CN103122029B - Klk14蛋白亲和层析纯化人重组spink6蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人重组SPINK6蛋白的亲和层析纯化方法，包括：将人重组KLK14蛋白与亲和层析介质混合，偶联反应，制得人重组KLK14蛋白亲和层析介质；将人重组SPINK6蛋白通过预先用缓冲液A平衡好的装有上述的胰蛋白酶亲和层析介质的层析柱；然后用缓冲液A清洗上样后的人重组KLK14蛋白亲和层析柱；再用缓冲液B将SPINK6蛋白从层析柱上洗脱，并收集洗脱峰。采用本发明的方法，人重组SPINK6蛋白的活性回收率为45-60％，纯度可达90％-95％，蛋白纯化倍数为10-20倍以上。本发明方法处理速度快、重复性好、柱效长且结合效率基本不变。

Description

KLK14蛋白亲和层析纯化人重组SPINK6蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种重组蛋白的纯化方法，具体涉及人重组SPINK6蛋白的亲和层析纯化方法。
背景技术
肿瘤是目前人类死亡率最高的疾病之一，现有的药物对肿瘤的治疗效果较差，特别是在肿瘤的复发和转移方面缺少有效的手段。市场迫切需要新型的***的药物。
丝氨酸蛋白酶抑制物Kazal型(SPINK)家族与慢性胰腺炎，食管癌等疾病关系密切。该家族主要由SPINK1、SPINK2、SPINK4、SPINK6等亚家族组成。SPINK6基因序列是NCBI于2006年公开的一个人源基因序列，其序列在文献：(MartinC.Wapenaar，Alienke J.Monsuur et al；Immunogenetics，2007，59：349-357)中有详细的报道。有研究发现了SPINK6蛋白的抗肿瘤活性(专利申请号：PCT/CN2009/074410)。该研究实验结果表明：当SPINK6基因在癌细胞株中过量表达时，使得癌细胞株失去了在软琼脂上形成克隆、在裸鼠体内成瘤能力，用基因工程的方法表达得到的重组SPINK6蛋白也可以有效抑制肿瘤细胞在裸鼠体内的成瘤；其中(专利申请号：PCT/CN2009/074410)还构建了一种含有SPINK6基因的大肠杆菌和酵母菌的基因工程菌，并成功表达了重组SPINK6蛋白。但是上述研究方法中没有明确详细的阐明纯化方法，实际的纯化过程中存在纯化效率低、回收率差、纯度只能达到80％左右，尚不能满足药用的纯度要求。因此寻找一种专一性好、产品纯度高、样品吸附量大的重组SPINK6蛋白的纯化工艺是目前本技术领域中十分迫切需要解决的难题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的上述缺陷，主要解决的技术问题是公开一种KLK14蛋白亲和层析纯化人重组spink6蛋白的方法。
本发明的技术方案是这样的：
最新的研究结果表明，SPINK6蛋白作为激肽释放酶(KLK)家族的特异性抑制剂在皮肤角质层组织中发挥重要作用，其对KLK14的抑制作用尤为明显。本发明通过实验证明，当SPINK6与KLK14蛋白1∶1孵育时，即可基本完全抑制KLK14的活性。在此基础上，本发明通过偶联有KLK14蛋白的亲和填料纯化人重组SPINK6蛋白，旨在获得高纯度的人重组SPINK6蛋白从而满足后续体内实验。
具体而言，本发明的KLK14蛋白亲和层析纯化人重组SPINK6蛋白的方法，其特征在于，其包括步骤：
(1)制备亲和层析介质
本发明中，参考GE公司出版的CNBr活化的Sepharose4B的使用说明书，进行亲和层析介质的制备。具体步骤如下：将亲和介质用pH2.0-3.0的HCl溶液进行溶胀、清洗，HCl溶液的用量为亲和介质的50-100倍体积量，然后用亲和介质的10-20倍的体积量的偶联液进行清洗，使亲和层析介质的pH达到7.5-10.0；
所用的偶联液为含有0.15-0.6M NaCl的NaHCO3溶液(pH8.0-10.0)；
将人重组KLK14蛋白以重量比1∶200-400溶解在偶联液中，然后与上步用偶联液清洗过的亲和介质混合，在室温条件振荡0.5-2小时，或于4℃条件下放置12-36小时，使人重组KLK14蛋白与亲和介质偶联充分；然后用偶联液清洗制得的亲和层析介质，偶联液用量为制得的亲和层析介质体积的5-20倍；再用亲和介质体积1-5倍的0.5M-1M的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)或1-2M乙醇胺溶液浸泡放置2-4小时，用于封闭亲和层析介质中未被结合的活性位点；
所说的人重组KLK14蛋白购自R&D公司，人重组KLK14蛋白与亲和层析介质的重量比为1∶20-150；
所说的亲和层析介质选自交联琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、丙烯酰胺聚合物、共聚物及其衍生物、聚甲基丙烯酸酯衍生物、聚醚砜或脱乙酰壳多糖中的一种或一种以上。
(2)人重组SPINK6蛋白用亲和层析介质进行纯化
用0.01-0.1mol/L pH7.0-9.0含0.05-0.15mol/L NaCl缓冲液A平衡装有亲和层析介质的层析柱；
将人重组SPINK6蛋白样品以10-75cm/h上样至预平衡好的层析柱；
所说的单位cm/h为流速单位，即缓冲液每小时通过介质材料的高度。然后用0.01-0.1mol/L pH7.0-9.0含0.05-0.15mol/L NaCl的缓冲液A清洗上样后的亲和层析柱；
再用0.1-0.5mol/L pH 2.5-4.5含0.05-0.15mol/L NaCl的缓冲液B以10-55cm/h的流速将人重组SPINK6蛋白从层析柱上洗脱并收集洗脱峰；缓冲液B的用量为层析柱体积的3-10倍；洗脱液收集在装有0.5-2mol/L pH7.0-9.0的缓冲液中A；
所说的人重组SPINK6蛋白样品为依照专利(专利申请号：PCT/CN2009/074410)制备的含人重组SPINK6蛋白基因的毕氏酵母发酵上清液经离子交换步骤纯化后的洗脱峰(SPINK6蛋白含量为0.01-0.08mg/ml，纯度为75％-80％)与缓冲液A以体积比1∶1混合而成的；
所说的缓冲液A平衡亲和层析柱包括如下步骤：
将0.01-0.1mol/L pH7.0-9.0含0.05-0.15mol/L NaCl的缓冲液A以介质流速通过装有亲和层析介质的层析柱，用量为层析柱体积的3-10倍，通过紫外检测保证层析柱已清洗至基线；
所说的缓冲液A清洗上样后的亲和层析柱包括如下步骤：
用0.01-0.1mol/L pH7.0-9.0含0.05-0.15mol/L NaCl的缓冲液A以介质流速清洗上样后的亲和层析柱，用量为层析柱体积的3-10倍，通过紫外检测保证层析柱已清洗至基线；
所说的pH7.0-9.0的缓冲液A选自PBS、Tris-HCl缓冲液中的一种或一种以上；
所说的pH 2.5-4.5的缓冲液B选自醋酸-醋酸钠、NaHPO4-柠檬酸、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的一种或一种以上；
所说的各种缓冲液的配制方法参考《分子克隆》第二版，附录B：分子克隆中使用的试剂与缓冲液的配制；上海科学出版社，1993。
本发明获得的人重组SPINK6蛋白的回收率为45-60％，纯度可达90％-95％，蛋白纯化倍数为10-20倍以上，处理速度快、重复性好、柱效长；按照本发明方法制备的亲和层析介质的吸附柱不仅柱效长(4℃下，20％乙醇保存柱效大于一年)且结合效率基本不变(0.35mg/ml亲和介质)。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的KLK14蛋白亲和层析纯化人重组SPINK6蛋白的方法进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
附图说明
图1为重组SPINK6蛋白亲和层析图谱。
图2为重组SPINK6蛋白SDS-PAGE分析。
具体实施方式
实施例1制备人重组KLK14蛋白亲和层析介质
将0.5克CNBr活化的Sepharose4B干粉(1克干粉可溶胀至3.5ml胶)置于10mM HCl中并迅速用150ml 10mM HCl于烧结玻璃漏斗中进行抽滤清洗15分钟并抽至半干。将13mg胰蛋白酶溶于5ml偶联缓冲液并缓慢加入预处理后的胶(CNBr活化Sepharose-4B)中，室温下摇床缓慢振荡2小时。偶联后，用20ml偶联缓冲液于烧结玻璃漏斗中对胶进行清洗除去未结合的蛋白随后将胶置于1MTris-HCl pH8.0中封闭活性位点1小时，封闭液的用量为10ml。用0.1M Tris-HClpH 8.0含0.5MNaCl和0.1M醋酸缓冲液pH 4.0含0.5M NaCl交替洗涤3个循环。最后在Tris-HCl体系下将胶装入1cm×10cm柱中，柱体积为2ml。收集偶联后清洗缓冲液27ml，通过lowry法测定蛋白浓度为0.1mg/ml，总量为2.7mg，继而计算偶联率。
实施例2人重组KLK14亲和层析纯化人重组SPINK6蛋白
亲和介质：偶联有人重组KLK14蛋白的Sepharose4B凝胶1.5ml，预先装入10ml容积层析柱。
样品：人重组SPINK6蛋白样品为依照专利(专利申请号：PCT/CN2009/074410)制备的含人重组spink6蛋白基因的毕氏酵母发酵上清液经离子交换步骤纯化后的洗脱峰(SPINK6蛋白含量为0.05mg/ml，纯度为80％)25ml与平衡缓冲液以体积比1∶1混合而成的样品缓冲液50ml。
层析设备：AKTA explorer 100蛋白纯化***，购自GE生物技术公司。
平衡、清洗缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl(pH8.0)含0.1mol/L NaCl缓冲液。
洗脱缓冲液：0.1mol/L Gly-HCl(pH2.8)含0.15mol/L NaCl缓冲液。
中和缓冲液：1mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液。
平衡：用平衡缓冲液平衡装有1.5ml偶联有人重组KLK14蛋白的Sepharose4B凝胶层析柱，柱高为2cm，以50cm/h流速平衡5个柱体积，通过紫外检测(A280)保证层析柱已平衡至基线。
上样：将50ml样品缓冲液以40cm/h通过经平衡缓冲液平衡好的胰蛋白酶的Sepharose4B凝胶层析柱。上样时样品保持冰浴，待紫外检测变化时开始收集流穿峰。
清洗：上样完，用清洗缓冲液以50cm/h的流速清洗层析柱，用量为层析柱体积的5倍，待紫外检测(A280)至基线时停止收集流穿峰，共收得55ml流穿液。
洗脱：清洗至基线后，用洗脱缓冲液以20cm/h的流速将人重组SPINK6蛋白从层析柱上洗脱下来，待紫外检测变化时开始收集洗脱峰，缓冲液用量为层析柱柱体积的4倍。在洗脱液收集管中预先加入中和缓冲液，收集洗脱峰2.5ml，实验结果如图1所示，其中峰1为重组SPINK6蛋白洗脱峰，峰2为重组SPINK6蛋白流穿峰。通过SDS-PAGE对重组SPINK6蛋白进行纯度鉴定，结果如图2所示。图中泳道M为低分子量标准蛋白(Mark)，泳道1、2、3为人重组KLK14亲和柱纯化的SPINK6蛋白。将该结果用电泳分析软件bandscan5.0进行分析，结果显示，经人重组KLK14亲和纯化后，SPINK6蛋白的纯度可达到到95.3％。通过BCA法测定纯化过程中各步缓冲液中的重组SPINK6蛋白含量，经计算，其中上样缓冲液中含蛋白量为1.25mg，流穿0.55mg，洗脱缓冲液中0.7mg，蛋白回收率达56％。表1SDS-PAGE电泳纯度检验。
表1 SDS-PAGE电泳纯度检验

Claims (1)

1.KLK14蛋白亲和层析纯化人重组SPINK6蛋白的方法，其特征在于，其包括步骤：
亲和介质：偶联有人重组KLK14蛋白的Sepharose4B凝胶1.5ml，预先装入10ml容积层析柱；
样品：人重组SPINK6蛋白样品为含编码人重组spink6蛋白的基因的毕氏酵母发酵上清液经离子交换步骤纯化后的洗脱峰，SPINK6蛋白含量为0.05mg/ml，纯度为80％，25ml洗脱峰；
层析设备：AKTA explorer 100蛋白纯化***；
平衡、清洗缓冲液：含0.1mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl pH8.0缓冲液；
洗脱缓冲液：含0.15mol/L NaCl的0.1mol/L Gly-HCl pH2.8缓冲液；
中和缓冲液：1mol/L Tris-HCl，pH8.0的缓冲液；
平衡：用平衡缓冲液平衡装有1.5ml偶联有人重组KLK14蛋白的Sepharose4B凝胶层析柱，柱高为2cm，以50cm/h流速平衡5个柱体积，通过紫外检测保证层析柱已平衡至基线；
上样：将50ml样品缓冲液以40cm/h通过经平衡缓冲液平衡好的KLK14蛋白的Sepharose4B凝胶层析柱，上样时样品保持冰浴，待紫外检测变化时开始收集流穿峰；
清洗：上样完，用清洗缓冲液以50cm/h的流速清洗层析柱，用量为层析柱体积的5倍，待紫外检测A280至基线时停止收集流穿峰，共收得55ml流穿液；
洗脱：清洗至基线后，用洗脱缓冲液以20cm/h的流速将人重组SPINK6蛋白从层析柱上洗脱下来，待紫外检测变化时开始收集洗脱峰，缓冲液用量为层析柱柱体积的4倍；在洗脱液收集管中预先加入中和缓冲液，收集洗脱峰2.5ml，分析可知，峰1为重组SPINK6蛋白洗脱峰，峰2为重组SPINK6蛋白流穿峰。
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