CN103131671B - 一种新的诱导体细胞重编程的方法，试剂盒及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的诱导体细胞重编程的方法，试剂盒及用途。本发明涉及中内胚层分化发育相关因子作为诱导因子用于诱导多潜能干细胞产生的用途。本发明通过向分化的细胞提供诱导因子从而诱导产生诱导多潜能干细胞(iPS细胞)，所述诱导因子包含中内胚层分化发育相关因子、Sox2、Klf4和任选地c‑Myc。在本发明中，通过中内胚层分化发育相关因子替代Oct4产生的iPS细胞具有和鼠胚胎干细胞相似的特性，即具有维持自我更新的能力以及分化的全能性。

Description

一种新的诱导体细胞重编程的方法，试剂盒及用途

技术领域

本发明涉及一种诱导体细胞重编程的方法，试剂盒及用途。

背景技术

(一)胚胎干细胞简介

胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs，简称ES细胞。)胚胎干细胞是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺种分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。

(二)干细胞多能性(pluripotency)的特点：

胚胎干细胞因为具有向三个胚层细胞的分化能力而被称为“多潜能”干细胞，此外，胚胎瘤(EC)细胞和胚胎生殖(EG)细胞均具有和胚胎干细胞类似的多能性。多潜能干细胞共同的特点是：ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质胞浆少，结构简单。体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长。细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状(人胚胎干细胞较扁平，而小鼠胚胎干细胞较为***，细胞界限不明显)。具有AP酶活性，特异地表达SSEA4，TRA1-60，TRA1-81等表面标志(小鼠胚胎干细胞还特异性地表达SSEA1，而人胚胎干细胞不表达SSEA1)，及Oct4，Nanog，Sox2，rex1(ZFP42)，GDF3，lin28，mbd2，TEGF1等标志性基因。此外，还可以在悬浮培养条件下，形成胚胎小体(Embryonid bodies)结构，并发生自发分化，EB形成6-9天后贴壁培养，可检测到向内、中、外三个胚层分化的细胞。

(三)胚胎干细胞的研究

哺乳动物在正常情况下永远不会发生的事情是细胞的“去分化”——细胞倒转发育的进程，回归为一种更加原始的类型。事实上对于这条规则的唯一例外是肿瘤细胞，相比于其来源的组织细胞，它们的分化程度比较低。不幸的是，一些肿瘤细胞会无止境的***，显示了永生化的特点，而多能性细胞也具有相似的特点。

直到最近，将一个正常成体细胞内的生物钟倒转的唯一办法是通过一种精细操作，让细胞回归成为胚胎样细胞的状态，这个过程被称为细胞的重编程。实现重编程的最古老的方法是体细胞的核移植技术，或者称为“克隆”，其具体操作是将一个正常成体细胞内的遗传物质通过显微注射进入***内，而***本身的DNA之前被去除掉。这种DNA与***形成的杂合体能够发育成为早期胚胎，从这种早期胚胎中可以提取多能性的干细胞。

自从1997年多利羊的诞生和1998年首次分离得到人类胚胎干细胞以来，核移植技术作为一种可以量身定制获得多能性细胞的途径，进而能够移植替换疾病受损组织和创伤组织，受到了广泛的关注。***内的某些因子(我们了解得还很少)的确将成年供体细胞内的遗传物质变得年轻了，甚至包括端粒。端粒就像一顶帽子一样保护着染色体的末端，并随着年龄的增长逐渐变短，但重编程仍能让端粒保持年轻化的状态。尽管克隆技术在动物体内取得了长足的进展，但将之用于生成人类胚胎干细胞的努力仍然是不成功的。

(四)诱导多能性干细胞(IPS细胞)的研究

2006年8月，日本京都大学再生医科学研究所教授山中伸弥(Yamanaka)实验室首先宣布在小鼠的成纤维细胞中导入4个基因(Oct4，Sox2，c-Myc和KLF4)成功地将其诱导重编程成为全能性的干细胞，其性质和胚胎干细胞类似。(Takahashi and Yamanaka，2006)从而首次揭示了通过转基因可以在分化的细胞中建立全能性。

在该实验中，Yamanaka等人首先选取了和小鼠胚胎干细胞自我更新及维持多能性相关的24个基因，分别将他们克隆到逆转录病毒载体，对胚胎成纤维细胞进行共转染，在进行基于Fbx15报告体系的筛选之后，他们观察到了ES-like的细胞集落的形成。经过对这24个基因的进一步分析，他们发现，仅转导Oct4，Sox2，c-Myc，KLF4就可以使胚胎成纤维细胞完全转变成为诱导的多潜能干细胞(iPS细胞-Induced Pluripotent Stem Cells，俗称“诱导的多潜能干细胞”)。该IPS细胞拥有正常的核型，表达类似胚胎干细胞的分子标志，可以在体外被诱导分化为内、中、外三个胚层的终末分化的细胞，能够在裸鼠体内形成畸胎瘤，在畸胎瘤中含有内、中、外三个胚层的分化细胞。此外，和胚胎干细胞一样，IPS细胞在Nanog和Oct4 promoter上检测到H3的低甲基化和高乙酰化。然而，采用Fbx15基因作为reporter筛选出来的细胞并不具有完整的全能性，如：内源Oct4等干性基因仍然没有能够正常地启动表达，不能通过囊胚注射的方法制成嵌合小鼠等。

同时，研究发现只用Oct4，Sox2和KLF4一样可以获得IPS细胞，cMyc并不是体细胞重编程所必需的转录因子。

此后，采用Yamanaka的策略，一些新的用于产生诱导多能干细胞的因子被筛选出来。新加坡的Huck-Hui Ng研究组发现Nr5a2和Klf4，Sox2，cMyc一起完成重编程(Jian-Chien Dominic Heng et al.，2009)，并且Oct4，Esrrb，Klf4，和cMyc一起也可以完成重编程。同时，研究发现只用Oct4并且在特殊的细胞类型，如神经干细胞(Kim et al.，2009)，滋养外胚层细胞(Tong Wu et al.，2011)等就可以实现将体细胞重编程为诱导多能干细胞。并且，在加上小分子的情况下还能实现将小鼠成纤维细胞转变为诱导多能干细胞(YanqinLi et al.，2010)以及人的角质化细胞转变为诱导多能干细胞(Saiyong Zhu et al.，2010)。

迄今为止，不同研究组已经在许多种不同类型的细胞上尝试了重编程技术，并取得了成功。在诱导的方法学上也有了许多的改进。2008年，Hochedlinger课题组利用不整合基因组的腺病毒(Adenovirus)载体成功诱导了IPS细胞(Matthias Stadtfeld et al.，2008)；同年，Yamanaka利用质粒载体也成功诱导了IPS细胞(Keisuke Okita et al.，2008)；piggyBac转座子体系后来也证实可以切除掉外源***基因的方法完成重编程(Woltjen K et al.，2009)；后来Ding Sheng课题组利用四因子的蛋白也成功诱导IPS细胞(Zhou H et al.，2009)；最近，用RNA(Luigi Warren et al.，2010)和小RNA(micro RNA)也能实现成功的重编程(Frederick Anokye-Danso et al.，2011and Alessandro Rosa etal.，2011)。

Gata3，Gata6，Gata4，Pax1，Six1，Gata2，Foxa2作为中内胚层分化基因已经被广泛报道，但其在重编程过程中的作用目前还没有报道。Gata3对于T细胞的特化具有重要调控作用(C.N.Ting et al.，1996)；Gata6和Gata4都是内胚层典型的marker，对于心肌细胞的特化有重要作用(J.K.Takeuchi et al.，2009)；Pax1对于T细胞的成熟起关键作用(J.Wallin et al.，1996)；Six1对于小鼠的肾脏发育有重要作用(X.Li et al.，2003)；Gata2对于造血前体细胞的扩增是必需的(F.Y.Tsai et al.，1997)；Foxa2是肝细胞的重要marker，并且可以和HNF4α一起完成从体细胞到肝细胞的转分化(S.Sekiya et al.，2011)。

(五)应用前景

诱导多能干细胞的建立很好的解决了胚胎干细胞研究的伦理问题，对于生命科学以及人类的健康有着重要意义。诱导多能干细胞的研究可以帮助揭示人及动物的发育机制及影响因素；建立转基因动物或基因打靶动物，制备人类疾病模型；体外诱导分化提供各种类型的人体细胞，进行药学研究；通过形成嵌合体，在严格控制下使动物的某些器官来源于人体细胞，从而用于临床移植；最诱人的前景就是用于细胞治疗和基因治疗的靶细胞，为细胞移植提供无免疫原性的材料以及通过基因修饰改造的人体细胞移植回体内，达到治愈疾病的目的等等。

发明内容

本发明提供了一种通过导入中内胚层分化相关基因诱导细胞重编程的方法，这类基因可和Sox2等其它重编程基因一起，诱导产生诱导多潜能干细胞(iPS细胞)。该方法通过向分化的细胞中提供中内胚层分化发育相关的基因(如gata3)，在外源Sox2等其它基因的共同作用下，诱导产生IPS细胞-诱导的多潜能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells，俗称“万能细胞”)。

因此，本发明一方面涉及中内胚层分化发育相关因子作为诱导因子用于诱导多潜能干细胞产生的用途。

本发明还一方面涉及一种制备诱导多潜能干细胞的方法，包括向分化的细胞提供诱导因子的步骤。在本发明的一些实施方案中，本发明的制备方法包括将分化的细胞与诱导因子接触的步骤。在本发明的一些实施方案中，所述诱导因子包含中内胚层分化发育相关因子。在本发明的一些实施方案中，所述诱导因子包含中内胚层分化发育相关因子、Sox2和Klf4的组合。在本发明的一些实施方案中，所述诱导因子进一步包含c-Myc。在本发明的一些实施方案中，所述诱导因子包含中内胚层分化发育相关因子、Sox2、Klf4和c-Myc的组合。在本发明的一些实施方案中，本发明的方法包括向分化的细胞提供中内胚层分化发育相关因子、Sox2和Klf4的组合。在本发明的一些实施方案中，本发明的方法包括向分化的细胞提供中内胚层分化发育相关因子、Sox2、Klf4和c-Myc的组合。在本发明的方法中，中内胚层基因能替代Oct4和/或c-Myc，因此不必使用Oct4和/或c-Myc。

在本发明中，所使用的分化的细胞可以是本领域已知的任何分化的细胞，例如，皮肤细胞，肝细胞，胃细胞，角质细胞或血液细胞，优选地，所述细胞来自胚胎期，刚出生后或成体期。

在本发明中，所使用的分化的细胞可以来源于哺乳动物或非哺乳动物。在本发明的一些实施方案中，本发明使用的分化的细胞来源于人。在本发明的一些实施方案中，本发明使用的的分化的细胞来源于非人哺乳动物。在本发明的一些实施方案中，本发明使用的分化的细胞来源于鼠如小鼠或大鼠或灵长类动物。

本发明又一方面涉及一种制备诱导多潜能干细胞的试剂盒，包括诱导因子。在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于转化细胞的试剂和载体。所述载体可以是例如慢病毒***的载体。本发明的试剂盒中还可以包括培养基和说明书。在本发明的一些实施方案中，所使用的诱导因子包括中内胚层分化发育相关因子、Sox2、Klf4和任选地c-Myc。在本发明的一些实施方案中，本发明的试剂盒包括中内胚层分化发育相关因子、Sox2和Klf4的组合。在本发明的一些实施方案中，本发明的方法包括中内胚层分化发育相关因子、Sox2、Klf4和c-Myc的组合。

在本文中，诱导因子以其最广泛意义使用，包括产生诱导多潜能干细胞的基因(其编码多核苷酸或其蛋白产物)或基因的组合，诱导因子可以是核酸如DNA，mRNA或蛋白形式。

在本文中，中内胚层分化发育相关因子以其最广泛的意义使用，包括本领域已知的任何中内胚层分化发育相关基因、编码所述基因的多核苷酸、所述基因表达产生的蛋白质。例如，在本发明的一些实施方案中，所述中内胚层分化发育相关因子包括GATA3，GATA6，GATA4，PAX1，GATA2，SIX1或FOXA2中的至少一个。在本发明的一些实施方案中，所述中内胚层分化发育相关因子选自GATA3，GATA6，GATA4，PAX1，GATA2，SIX1或FOXA2中的至少一个。在本发明的一些实施方案中，所述中内胚层分化发育相关因子选自GATA3，GATA6，GATA4，PAX1，GATA2，SIX1或FOXA2。在本发明的一些实施方案中，仅使用选自GATA3，GATA6，GATA4，PAX1，GATA2，SIX1或FOXA2中的一个中内胚层分化发育相关因子。在本发明的一些实施方案中，使用选自GATA3，GATA6，GATA4，PAX1，GATA2，SIX1或FOXA2中的两个或更多中内胚层分化发育相关因子的组合。在本发明的一些实施方案中，使用的中内胚层分化发育相关因子为GATA3。

本发明又一方面涉及使用本发明的方法或试剂盒制备的诱导多潜能干细胞。

本发明还一方面涉及所制备的诱导多潜能干细胞的用途。例如，用于本领域已知的各种用途。

如本发明中所证实的，中内胚层分化发育相关因子可以用于制备诱导多潜能干细胞。在这一方面，中内胚层分化发育相关因子可以与Sox2、Klf4和任选地c-Myc组合用于制备诱导多潜能干细胞。

如本发明中所证实的，中内胚层分化发育相关因子还可以用于提高重编程效率。在这一方面，中内胚层分化发育相关因子可以与Sox2、Klf4和c-Myc组合用于提高重编程效率。

附图说明

图1：a，b表明中内胚层基因能替代OCT4而外胚层基因不能，a中MEF为小鼠胚胎成纤维细胞；b中MDF为小鼠真皮成纤维细胞；GFP为绿色荧光蛋白。

图2：a，b，c表明中内胚层基因GATA3可以替代OCT4和c-MYC，并且能够提高重编程效率。

图3用GATA3和SOX2，KLF4，c-MYC(SKM)诱导iPS细胞的时间表示意图。

图4 GATA3在诱导iPS细胞中各个不同时间阶段发挥的作用。

图5用GATA3和SOX2，KLF4，c-MYC(SKM)诱导的iPS原代细胞集落。比例尺为100μm。

图6用GATA3和SOX2，KLF4，c-MYC(SKM)诱导的iPS细胞系经传代保持AP(碱性磷酸酶)染色阳性。比例尺为100μm。

图7用GATA3和SOX2，KLF4，c-MYC(SKM)诱导的iPS细胞系表达多潜能性标志蛋白，如Nanog，Utf1和SSEA1。比例尺为10μm。

图8用GATA3和SOX2，KLF4，c-MYC(SKM)诱导的iPS细胞系中没有OCT4外源重编程基因的整合。

图9用GATA3和SOX2，KLF4，c-MYC(SKM)诱导的iPS细胞系表达干性标志基因。

图10用GATA3和SOX2，KLF4，c-MYC(SKM)诱导的iPS细胞系的外源重编程基因已经基本沉默。

图11用GATA3和SOX2，KLF4，c-MYC(SKM)诱导的iPS细胞系的Oct4，Nanog启动子DNA甲基化水平很低，和胚胎干细胞类似。

图12用GATA3和SOX2，KLF4，c-MYC(SKM)诱导的iPS细胞系基因表达谱和胚胎干细胞接近.

图13用GATA3和SOX2，KLF4，c-MYC(SKM)诱导的iPS细胞系具有三个胚层组织细胞类型的分化能力。比例尺为100μm。

图14用GATA3，GATA4，GATA6和SOX2，KLF4，c-MYC(SKM)诱导的iPS细胞系具有囊胚注射产生嵌合小鼠的能力。

图15用GATA3和SOX2，KLF4，c-MYC(SKM)诱导的iPS细胞系具有囊胚注射产生生殖嵌合的能力。

图16用GATA3和SOX2，KLF4，c-MYC(SKM)诱导的iPS细胞系经囊胚注射产生的嵌合小鼠的各个组织器官均可检测到供体iPS细胞的嵌合。

具体实施方式

以通过实施例进一步举例说明本发明。本领域的普通技术人员可以理解本发明并不限于所述实施例，并且本领域的普通技术人员可以基于说明书的教导对实施例进行修改。这些修改同样包含在本发明由后附的权利要求所定义的本发明的范围内。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

1.小鼠品系

转基因鼠品系：TgN(GOFGFP)11Imeg(OG)购自RIKEN BioResource Center。小鼠品系ICR购自维通利华。

2.细胞培养

原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)与新生小鼠皮肤细胞(MDF)均来自ICR×OG转基因小鼠。MEF和293T细胞培养基为含10％胎牛血清(FBS，Invitrogen)的DMEM(Hyclone)培养基。小鼠胚胎干细胞系R1和iPS细胞培养基为：80％DMEM/F12(Invitrogen)，N2，B27，1mM L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，0.055mM beta-巯基乙醇(均购自Invitrogen)以及1μMPD0325901，3μM CHIR99021(Stemgent)。小鼠胚胎干细胞系R1和iPS细胞培养在丝裂霉素C处理后的MEF饲养层细胞上，培养基每天换液。用胰酶消化传代。

3.iPS的产生

Tet-on慢病毒***详见(N.Maherali et al.，2008)。慢病毒的产生，收集与感染详见(Y.Zhao et al.，2008)。细胞感染24小时后的培养基为80％knockout DMEM，10％胎牛血清，10％敲除的血清替代物(KSR)，非必须氨基酸，100units/ml双抗，1mM L-谷氨酰胺，55μM β-巯基乙醇，1μg/ml Dox。每3天进行一次换液。感染8天后，细胞的培养基变为小鼠胚胎干细胞培养基。感染12天后，GFP阳性且形态象ips的克隆被挑出来并传代到小鼠胚胎干细胞培养基中。

4.ips的鉴定

RT-PCR分析，碱性磷酸酶检测，DNA芯片，畸胎瘤与嵌合体鉴定方法详见(Y.Li etal，.2010)。免疫组化鉴定所用一抗为SSEA-1(1∶100；Chemicon)，UTF1(1∶200；Abcam)，andNanog(1∶100；R&D)。二抗为罗丹明标记的驴抗兔IgG和罗丹明标记的羊抗鼠IgM(SantaCruz Biotechnology，1∶200)。DAPI用来进行核染。基因组PCR引物见表格1，RT-PCR引物见表格2。甲基化分析用的试剂盒是the CpGenome^TM Fast DNA modification kit(Millipore)。甲基化分析所用检测引物详见(K.Takahashi，S.Yamanaka，2006)。

表格1 基因组PCR引物

表格2 RT-PCR引物

中内胚层分化基因在重编程过程中替代OCT4的探索。

我们首先发现GATA3可以在OSKM，OSK重编程过程中替代Oct4(图2a-c)。并且GATA3还有替代cMyc与提高OSKM重编程效率的作用(图2a)。GATA3替代Oct4的ips诱导时间与OSKM基本一致(图3)。测试DOX诱导时间的实验表明GATA3的替代Oct4的作用主要发挥在后期(图4)。诱导产生的iPS克隆(图5)能够在体外长期传代，同时经检测，除了Oct4还表达胚胎干细胞的关键基因如碱性磷酸酶(图6)，Nanog，Utf1以及SSEA1(图7)。基因组PCR鉴定无Oct4污染(图8)。RT-PCR检测显示出这些iPS细胞系和胚胎干细胞系一样表达一些多潜能性的标志基因，而诱导iPS细胞系的体细胞则不表达(图9)。

此外，用GATA3和Sox2，Klf4，c-Myc(SKM)诱导的iPS细胞系的外源重编程基因已经基本沉默(图10)。DNA甲基化分析证明这类iPS细胞的Oct4和Nanog启动子去甲基化程度以及和鼠胚胎干细胞相类似(图11)。基因芯片分析结果亦表明GATA3替代Oct4产生的iPS细胞其基因表达谱和四因子诱导的iPS细胞和鼠胚胎干细胞相似(图12)。此外，GATA3替代Oct4产生的iPS细胞移植到免疫缺陷小鼠体内能够产生畸胎瘤(图13)。当GATA3替代Oct4产生的iPS细胞和八细胞胚胎融合并移植入小鼠囊胚内，那么这群iPSC来源的细胞能够在小鼠体内继续发育，生成嵌合鼠(图14)。并且，在17天的胚胎中能够观察到GFP阳性的细胞，证明iPSC来源的细胞能够发育为生殖细胞(图15)。分离嵌合鼠的组织器官进行基因组PCR检测可发现，嵌合鼠的各个组织器官中均可检测出供体细胞特异的Oct4-GFP基因片段(图16)，表明供体iPS细胞分化产物整合到了受体小鼠的各个组织器官中。因此，从整体而言，GATA3替代Oct4产生的iPS细胞具有和鼠胚胎干细胞相似的特性，即具有维持自我更新的能力以及分化的全能性。

因为GATA3属于中内胚层分化基因，我们推测其他中内胚层分化基因有可能也能替代Oct4。实验结果证实了我们的推测，其他中内胚层分化基因GATA 2，3，4，6与FOXA2，SIX1，PAX1也都具有在重编程过程中替代Oct4的能力(图1)。

参考文献：

1.N.Maherali et al.，Cell Stem Cell 3，340(2008).

2.Y.Zhao et al.，Cell Stem Cell 3，475(2008).

3.Y.Li et al.，Cell Research 21，196.

4.K.Takahashi，S.Yamanaka，Cell 126，663(2006).

Claims (20)

1.中内胚层分化发育相关因子作为诱导因子用于在OSKM或OSK重编程过程中通过替代Oct4来诱导多潜能干细胞产生的用途，其中所述中内胚层分化发育相关因子为选自GATA3,GATA6,GATA4,PAX1,GATA2,SIX1或FOXA2中的至少一个。

2.一种制备诱导多潜能干细胞的方法，包括向分化的细胞提供诱导因子的步骤，所述诱导因子包含在OSK重编程过程中的Sox2、Klf4和替代Oct4的中内胚层分化发育相关因子，其中所述分化的细胞来源于非人哺乳动物，其中所述中内胚层分化发育相关因子为选自GATA3,GATA6,GATA4,PAX1,GATA2,SIX1或FOXA2中的至少一个。

3.权利要求2的方法，其中所述诱导因子还包含在OSKM重编程过程中的c-Myc。

4.权利要求2或3的方法，其中所述分化的细胞是皮肤细胞，肝细胞，胃细胞，角质细胞或血液细胞。

5.权利要求2或3的方法，其中所述细胞来自胚胎期，刚出生后或成体期。

6.权利要求2或3的方法，其中所述分化的细胞来源于鼠或灵长类动物。

7.一种制备诱导多潜能干细胞的方法，包括向分化的细胞提供诱导因子的步骤，所述诱导因子包含在OSK重编程过程中的Sox2、Klf4和替代Oct4的中内胚层分化发育相关因子，其中所述分化的细胞来源于人，其中所述细胞来自刚出生后或成体期，其中所述中内胚层分化发育相关因子为选自GATA3,GATA6,GATA4,PAX1,GATA2,SIX1或FOXA2中的至少一个。

8.权利要求7的方法，其中所述诱导因子还包含在OSKM重编程过程中的c-Myc。

9.权利要求7或8的方法，其中所述分化的细胞是皮肤细胞，肝细胞，胃细胞，角质细胞或血液细胞。

10.一种制备诱导多潜能干细胞的试剂盒，包括诱导因子，所述诱导因子包含在OSK重编程过程中的Sox2、Klf4和替代Oct4的中内胚层分化发育相关因子，其中所述中内胚层分化发育相关因子为选自GATA3,GATA6,GATA4,PAX1,GATA2,SIX1或FOXA2中的至少一个。

11.权利要求10的试剂盒，其中所述诱导因子还包含在OSKM重编程过程中的c-Myc。

12.权利要求1的用途，其中所述中内胚层分化发育相关因子为GATA3。

13.权利要求2或3的方法，其中所述中内胚层分化发育相关因子为GATA3。

14.权利要求7或8的方法，其中所述中内胚层分化发育相关因子为GATA3。

15.权利要求10或11的试剂盒，其中所述中内胚层分化发育相关因子为GATA3。

16.权利要求1的用途，其中所述诱导因子是DNA,mRNA或蛋白形式。

17.权利要求2或3的方法，其中所述诱导因子是DNA,mRNA或蛋白形式。

18.权利要求7或8的方法，其中所述诱导因子是DNA,mRNA或蛋白形式。

19.权利要求10或11的试剂盒，其中所述诱导因子是DNA,mRNA或蛋白形式。

20.权利要求2-9中任一项的方法或权利要求10或11的试剂盒制备的诱导多潜能干细胞。