CN103130854A

CN103130854A - 维生素e琥珀酸酯化吉西他滨前药及应用

Info

Publication number: CN103130854A
Application number: CN2013100368080A
Authority: CN
Inventors: 罗宇; 杜芳; 余家会; 吕伟; 杨波; 何俏军
Original assignee: Zhejiang University ZJU; East China Normal University
Current assignee: Zhejiang University ZJU; East China Normal University
Priority date: 2013-01-31
Filing date: 2013-01-31
Publication date: 2013-06-05

Abstract

本发明公开了一种维生素E琥珀酸酯化吉西他滨前药，特点是：维生素E琥珀酸酯与吉西他滨的N4位氨基通过酰胺键相连，其具有下式结构；本发明的维生素E琥珀酸酯化吉西他滨前药，改善了dFdC代谢快的缺陷，延长了它在体内的循环时间，改变其进入细胞的模式，不再依赖核苷转运蛋白载体进入细胞，因此克服了耐药性的产生，同时最大限度降低其毒副作用，显著提高了疗效和生物利用度，突破了目前dFdC治疗胰腺癌临床效果不理想的瓶颈。

Description

维生素E琥珀酸酯化吉西他滨前药及应用

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物研发领域，具体地说是一种维生素E琥珀酸酯化吉西他滨（VES-dFdC）前药及应用。

背景技术

吉西他滨（Gemcitabine，dFdC），化学名称为（+）2‵-脱氧-2‵, 2‵-二氟胞嘧啶，是一种新型嘧啶类脱氧核苷类似物，能***至DNA链中脱氧胞苷的位点，并允许鸟苷与其配对,鸟苷的"掩蔽"使其免受核糖核酸外切酶的移除修复，然后导致DNA链合成停止，进而DNA断裂、细胞调亡。临床实践证明dFdC具有抗癌谱广，能与多种抗肿瘤药物有协同作用等特点，为当前联合化疗中常用的药物之一，尤其对治疗胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤有较好的疗效。然而dFdC 4’位上的氨基极易被脱氧胞苷脱氨酶代谢为羰基而失活，导致其体内半衰期短（仅有32～94分钟）。因此为了达到***所需要的最佳浓度，必须持续静脉注射给药，而这种持续性给药不仅仅给病患带来疼痛，同时也大大增加了毒副作用，严重影响治疗效果。此外，临床实践表明：dFdC治疗胰腺癌等肿瘤很容易产生耐药性，耐药性的产生通常导致治疗效果不理想，甚至治疗失败。dFdC耐药性的产生与其化学结构及理化性质密切相关。水溶性的dFdC必须通过特定的核苷转运蛋白载体进入细胞，当这种核苷转运蛋白缺失，肿瘤极易产生耐药性。因此，寻找新型高效，低毒副作用，对肿瘤组织或细胞有高渗透性的dFdC前体药物成为提高其治疗指数的有效措施。

对水溶性抗肿瘤药物而言，对其进行脂质化改造后不仅可以提高药物分子在体内的理化性质，药代动力学和药效动力学性质，而且因其结构与体内大部分膜组成成分类似，使其具有更好的膜渗透能力；此外，肿瘤生长需要大量的脂质作为能量来源，这就使得脂质化后的前药能在肿瘤组织中选择性聚集，从而产生更好地治疗效果，并降低对正常组织的毒副作用。专利（CN 102617679 A）用共轭亚油酸修饰dFdC的氨基，发现可以通过改变dFdC的脂溶性影响其跨细胞膜转运机制，以达到克服dFdC因核苷转运蛋白缺失而引起的耐药性。Zhengrong Cui等将dFdC的氨基用硬脂酸修饰得硬脂酸化吉西他滨，并进一步制成固体脂质纳米粒，发现硬脂酸化dFdC纳米粒对裸鼠肺癌肿瘤具有良好的抑制生长活性（Journal of Controlled Release, 157 (2012), 132–140）。

维生素E是一种脂溶性维生素，它的衍生物维生素E琥珀酸酯（VES）具有诱导多种肿瘤细胞凋亡的作用。值得一提的是，VES具有良好的抗肿瘤选择性，在杀死癌细胞的同时，对正常组织不会产生毒副作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种脂质化的吉西他滨前药，即针对dFdC和现有dFdC前体药物的不足，并充分考虑其产生抗肿瘤活性的机制，设计、合成了维生素E琥珀酸酯化吉西他滨酰胺（VES-dFdC）前药，并将该前药用作制备治疗胰腺癌等恶性肿瘤的药物。

本发明的目的是这样实现的：

一种维生素E琥珀酸酯化吉西他滨（VES-dFdC）前药，特点是：维生素E琥珀酸酯（VES）与吉西他滨（dFdC）的N4位氨基通过酰胺键相连，其具有以下结构：

Figure 2013100368080100002DEST_PATH_IMAGE002

一种维生素E琥珀酸酯化吉西他滨（VES-dFdC）前药的制备方法，该方法包括以下具体步骤：

a）氮气保护下，取维生素E琥酯、三乙胺溶于无水四氢呋喃中，将氯甲酸异丁酯溶于四氢呋喃滴加入反应体系，-15℃搅拌10～30 min形成混合酸酐溶液；其中：维生素E琥酯、氯甲酸异丁酯与三乙胺的投料摩尔比为1:1:1.2，维生素E琥酯的最优反应浓度为20-200 mM；

b) 将吉西他滨溶于无水N，N-二甲基甲酰胺，于-15℃滴加入混合酸酐溶液，氮气保护下室温搅拌48～72 h；其中：吉西他滨与维生素E琥酯的投料摩尔比为1:0.5～2，吉西他滨的最优反应浓度为20-200 mM；

c) 将步骤b)的反应液浓缩，粗产物分别用饱和碳酸氢钠和纯水洗涤，并用乙酸乙酯萃取，将有机相合并，加入无水MgSO₄充分干燥，柱层析法提纯，旋转蒸发除掉溶剂，真空干燥，得到所述维生素E琥珀酸酯化吉西他滨（VES-dFdC）前药；其中：柱层析使用的洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂，乙酸乙酯和石油醚的体积比为1～3:1。

一种维生素E琥珀酸酯化吉西他滨（VES-dFdC）前药的应用，特点是该前药在制备治疗胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、白血病药物上的应用。

本发明的前药依照现有技术，将VES-dFdC前药溶于乙二醇***，加入表面活性剂，制成淡黄色澄清溶液；该溶液用生理盐水或5%的葡萄糖注射液稀释，制成针剂。

本发明的维生素E琥珀酸酯化吉西他滨（VES-dFdC）前药，改善了dFdC代谢快的缺陷，延长了它在体内的循环时间，改变其进入细胞的模式，不再依赖核苷转运蛋白载体进入细胞，因此克服了耐药性的产生，同时最大限度降低其毒副作用，显著提高了疗效和生物利用度，突破了目前dFdC治疗胰腺癌临床效果不理想的瓶颈。

附图说明

图1为本发明前药的化学结构图；

图2为本发明前药的核磁谱图；

图3为本发明前药的红外谱图；

图4为本发明前药VES-dFdC的细胞毒性图；

图5为本发明前药针剂对移植瘤体积的影响曲线图；其中：曲线1为生理盐水组；曲线2为市售吉西他滨盐酸盐组；曲线3为实验合成吉西他滨盐酸盐组；曲线4为本发明的VES-dFdC组；

图6为本发明前药针剂对移植瘤的相对瘤体积的影响曲线图；其中：曲线1为生理盐水组；曲线2为市售吉西他滨盐酸盐组；曲线3为实验合成吉西他滨盐酸盐组；曲线为本发明的VES-dFdC组；

图7为本发明前药针剂对移植瘤的实验治疗作用效果图；其中：控制组为生理盐水组；G阳性为市售吉西他滨盐酸盐组；G受试为实验合成吉西他滨盐酸盐组；VE-G为本发明的VES-dFdC组。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不仅限于此。

实施例1、VES-dFdC前药的合成

取VES（530 mg, 1mmol），三乙胺（0.17 mL，1.2 mmol）溶于15 mL无水四氢呋喃(THF)，冷却至-15℃。待温度恒定后，将0.13 mL氯甲酸异丁酯溶于5 mL THF 滴加入反应体系中，氮气保护下-15℃反应30 min。取dFdC（263mg，1mmol）溶于15 mL N, N-二甲基甲酰胺（DMF），逐滴加入反应体系。滴加完毕后，室温搅拌72 h。将反应液浓缩，得到淡黄色油状液体，用饱和碳酸氢钠溶液和纯水先后洗涤数次，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，无水MgSO₄充分干燥，过滤，浓缩，得到白色粘稠固体。以乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂，柱层析法分离得到纯净产物为白色固体粉末，产率：53%，液相色谱纯度为99.4%；结构及结构表征见图1、图2及图3。

实施例2、VES-dFdC细胞毒性

将处在对数生长期BxPC-3细胞悬浮于新鲜的含有1%双抗和10%小牛血清的RPMI1640 培养基中，并接种于96 孔板中（5×10³ 个细胞/孔），于37℃和含有5%浓度的CO₂ 细胞培养箱中培养24 h，弃除该培养液，每孔加入溶有不同浓度的dFdC或VES-dFdC的新鲜培养基100 μL，继续培养24 h后，每孔再加入溶有5 mg/mL噻唑蓝的磷酸缓冲溶液10 μL，在37 oC和5% CO₂浓度的环境下继续培养4 h，吸出培养液，于每孔加入100 μL的二甲亚砜溶解甲臜，采用酶标仪（波长570 nm处）测定该甲臜溶液的吸光度（OD值），并应用如下公式计算BxPC-3细胞的相对存活率。

细胞存活率（%）=（OD_实验组/OD_对照组）× 100%

其结果见图4。

实施例3、VES-dFdC针剂抑制胰腺癌生长活性评价

将24只肿瘤生长均匀的裸鼠随机分为4组：（1）Control组，6只，每周一次尾静脉注射给予0.9% NaCl溶液0.1 mL/10g；（2）吉西他滨（上市药品）阳性组（50 mg/kg），6只，每周一次尾静脉注射给予5.0 mg/mL的吉西他滨溶液 0.1 mL/10g；（3）吉西他滨受试组（50 mg/kg），6只，每周一次尾静脉注射给予5 mg/ml的吉西他滨受试溶液 0.1 mL/10g；（4）VES-dFdC针剂组（50 mg/kg），6只，每周一次尾静脉注射给予5 mg/mL的VES-dFdC针剂0.1 mL/10g。每周测量肿瘤体积及体重两次，于第15天称量体重，测量肿瘤体积，处死裸小鼠后取瘤块称量瘤重，计算相对肿瘤体积（RTV）、相对肿瘤增值率（T/C）和肿瘤抑制百分率，做统计学分析。按下式计算肿瘤体积V:

V = 3.14 (a × b²) / 6

式中a, b分别为肿瘤最大和最小尺寸，结果见图5、图6及图7。

Claims

1.一种维生素E琥珀酸酯化吉西他滨前药，其特征在于维生素E琥珀酸酯与吉西他滨的N4位氨基通过酰胺键相连，其具有以下结构：

。

2.一种权利要求1所述前药的制备方法，其特征在于该方法包括以下具体步骤：

a）氮气保护下，取维生素E琥酯、三乙胺溶于无水四氢呋喃中，将氯甲酸异丁酯溶于无水四氢呋喃滴加入反应体系，-15℃搅拌10～30 min形成混合酸酐溶液；其中：维生素E琥酯、氯甲酸异丁酯与三乙胺的投料摩尔比为1:1:1.2，维生素E琥酯的反应浓度为20～200 mM；

b) 将吉西他滨溶于无水N，N-二甲基甲酰胺，于-15℃滴加入混合酸酐溶液，氮气保护下室温搅拌48～72 h；其中：吉西他滨与维生素E琥酯的投料摩尔比为1:0.5～2，吉西他滨的反应浓度为20～500 mM；

c) 将步骤b)的反应液浓缩，粗产物分别用饱和碳酸氢钠和纯水洗涤，并用乙酸乙酯萃取，将有机相合并，加入无水MgSO₄充分干燥，柱层析法提纯，旋转蒸发除掉溶剂，真空干燥，得到所述维生素E琥珀酸酯化吉西他滨前药；其中：柱层析使用的洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂，乙酸乙酯和石油醚的体积比为1～3:1。

3.一种权利要求1所述维生素E琥珀酸酯化吉西他滨前药的应用，其特征在于该前药在制备治疗胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌及白血病药物上的应用。