缺乏特异症状，手术切除率低，生存时间短，预后极差，5年生存率低于5％(Maitra A，Hruban RH.Annu Rev Pathol，2008，3：157-188)。截至目前，手术治疗是有希望获得治愈性治疗的唯一手段(LoosM，Kleeff J，Friess H，et al.AnnN YA cad Sci，2008，1138：169-180)，但临床上发现时多数已处于中晚期。局部复发是胰腺癌术后治疗失败的主要原因，近80％的患者在肿瘤切除后出现局部复发，因此只有采取各种综合治疗手段包括手术、化疗等来延长患者的生存时间。胰腺癌发生与基因突变、缺失、基因扩增、DNA错配修复基因失活、表观遗传学静止、蛋白表达异常等有关。比如，约30％的人类肿瘤出现ras基因的点突变，其次是N-ras(15％)，再次是H-ras(小于1％)。ras基因激活突变作为一个早期的基因突变事件，与胰腺导管上皮细胞恶性转变及胰腺癌的发展息息相关，在胰腺癌中K-ras的突变率几乎达到100％(Klimstra DS，Longnecker DS.Am J Pathol，1994，145：1547-1550)。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象最早是由Jorgensen等在研究矮牵牛花的颜色时发现的。它是指通过内源性或外源性双链RNA(doublestrand RNA，dsRNA)的介导，特异性降解相应序列的mRNA，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能型缺失的现象，属于转录后水平的基因沉默(post-transcript gene silencing，PTGS)(Hamm and SM，Bernstein E，BeachD，et al.Nature，2000，404：293-296)。RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术，近年来发展迅速，很快就成为功能基因组研究的有力工具，它具有特异性、选择性、高效性、作用迅速等特点。RNAi技术可以高效、特异的抑制原癌基因的表达，从而降低处于异常活跃状态的信号通路，逆转癌细胞的恶性表型，达到治愈肿瘤的目的。因此，RNAi技术在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。
核糖体蛋白是组成核糖体的主要成分，近来研究发现，核糖体具有参与DNA修复、细胞发育调控和细胞分化等核糖体外功能。它通过促进核糖体RNA折叠而使之处于最利于其执行翻译功能的构象状态，而提高蛋白质生物合成的效率和准确度，参与细胞增殖、分化和凋亡，在生物体的生长、发育中起着关键性的作用(Hide K，Daita N，Eiko H，et al.J Histochem Cytochem，2003，51：567-573)。在胃癌、结直肠癌、食管癌和肝癌等肿瘤组织中一些核糖体蛋白基因高表达，核糖体蛋白基因过表达可能具有调控翻译、抗凋亡等作用(Reggen D，Fandolf P.J Cancer，2003，3：179-190)。核糖体蛋白基因过表达在肿瘤诊断和治疗上的作用已引起国际上的关注。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于RNA干扰(RNAi)技术的针对胰腺癌细胞的核糖体基因mRNA的RNA干扰片段。
以RNA干扰技术为基础，从GenBank获得人的核糖体蛋白L21(RPL21)的cDNA序列，根据siRNA靶序列的基本原则，针对RPL21基因设计了一条21个核苷酸的siRNA：siRNA21-2，对应RPL21基因mRNA中170-190核苷酸位点，序列如下：
反义链5’-UUGAACAGUACCCAUUCCCdTdT-3’；
正义链5’-GGGAAUGGGUACUGUUCAAdTdT-3’。
根据本发明的优选实施例，所述干扰片段的3’端还添加了两个脱氧核糖核苷酸。
优选的，所述脱氧核糖核苷酸呈单链悬挂结构，以增强siRNA在体内和体外的稳定性，防止降解。
本发明的所述RNA干扰片段可用于制备治疗胰腺癌的药物。
根据本发明，所述药物抑制胰腺癌细胞的生长。
根据本发明，所述抑制胰腺癌细胞的生长是通过抑制核糖体蛋白基因RPL21的表达来实现。
本发明的siRNA21-2能高效特异性地抑制相应核糖体蛋白基因RPL21的mRNA水平表达，进而能抑制胰腺癌细胞panc-1的生长，因而可以用于制备治疗胰腺癌的药物。
附图说明
图1为本发明的QPCR检测结果图。
图2为本发明的MTT分析结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。
以下实施例中所使用的技术，包括PCR扩增与检测、细胞转染、RNA提取等分子生物学技术，以及细胞培养、检测技术等，除非特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂和细胞系等，除非是本说明书特别注明，均为一般本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
实施例1、siRNA的合成
根据siRNA设计原则，从RPL21基因起始密码子AUG下游开始，搜索AA序列，其3′端相邻21nt序列作为候选靶点，从中选择GC含量在40-50％的siRNA序列，并通过GenBank数据库的blast功能与人类基因组序列进行比对，确保无同源性。
本实施例选择的siRNA21-2，其干扰的靶序列为5’-AAGGGAAUGGGUACUGUUCAA-3’，对应RPL21基因mRNA中170-190核苷酸位点，序列如下：
siRNA21-2：反义链5’-UUGAACAGUACCCAUUCCCdTdT-3’；
正义链5’-GGGAAUGGGUACUGUUCAAdTdT-3’。
将上述设计序列委托上海吉玛公司通过化学法合成，同时在siRNA的3′端添加两个脱氧核糖核苷酸(dTdT)，呈单链悬挂结构，以增强siRNA在体内和体外的稳定性，防止降解。
实施例2、QPCR检测siRNA的基因沉默效果
1、转染：Panc-1细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)用DMEM完全培养基(含10％胎牛血清)培养，按照15万个/孔的比例铺6孔板，于37℃、5％CO2、90％相对湿度条件培养24h。用脂质体Lipofectamine2000转染试剂盒(Invitrogen)进行细胞转染，方法按照产品说明。转染时，用100pmolsiRNA21-2转染Panc-1细胞，siRNA与脂质体比例为100pmol∶5μL。
2、QPCR检测：提取总RNA，逆转录后进行PCR反应，具体如下：
提取总RNA：使用TRIzol法提取siRNA21-2转染后的Panc-1细胞的总RNA。
逆转录：使用RevertAidTMFirst Strand cDNA SynthesisKit(Fermentas)进行反转录。
PCR条件为：使用SYBR Green/ROXqPCR MasterMix(2X)(Fermentas)进行QPCR检测，反应体系为25μL，每体系检测1μLcDNA模板。反应程序为：(1)94℃10min，(2)94℃30s，(3)60℃30s，(4)72℃30s，(2)-(4)，40个循环。同时以GAPDH为内参，结果如图1所示，使用的QPCR引物如表1所示：
表1、QPCR引物序列
| sense | antisense | |
| GAPDH | 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’ | 5’-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3’ |
| RPL21 | 5’-CCACCCAGAGAAGCACACTT-3’ | 5’-TTTGTAGCCCAGAGGTCCTTTA-3 |
如图1所示，经siRNA21-2转染后的胰腺癌细胞panc-1中，RPL21基因的mRNA表达水平与未转染siRNA的panc-1细胞相比显著下降，说明本发明的siRNA21-2能够高效特异性抑制相应核糖体蛋白基因RPL21的表达。
实施例3、MTT分析siRNA对胰腺癌细胞panc-1生长的影响
转染：Panc-1细胞(购自中国科学院典型微生物保藏委员会细胞库)用DMEM完全培养基(含10％胎牛血清)培养，按照3000个/孔的比例铺96孔板，于37℃、5％CO2、90％相对湿度条件培养24h。用脂质体Lipofectamine2000转染试剂盒(Invitrogen)进行细胞转染，方法按照产品说明。转染时，用5pmolsiRNA21-2转染Panc-1细胞，siRNA与脂质体比例为5pmol∶0.25μL。
MTT染色：siRNA21-2转染后的Panc-1细胞在24h、28h、72h、96h时分别加入MTT染色，放置4h后去除上清，加入150μL DMSO溶解，酶标仪于490nm下检测，结果如图2所示。
由图2的结果可见，经siRNA21-2转染后的胰腺癌细胞panc-1与未转染siRNA的细胞相比生长受到显著抑制，说明siRNA21-2能够通过高效特异性抑制相应核糖体蛋白基因RPL21的表达，进而达到高效抑制胰腺癌细胞生长的目的。
Claims (6)
1.一种RNA干扰片段，其特征在于，所述RNA干扰片段的序列如下：
反义链：5’-UUGAACAGUACCCAUUCCCdTdT-3’；
正义链：5’-GGGAAUGGGUACUGUUCAAdTdT-3’。
2.如权利要求1所述的RNA干扰片段，其特征在于，所述干扰片段的3’端还添加了两个脱氧核糖核苷酸。
3.如权利要求2所述的RNA干扰片段，其特征在于，所述脱氧核糖核苷酸呈单链悬挂结构。
4.权利要求1～3中任一项所述的RNA干扰片段的应用，其特征在于，用于制备治疗胰腺癌的药物。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物抑制胰腺癌细胞的生长。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑制胰腺癌细胞的生长是通过抑制核糖体蛋白基因RPL21的表达来实现。
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