CN103125398B - 一种提高结球甘蓝离体再生效率的组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高结球甘蓝离体再生效率的组织培养方法，先取再生诱导率高的外植体；用次氯酸钠进行灭菌；嫩叶在诱导培养基上先进行16-20h的暗培养，再进行光培养；带腋芽的嫩茎段在诱导培养基上直接进行光培养；将诱导出的芽或丛生芽，转接在增殖培养基上，进行继代增殖；取生长健壮的单芽进行生根培养；生根后在室温下去掉封口膜进行练苗，然后把根部培养基清洗掉后，移栽在准备好的穴盘里。本发明解决不同外植体消毒时间的问题，解决了在结球甘蓝离体再生诱导过程中再生系数低的问题。本发明从消毒时间，外植体取材部位、不同激素配比方面建立了结球甘蓝最为高效的再生体系，为结球甘蓝种质资源的保存和开展结球甘蓝基因工程育种奠定基础。

Description

一种提高结球甘蓝离体再生效率的组织培养方法

技术领域

本发明属于植物生物技术和结球甘蓝栽培技术领域，尤其涉及一种提高结球甘蓝离体再生效率的组织培养方法。

背景技术

结球甘蓝属十字花科(Cruciferae)芸薹属（Brassica）的两年生草本植物，是我们重要蔬菜之一。两年生草本植物即当年经过营养生长期形成叶球。叶球通过贮藏越冬低温和来年长日照的影响，进入生殖生长期，抽苔开花结籽，完成生命过程。结球甘蓝具有适应性强、抗病、抗寒产量高、品质好，容易贮运、耐盐碱、栽培容易等特点。但在种质资源繁殖保存时受天气变化影响比较大，利用组织培养来保存可以减轻环境胁迫条件对结球甘蓝种质资源保存留种的不利影响。建立稳定的甘蓝组织培养再生体系是开展重要种质资源保护和基因工程的基础。甘蓝植株的再生能力强，但不同基因型、不同外植体及不同苗龄其再生频率有较大的差异。结球甘蓝离体再生的组织培养技术的研究有不少成功报道，但多数采用花药小孢子、不定芽叶片及无菌苗的子叶和下轴为外植体，在不同外植体取材部位、不同灭菌时间、不同激素配比等方面没有较具体的研究。本研究采用结球甘蓝嫩叶和带腋芽的嫩茎作为外植供体，建立了一种更为简单、更适合遗传转化的高频率植株再生体系。

发明内容

本发明提供了一种提高结球甘蓝离体再生效率的组织培养方法，建立了结球甘蓝高效再生体系。旨在解决不同外植体取材部位的消毒时间、不定芽和根诱导培养基的激素配比来改变再生系数低的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种提高结球甘蓝离体再生效率的组织培养方法，该组织培养方法包括以下步骤：

以选取离体再生诱导率高的外植体，在结球甘蓝抽薹开花末期取萌发的侧枝；

用7％的次氯酸钠进行灭菌，嫩叶和嫩茎灭菌时间分别为10min和20min；A3，叶片在诱导过程中先进行16-20h的黑暗培养，再进行光培养，培养15天后再进行转接一次；

嫩茎段的诱导，每个小茎段都带有腋芽进行诱导；

将诱导出的芽或丛生芽，进行继代增殖；不定芽长到3.0cm左右的时候，取生长健壮的单芽进行生根培养；选择根系发达的组培苗，先在室温下去掉封口膜进行练苗7d左右，把根部培养基清洗掉后，移栽在准备好的穴盘里。

进一步，该组织培养方法具体包括以下步骤：

第一、诱导

取材：在结球甘蓝抽薹开花末期取外植体，取萌发的无病斑和虫害的嫩侧枝，在枝条上部靠近心叶的第2-3片叶为嫩叶，取带柄嫩叶和去掉叶片的嫩枝上的嫩茎；

灭菌：将选好的田间外植体放在自来水下冲洗20-30min，再用蒸馏水冲洗3-4次后用吸水纸吸干水分；把嫩叶和嫩茎分开灭菌，各用75％的酒精消毒1min，再用7％Naclo进行消毒，嫩叶和嫩茎灭菌时间分别为10min和20min，消毒完后用无菌蒸溜水冲洗3-4次，接种在培养基上；

分化：灭菌后叶片切成0.5cm左右的方块，接种在MS+6-BA2mg.L^-1+NAA0.2mg.L^-1培养基上；片叶8-12片/瓶；处理10瓶，叶片的诱导要先进行16-20h的暗培养，在进行光培养，叶片在光培养15d后进行转接一次，把增大的叶片剪成小片培养，30d左右可以直接诱导出不定芽；把叶片去掉后的嫩茎段茎段灭菌后，切成带腋芽的茎段，切成0.5-1.0cm长的小段；每瓶接种5-10个小段；直接在光培养下培养，15d后就可看到诱导出的芽；

第二、继代增殖：将诱导出的芽或丛生芽，转接在MS+6-BA2mg.L^-1上，每瓶4-6个不定芽，25-30d左右进行转接一次，经过3-4代的培养，芽的倍数达200倍左右的增长；

第三、根的诱导：单芽或丛生芽生长到3.0cm左右的时候，取生长健壮的单芽进行生根培养，培养基MS+NAA0.3mg.L^-1，每个处理接10瓶，每瓶接5-6个单芽，15d后调查记载诱导生根率达到95％左右，25-30d根系健壮发达；

第四、移栽与定植：选择根系发达的组培苗，先在正常室温下去掉封口膜进行练苗7d左右，把根部培养基清洗掉后，移栽在准备好的穴盘里；基质选用育苗基质。采用潮湿的基质装盘，以用手一抓成团，一松及散为宜；移栽时为了使根系与栽培基质充分结合，移栽后把穴盘放在水池里，自然吸水，吸足水后放在阴凉处，1周左右即可成活，穴盘保持干干湿湿，成活率达100％。

进一步，外植体枝条最上部靠近生长点的第2、3片嫩叶，带叶柄取下，去掉叶片的侧枝取嫩茎。

进一步，嫩叶诱导培养基为MS+6-BA2mg.L^-1+NAA0.2mg.L^-1；取带腋芽的茎段0.5-1.0cm，直接在MS+6-BA2mg.L^-1上诱导培养；诱导出的芽，转接在增殖培养基MS+6-BA2mg.L^-1上培养，经过3-4代的培养，芽的倍数达200倍左右的增长；生根培养基选用MS+NAA0.3mg.L^-1，获得生长健壮根系发达的生根苗。

进一步，温度控制在22-25℃，每天光照16/8h，光照强度2000-2500Lx，培养基中加30g.L^-1蔗糖和7g.L^-1琼脂粉，PH5.8-5.9。

进一步，用潮湿的基质装盘，以用手一抓成团，一松及散为宜；移栽时为了使根系与栽培基质充分结合，移栽后把穴盘放在水池里，自然吸水，吸足水后放在阴凉处，成活率达到100％。

本研究以结球甘蓝为材料，用优化取材部位、灭菌时间和培养基配方，来减少污染率，提高诱导分化率，提高再生系数和根系的诱导，建立了嫩叶叶片和和带腋芽的嫩茎段的离体高效再生体系，为结球甘蓝种质资源的保护和开展结球甘蓝基因工程育种奠定基础。本发明提供了一种简单的离体再生植株的方法，与现有技术相比有如下优点和积极效果。

附图说明

图1、图A为叶片培养15d左右的表现；图B为叶片培养诱导出的不定芽；

图2、带腋芽茎间诱导出的芽；

图3、不定芽继代再生的芽；

图4、图A再生芽在生根培养基上诱导生根；图B为小苗移栽于营养钵中；

C成活苗。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例是这样实现的，一种提高结球甘蓝离体再生效率的组织培养方法，该组织培养方法包括以下步骤：

1诱导

1.1取材：在结球甘蓝抽薹开花末期取外植体，取萌发的无病斑和虫害的嫩侧枝，在枝条上部靠近心叶的第2-3片叶为嫩叶，取带柄嫩叶和去掉叶片的嫩枝上的嫩茎。

1.2灭菌：将选好的田间外植体放在自来水下冲洗20-30min，再用蒸馏水冲洗3-4次后用吸水纸吸干水分；把嫩叶和嫩茎分开灭菌，各用75％的酒精消毒1min，再用7％Naclo进行消毒，嫩叶和嫩茎灭菌时间分别为10min和20min，消毒完后用无菌蒸溜水冲洗3-4次，接种在培养基上；

1.3分化：灭菌后叶片切成0.5cm左右的方块，接种在MS+6-BA2mg.L^-1+NAA0.2mg.L^-1培养基上；片叶8-12片/瓶；处理10瓶，叶片的诱导要先进行16-20h的暗培养，在进行光培养，叶片在光培养15d后(如图1A)进行转接一次，把增大的叶片剪成小片培养，30d左右可以直接诱导出不定芽(如图1B)；把叶片去掉后的嫩茎段茎段灭菌后，切成带腋芽的茎段，切成0.5-1.0cm长的小段；每瓶接种5-10个小段。直接在光培养下培养，15d后就可看到诱导出的芽；

2继代增殖：将诱导出的芽或丛生芽，转接在MS+6-BA2mg.L^-1上，每瓶4-6个不定芽，25-30d左右进行转接一次，经过3-4代的培养，芽的倍数达200倍左右的增长。

3根的诱导：单芽或丛生芽生长到3.0cm左右的时候，取生长健壮的单芽进行生根培养，培养基MS+NAA0.3mg.L^-1，每个处理接10瓶，每瓶接5-6个单芽，15d后调查记载诱导生根率达到95％左右，25-30d根系健壮发达(如图4A，B)。

4移栽与定植：选择根系发达的组培苗，先在正常室温下去掉封口膜进行练苗7d左右，把根部培养基清洗掉后，移栽在准备好的穴盘里。基质选用育苗基质。采用潮湿的基质装盘，以用手一抓成团，一松及散为宜。移栽时为了使根系与栽培基质充分结合，移栽后把穴盘放在水池里，自然吸水，吸足水后放在阴凉处，1周左右即可成活，穴盘保持干干湿湿，成活率达100％。

在本发明实施例中，诱导与增殖培养基的配比：诱导培养基组成，在MS固体培养基培养基组成的基础上，通过添加不同浓度的NAA和6-BA，如下处理，①添加浓度为0.4mg·L^-1NAA，及0、0.5、1.0、1.5、2.0mg·L^-1的6-BA；②添加浓度为2.0mg·L^-16-BA，及0、0.05、0.1、0.2、0.4mg·L^-1的NAA。增殖培养基组成，MS固体培养基，添加两种浓度梯度的6-BA和五种不同浓度梯度的NAA，6-BA浓度为1.0mg.L^-1和2.0mg.L^-1，分别添加0、0.05、0.1、0.2、0.4mg.L^-1的NAA。在研究过程中筛选出了，嫩叶诱导培养基为MS+6-BA2mg.L^-1+NAA0.2mg.L^-1，带腋芽茎段的诱导培养基与增值培养基同为MS+6-BA2mg.L^-1，使诱导率和增殖系数提高；

在本发明实施例中，生根培养基配比：采用培养基1/2MS和MS+NAA0.3mg.L^-1进行生根，筛选出MS+NAA0.3mg.L^-1培养基配比为最佳，获得根系发达的健壮苗(如图4)。

以下通过具体的实验方案对本发明作进一步的说明。

1.材料

供试材料为田间自交系结球甘蓝，在春季抽薹开花末期取其萌发的无病虫害的侧枝，取枝条上的嫩叶(包括叶柄)、老叶、嫩茎作为外植体备用。

2.方法

2.1消毒处理

枝条最上部靠近生长点的第2、3片嫩叶，带叶柄取下；枝条最下部第2、3片老叶，不带叶柄取下；去下叶片的枝条取嫩茎。在超净工作台上，将清洗干净的叶片和嫩茎分别装入在无菌的容器里，用75％的酒精消毒1min，再用7％NaClO进行消毒，设8、10、15、20、25、30min6个消毒时间，消毒完后用无菌蒸溜水冲洗3-4次，接种在培养基上。每个处理10瓶，每瓶接种6-10个外植体，接种7d后统计一次污染率，15d后统计一次启动率。消毒时间30min接种后叶片、茎段、表现为枯死状，消毒时间短8min污染率高。说明消毒时间太短或太长对结球甘蓝外植体诱导都产生影响。消毒时间短污染率高，时间长污染降低了，但植物细胞的死亡，失去了再生能力，启动率同时也降低了，所以消毒的最佳时间：嫩叶10min，老叶15min，嫩茎段20min。

污染率＝(污染的外植体数/接种的外植体总数)×100％

启动率＝(未污染外植体启动数/未污染外植体总数)×100％

2.2不定芽诱导

试验分别对不同的取材部位：老叶、嫩叶、嫩叶叶柄、带腋芽的茎段，在9种配比的培养基上进行不定芽的诱导。培养基是在MS固体培养基培养基组成的基础上通过添加不同浓度的NAA和6-BA，如下处理。①添加浓度为0.4mg·L^-1NAA，及0、0.5、1.0、1.5、2.0mg·L^-1的6-BA；②添加浓度为2.0mg·L^-16-BA，及0、0.05、0.1、0.2、0.4mg·L^-1的NAA。

灭菌后叶片切成0.5cm左右的方块，叶柄切成0.5-1cm长的小段；嫩茎段茎段灭菌后，切成带腋芽的茎段，切成0.5-1.0cm长的小段；接种于添加有不同激素的愈伤诱导培养基上。各处理共接10瓶，8-12片/瓶，叶片的诱导要先进行16-20h的暗培养，在进行光培养，培养15d后叶片明显增大再进行转接一次，把增大的叶片剪成小片培养，30d左右可以直接诱导出不定芽。带腋芽的嫩茎段每瓶接种5-10个小段。从外植体取材部位来看，带腋芽的嫩茎段分化诱导不定芽的速度快且诱导率最高，其次是嫩叶。嫩叶叶柄、老叶诱导率很低。嫩叶诱导不定芽不经过愈伤组织阶段直接从叶片上分化产生。从培养基的诱导来看，取材部位不同对培养基的要求不同，采选出了诱导的最佳培养基，嫩叶是MS+6-BA2.0mg.L^-1+NAA0.2mg.L^-1，带腋芽嫩茎是MS+6-BA2.0mg.L^-1+NAA0mg.L^-1。

2.3增殖培养

将诱导出的不定芽或丛芽取下，转接在增殖培养基上，增殖培养基选用：MS固体培养基，添加2种浓度梯度的6-BA和5种不同浓度梯度的NAA，6-BA浓度为1.0mg.L^-1和2.0mg.L^-1，分别添加0、0.05、0.1、0.2、0.4mg.L^-1的NAA。诱导出的不定芽每个处理接种10瓶，每瓶4-6个不定芽，15-20d开始调查记载，发现不定芽的再生与培养基的激素配比有直接关系，6-BA浓度为2.0mg.L^-1，NAA浓度只有在0mg.L^-1时，增殖系数达到3.0以上，没有根生成，成长健壮；其余增值系数在2.0-3.0之间，且有根生成。筛选出了MS+6-BA2mg.L^-1+NAA0mg.L^-1为最佳增殖培养基，诱导出的不定芽，增殖系数高且没有根系生成，每个不定芽每次平均可以增殖4-5个不定芽，提高了再生系数。

2.4根的诱导与移栽

经过增殖达到需要的数量，选生长健壮的无菌苗进行生根培养，培养基选用常用的1/2MS和MS+NAA0.3mg.L^-1两种，以MS+NAA0.3mg.L^-1生根诱导率高，表现明显，诱导率可高达95％左右，且根系生长健壮。获得生长健壮根系发达的生根苗后，先在正常室温下去掉封口膜进行练苗7d左右，移栽时把根部培养基清洗掉后，用潮湿的基质装盘，以用手一抓成团，一松及散为宜；为了使根系与栽培基质充分结合，移栽后把穴盘放在水池里，自然吸水，吸足水后放在阴凉处，成活率达到100％。

3、结论

通过调节不同外植体的消毒时间，及正确的操作方法，能减少污染提高诱导效果。优选出了结球甘蓝离体诱导再生最为理想的外植体，是嫩叶和带腋芽的茎段；优选出了最佳诱导、增殖和生根培养基，分别是MS+6-BA2mg.L^-1+NAA0.2mg.L^-1，MS+6-BA2mg.L^-1，MS+NAA0.3mg.L^-1。

附注：MS基本培养基组成

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种提高结球甘蓝离体再生效率的组织培养方法，其特征在于，该组织培养方法包括以下步骤：

以选取离体再生诱导率高的外植体，在结球甘蓝抽薹开花末期取萌发的侧枝；

用7％的次氯酸钠进行灭菌，嫩叶和嫩茎灭菌时间分别为10min和20min；叶片在诱导过程中先进行16-20h的黑暗培养，再进行光培养，培养15天后再进行转接一次；

嫩茎段的诱导，每个小茎段都带有腋芽进行诱导；

将诱导出的芽或丛生芽，进行继代增殖；不定芽长到3.0cm左右的时候，取生长健壮的单芽进行生根培养；选择根系发达的组培苗，先在室温下去掉封口膜进行练苗7d左右，把根部培养基清洗掉后，移栽在准备好的穴盘里；

该组织培养方法具体包括以下步骤：

第一、诱导

取材：在结球甘蓝抽薹开花末期取外植体，取萌发的无病斑和虫害的嫩侧枝，在枝条上部靠近心叶的第2-3片叶为嫩叶，取带柄嫩叶和去掉叶片的嫩枝上的嫩茎；

灭菌：将选好的田间外植体放在自来水下冲洗20-30min，再用蒸馏水冲洗3-4次后用吸水纸吸干水分；把嫩叶和嫩茎分开灭菌，各用75％的酒精消毒1min，再用7％NaClO进行消毒，嫩叶和嫩茎灭菌时间分别为10min和20min，消毒完后用无菌蒸溜水冲洗3-4次，接种在培养基上；

分化：灭菌后叶片切成0.5cm左右的方块，接种在MS+6-BA2mg.L^-1+NAA0.2mg.L^-1培养基上；叶片8-12片/瓶；处理10瓶，叶片的诱导要先进行16-20h的暗培养，再进行光培养，叶片在光培养15d后进行转接一次，把增大的叶片剪成小片培养，30d左右可以直接诱导出不定芽；把叶片去掉后的嫩茎段灭菌后，切成带腋芽的茎段，切成0.5-1.0cm长的小段；每瓶接种5-10个小段；直接在光培养下培养，15d后就可看到诱导出的芽；

第二、继代增殖：将诱导出的芽或丛生芽，转接在MS+6-BA2mg.L^-1上，每瓶4-6个不定芽，25-30d进行转接一次，经过3-4代的培养，芽的倍数达200倍左右的增长；

第三、根的诱导：单芽或丛生芽生长到3.0cm左右的时候，取生长健壮的单芽进行生根培养，培养基MS+NAA0.3mg.L^-1，每个处理接10瓶，每瓶接5-6个单芽，15d后调查记载诱导生根率达到95％左右，25-30d根系健壮发达；

第四、移栽与定植：选择根系发达的组培苗，先在正常室温下去掉封口膜进行练苗7d左右，把根部培养基清洗掉后，移栽在准备好的穴盘里；基质选用育苗基质；采用潮湿的基质装盘，以用手一抓成团，一松即散为宜；移栽时为了使根系与栽培基质充分结合，移栽后把穴盘放在水池里，自然吸水，吸足水后放在阴凉处，1周左右即可成活，穴盘保持干干湿湿，成活率达100％；

外植体枝条最上部靠近生长点的第2、3片嫩叶，带叶柄取下，去掉叶片的侧枝取嫩茎；

嫩叶诱导培养基为MS+6-BA2mg.L^-1+NAA0.2mg.L^-1；取带腋芽的茎段0.5-1.0cm，直接在MS+6-BA2mg.L^-1上诱导培养；诱导出的芽，转接在增殖培养基MS+6-BA2mg.L^-1上培养，经过3-4代的培养，芽的倍数达200倍左右的增长；生根培养基选用MS+NAA0.3mg.L-1，获得生长健壮根系发达的生根苗；

温度控制在22-25℃，每天光照16/8h，光照强度2000-2500Lx，培养基中加30g.L^-1蔗糖和7g.L^-1琼脂粉，pH5.8-5.9；

用潮湿的基质装盘，移栽时为了使根系与栽培基质充分结合，移栽后把穴盘放在水池里，自然吸水，吸足水后放在阴凉处，成活率达到100％。