CN103122030A - 一种水蛭肽和制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种水蛭肽和制备方法及其应用,属于多肽及其制备领域。本发明重组水蛭素在大鼠体内的代谢过程中发现,其在大鼠体尿中的代谢产物具有更强的抗凝血酶活性。经过提取、分离和结构与鉴定,发现这种代谢产物为一组重组水蛭素C端去掉17-12个氨基酸的N端保留的水蛭肽,即水蛭肽rH1-51,水蛭肽rH1-52及其两者的混合物。制备方法主要为大鼠静脉给药,收集尿液,采用凝胶色谱(GF-HPLC)并结合反相高效液相色谱(RP-HPLC)提取纯化,即得。本发明提供的水蛭肽免疫原性将显著的降低,有望成为新一代抗血栓新药,具有良好的发展前景和临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于多肽及其制备领域,特别涉及一种水蛭肽和制备方法
背景技术
世界卫生组织统计年鉴指出,心血管疾病﹑恶性肿瘤﹑呼吸器官疾病﹑车祸和***依次分别是目前世界上的五大死因。我国心血管疾病年死亡人数达百万人,随着人们生活水平的提高,心血管疾病将日趋严重。
冠心病是心血管疾病的重要类型,其发病机制与动静脉血栓形成及血栓栓塞有关,主要是由于血脂代谢异常,引起血管内膜的炎性免疫反应和血小板聚集,在动脉内一些类似粥样的脂类物质堆积而成白色斑块,血管狭窄到一定程度,血栓形成,称为动脉粥样硬化病变。这些斑块渐渐增多造成动脉腔狭窄,使冠心病是世界上最常见的、致死率最高的慢性疾病之一。
随着我国社会经济的快速发展、生活方式的改变以及人口老龄化,冠心病的发病率呈逐年增长的趋势。世界卫生组织预测我国每年有超过100万人死于冠心病。冠心病将严重威胁人民生命和健康,并为社会和家庭带来沉重的经济负担。为此,加强开展以冠心病为代表的心血管疾病的药物开发,具有较高的社会价值。
目前,多肽类药物水蛭素是较为常用的天然的凝血酶特异性抑制剂,分为水蛭素(Hirudin,H)及重组水蛭素(recombine Hirudin,rH),其含有65-66个氨基酸,具有良好的抗凝、抗动静脉血栓作用以及毒副作用低等特点,已经引起国内外各大厂商的高度重视。但是肽类药物临床应用的副作用,主要是免疫原性。也就是说,肽类药物的分子量愈大其免疫原性越大。分子量越小其免疫原性越小,由于水蛭素及重组水蛭素其分子量较大,具有半抗原性,影响其在临床的使用。因此,临床使用中需要抗原反应低,抗血栓作用明显的多肽类药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种水蛭肽和制备方法,该水蛭肽为一组抗凝血酶活性物质,其为重组水蛭素(recombine Hirudin,rH)在大鼠尿中的代谢产物,即为rH1-51或rH1-52或两者的混合物,本发明不仅保留了重组水蛭素的抗凝血酶的活性,而且由于分子量(5000D左右)较重组水蛭素(7000D)小,免疫原性明显降低,减少不良反应的发生。
本发明的水蛭肽rH1-51序列见序列表SEQ ID No.1;
本发明的水蛭肽rH1-52序列见序列表SEQ ID No.2;
本发明的水蛭肽为水蛭肽rH1-51和水蛭肽rH1-52两者的混合物。
重组水蛭素(rH)的原型结构如下:
本发明的制备方法如下:
(1)大鼠尾静脉注射重组水蛭素,注射剂量为6mg/kg,收集给药后0.5-4h的尿液,以供分离提取代谢产物;
(2)用凝胶色谱法对空白和样品尿液进行初步分离,色谱条件:凝胶柱流动相:0.02mol/l的PBS溶液,pH7.0,流速0.5-1.0ml/分钟,检测波长为215nm。收集流出液,每分钟收集1管。取收集液,-70℃冷冻,冷冻干燥保存;
(3)将凝胶色谱收集到的收集液进行再用C8反相色谱法纯化,色谱条件为:八烷基硅烷键合硅胶柱,进样量20μl,梯度洗脱,乙腈:0.1%TFA25min内从15:85变至45:55,流速0.5ml/min,检测波长为215nm。反复进样,收集2个水蛭肽rH1-51和rH1-52及其混合物,-70℃冷冻,冷冻干燥保存;
(4)水蛭肽rH1-51的的序列见序列表SEQ ID No.1,rH1-52的序列见序列表SEQ ID No.2;
本发明中的重组水蛭素为N端结构为[Ile1,Thr2]-63-脱硫酸基的重组水蛭素,由大连高新生物制药有限公司提供。
在对N端结构为[Ile1,Thr2]-63-脱硫酸基的重组水蛭素进行大鼠体内代谢研究发现,其代谢产物仍然具有水蛭素样的抗凝血酶活性,我们对其进行提取分离和结构分析,确认其为一组从重组水蛭素C端去掉14-15个氨基酸的小肽,具有抗凝酶活性,小肽的分子量为5160D,氨基酸序列为重组水蛭素氨基酸1-51处及1-52处。
本发明的主要特点是通过降低水蛭素的分子量,进而降低水蛭素的免疫原性,并保持水蛭素的抗凝血酶活性不变。本发明的水蛭肽分子量(5000D左右)较水蛭素(7000D)小,因而免疫原性将显著的降低,有望成为新一代抗血栓新药,具有良好的发展前景和临床应用价值。显示出作为制备的药物的应用前景。
以下实施例子进一步解释本发明的内容,但并不用以限制本发明。
实施例1(1)大鼠100只,尾静脉注射重组水蛭素,注射剂量为6mg/kg。收集给药后4h的尿液,以供分离提取代谢产物;
(2)用凝胶色谱法对空白和样品尿液进行初步分离。色谱条件:凝胶柱,TSK-GELG2000SW 7.5mm×30.0cm,进样量为20μl,流动相:0.02mol/l的PBS溶液,pH7.0,流速0.5ml/min,检测波长为215nm。收集流出液,每分钟收集1管。取16,17,20,21,22,23min的收集液,-70℃冷冻,隔日用冷冻干燥器进行冷冻干燥,备用;
(3)将凝胶色谱收集到的16-23min的收集液进行再用C8反相色谱法次分离。色谱条件:C8柱,进样量20μl,梯度洗脱,乙腈:0.1%TFA 25min内从15:85变至45:55,流速0.5ml/min,检测波长为215nm。反复进样,收集14,15分钟的峰,-70℃冷冻,隔日用冷冻干燥器进行冷冻干燥,得到水蛭肽rH1-51为4mg和rH1-52为13mg及两者的混合物7mg。
实施例2
(1)大鼠100只,尾静脉注射重组水蛭素,注射剂量为6mg/kg。收集给药后0.5h的尿液,以供分离提取代谢产物;
(2)用凝胶色谱法对空白和样品尿液进行初步分离。色谱条件:凝胶柱,TSK-GELG2000SW 7.5mm×30.0cm,进样量为20μl,流动相:0.02mol/l的PBS溶液,pH7.0,流速0.8ml/min,检测波长为215nm。收集流出液,每分钟收集1管。取16,17,20,21 min的收集液,-70℃冷冻,隔日用冷冻干燥器进行冷冻干燥,备用;
(3)将凝胶色谱收集到的16-21min的收集液进行再用C8反相色谱法次分离。色谱条件:C8柱,进样量20μl,梯度洗脱,乙腈:0.1%TFA 25min内从15:85变至45:55,流速0.5ml/min,检测波长为215nm。反复进样,收集14,15分钟的峰,-70℃冷冻,隔日用冷冻干燥器进行冷冻干燥,得到水蛭肽rH1-51为3mg和rH1-52为11mg及两者的混合物6mg。
实施例3
分子量的测定
将上述水蛭肽rH1-51和rH1-52,将提取的代谢产物,经飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)测定其分子量。检测条件:N2激光源,波长337nm;检测方式:正离子,线性方式(飞行管长1.5m,加速电压20kV);基质:CCA,水蛭肽rH1-51和rH1-52经飞行时间质谱测定分子量均为5162。
实施例4
抗凝血酶活性的测定
本法是以甲苯磺酰基-氨基乙酰基-脯氨酰基-精氨酰-对-硝基苯胺(Tosyl-glycyl-polyl-arginine-para-nitraniline;商品名:Chromozym TH)为底物,凝血酶能水解Chromozym TH释放出对-硝基苯胺(para-nitraniline,pNA),pNA在405nm处有特异性吸收。rH能与凝血酶定量的结合,使凝血酶失去水解底物的活性,通过测定反应体系中未被rH抑制的凝血酶的量,间接测定rH的含量。本实验以rH为标准品制备标准曲线,测定出rH1-51和rH1-52抗凝血酶的活性。
1、标准曲线的制备
重组水蛭素为凝血酶的特异性抑制剂,凝血酶能水解生色底物(Chromozym TH,CT),释放出对硝基苯胺,对硝基苯胺在405nm波长处有吸收,在一定的范围内,凝血酶的量与释放出的对硝基苯胺的量成正比。而重组水蛭素能与凝血酶按1:1的分子比相结合,当定量过量的凝血酶与重组水蛭素反应后,通过测定剩余的凝血酶的量,即可测定出抗凝血酶的活性物质的量。表1为重组水蛭素的浓度与对应的OD值;对应的标准曲线为y=-0.0054x+0.4456,R2=0.974。
表1、标准品(重组水蛭素)的浓度与吸光度值(OD)(n=5)
2、水蛭肽rH1-51和rH1-52抗凝血酶活性的测定
将冷冻干燥后的水蛭肽rH1-51和rH1-52溶解后测定其抗凝血酶活性,结果见表2,3。
表2、水蛭肽rH1-51抗凝血酶活性的测定
表3、水蛭肽rH1-52抗凝血酶活性的测定
抗凝血酶的活性与吸光度(OD值)成反比,实验结果表明水蛭肽rH1-51和rH1-52有较高的抗凝血酶的活性。
实施例4
抗血栓作用
1、方法
雄性大鼠40只,随机分为7组,即正常对照组、rH组、水蛭肽rH1-51组、水蛭肽rH1-52组和肝素钠组,每组10只。将大鼠腹腔注射乌拉坦1g/kg,剖腹分离下腔静脉,于左肾静脉下方置一条线备结扎血管用,自尾静脉注射不同的受试药物,正常对照组注射0.9%生理氯化钠注射液。5min结扎下腔静脉造成淤血,然后关闭腹腔,6h后再次打开腹腔,与结扎下方2.0cm处夹闭血管,纵行剖开取出血栓,60℃干燥4h后称血栓重,记录有无血栓形成及血栓干重。以正常对照组为基准计算各组血栓形成比率以及血栓干重抑制率。
2、结果
各组大鼠静脉注射不同样品后,下腔静脉血栓形成及干重结果见表4.
表4 不同样品对大鼠下腔静脉血栓形成的影响
由表4可见,相同剂量的水蛭肽rH1-51或rH1-52或其混合物与重组水蛭素(rH)相比,小分子量的水蛭肽抗血栓作用的效果更强。
Claims (6)
1.一种水蛭肽,其特征在于:水蛭肽rH1-51的序列见序列表SEQ ID No.1或水蛭肽rH1-52的序列见序列表SEQ ID No.2或水蛭肽rH1-51和水蛭肽rH1-52的混合物。
2.如权利要求1所述的序列,其特征在于:水蛭肽rH1-51由51个氨基酸组成,序列见序列表SEQ ID No.1。
3.如权利要求1所述的序列,其特征在于:水蛭肽rH1-52由52个氨基酸组成,序列见序列表SEQ ID No.2。
4.如权利要求1所述的序列,其特征在于:水蛭肽为水蛭肽rH1-51和水蛭肽rH1-52两者的混合物,序列见序列表SEQ ID No.1和2。
5.一种权利要求1所述的水蛭肽的制备方法如下:
(1)大鼠尾静脉注射重组水蛭素,注射剂量为6mg/kg,收集给药后0.5-4h的尿液,以供分离提取代谢产物,所述的重组水蛭素为N端结构为[Ile1,Thr2]-63-脱硫酸基的重组水蛭素;
(2)用凝胶色谱法对空白和样品尿液进行初步分离,色谱条件:凝胶柱流动相:0.02mol/l的PBS溶液,pH7.0,流速0.5-1.0ml/分钟,检测波长为215nm,收集流出液,每分钟收集1管;取收集液;
(3)将凝胶色谱收集到的收集液进行再用C8反相色谱法纯化,色谱条件为:八烷基硅烷键合硅胶柱,进样量20μl,梯度洗脱,乙腈:0.1%TFA25min内从15:85变至45:55,流速0.5ml/min,检测波长为215nm,反复进样,收集水蛭肽rH1-51或水蛭肽rH1-52或两者的混合物;
(4)水蛭肽rH1-51的序列见序列表SEQ ID No.1;水蛭肽rH1-52的序列见序列表SEQ ID No.2。
6.权利要求1所述的水蛭肽在制备抗血栓药物中的应用。
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