CN103118531B - 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种抗性芸苔属植物及其制备 - Google Patents

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种抗性芸苔属植物及其制备 Download PDF

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Abstract

本发明涉及野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)抗性芸苔属植物及其种子、果实和/或植物部分，及其制备方法。特别是，本发明涉及Xcc抗性甘蓝菜植株、及其种子、果实和植株部分，及其制备方法。另外，本发明还涉及提供本发明的Xcc抗性的数量性状位点(QTL)和分子标记，特别是用于鉴定本发明的QTL的随机扩增的微卫星多态性(RAMP)标记。

Description

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种抗性芸苔属植物及其制备
说明
本发明涉及野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris py.campestris)(Xcc)抗性芸苔属植物及其种子、果实和/或植物部分，及其制备方法。具体说，本发明涉及Xcc抗性甘蓝植物。本发明还涉及这些抗性植物的种子、果实和/或其它植物部分。另外，本发明还涉及提供本发明的Xcc抗性的数量性状基因座(QTL)和分子标记，特别是用于鉴定本发明的QTL的随机扩增的微卫星多态性(RAMP)标记。
微生物野油菜黄单胞菌野油菜致病变种是十字花科植物黑腐病的主要病因。在世界范围内，该微生物可能是十字花科疾病的主要病原体。黑腐病常见于欧洲、美洲、亚洲、澳大利亚和大洋洲的部分。该细菌病的主要宿主植物是甘蓝。然而，黑腐病也见于其它十字花科植物，杂草或装饰植物中。野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的感染通常在叶子的排水器中发生，在一些情况下也见于气孔或伤口中。原发性感染后，该微生物通过维管束散播，从而导致维管变黑，和叶子中的V形损伤。结果，叶子的一部分或多个部分枯萎变黄。
野油菜黄单胞菌野油菜致病变种是一种可通过种子传播的疾病，能够在发病早期通过种子感染植物。
该微生物能够在种子上存活长达三年之久。该微生物的感染还能通过植物部分储藏、次级宿主植物和灌溉***发生。
通过化学药物控制这种疾病是不可能的。抵抗该疾病的唯一可行的方法是使用无病害，即无微生物的起始材料和卫生措施，例如除去受感染宿主植物。可通过使用无病原体的种子或物理处理受感染的种子来获得无病害起始材料。为了栽培健康植物，即无Xcc植物，特别优选使用和获得抗性植物品种，其在生长季节期间仍然不受Xcc感染。
芸苔属是芸苔科(先前所称十字花科)的植物属。该属的成员也被称为包心菜或芥菜。芸苔属包括许多重要的农业和园艺作物，包括油菜、花椰菜、红球甘蓝、 皱叶甘蓝、白球甘蓝、牛心甘蓝、羽衣甘蓝、椰菜、芽甘蓝、大白菜、球茎甘蓝和葡萄牙甘蓝(tronchuda)。
芸苔属植物的各种植物部分可食用，例如根(球茎甘蓝)、茎(球茎甘蓝)、叶(例如白球和红球甘蓝)、腋芽(芽甘蓝)、花(花椰菜、椰菜)。另外，油菜和油菜籽也被用于提供植物油。种植一些开白花或紫花，或具有不同颜色或叶子性状的品种用于装饰。
考虑到芸苔属植物对于食物生产的重要性，以及与野油菜黄单胞菌野油菜致病变种感染有关的经济损失，本发明的目的之一是提供Xcc抗性芸苔属植物及其制备方法。
缺乏控制黑腐病的充分、经济和有效的手段进一步表明需要Xcc抗性芸苔属植物。例如，对该细菌没有有效杀菌剂。
通过如权利要求1所述的提供Xcc抗性芸苔属植物的方法实现本发明的上述目的和其它目的。
特别是，本发明的上述目的等是通过提供野油菜黄单胞菌野油菜致病变种抗性芸苔属受体植物的以下方法实现的，该方法包括：-选择第一甘蓝供体植物，其在基因组内含有数量性状基因座1(QTL1)；选择第二甘蓝供体植物，其在基因组内含有数量性状基因座2(QTL2)；和将来自第一供体植物的数量性状基因座1(QTL1)和来自第二供体植物的数量性状基因座2(QTL2)基因渗入或基因组合并入甘蓝受体植物；其中，
数量性状基因座1(QTL1)的特征是一个或多个RAMP标记，选自158-162bp的片段，具有引物组合SEQ ID No：1和引物6；283-287bp的片段，具有引物组合SEQ ID No：2和引物6；370-374bp的片段，具有引物组合SEQ ID No：3和引物6；以及41-45bp的片段，具有引物组合SEQ ID No：4和引物6。
数量性状基因座2(QTL2)的特征是一个或多个RAMP标记，选自88-92bp的片段，具有引物组合SEQ ID No：5和引物6；125-129bp的片段，具有引物组合SEQ ID No：6和引物6；334-338bp的片段，具有引物组合SEQ ID No：7和引物6；和47-51bp的片段，具有引物组合SEQ ID NO：8和引物6；和
其中，就基因组而言，所述芸苔属受体植物与第一和第二甘蓝供体植物不同。
根据本发明的该第一个方面，通过确定与各供体植物基因组中本发明Xcc抗 性的存在相关的数量性状基因座(QTL)的存在来选择或鉴定第一和第二供体植物。
优选通过使用本领域公知的标准分子生物学技术作出这种确定。这些技术的一个例子包括分离可能供体植物的基因组DNA，然后通过例如PCR、DNA指纹法或Southern印迹法确定分离的基因组中相关数量性状基因座(QTL)的存在。
一种特别优选的鉴定各供体植物基因组内存在本发明基因座的方法是DNA指纹技术，在本领域中被称作随机扩增的微卫星多态性，或RAMP。根据这种技术，用本发明的引物(SEQ ID NO：1-8)和RAPD引物(Operon RAPD 10聚体试剂盒A-01-BH-20)，对分离的供体植物的基因组材料进行PCR反应或核酸扩增反应。
PCR反应后，可通过例如凝胶电泳分离获得的扩增产物，可用例如分子碱基对梯来确定其以碱基对计的大小。本发明的数量性状基因座1和2(QTL1和QTL2)的特征至少是存在指定的碱基对长度，以及可能的多条不同大小的其它条带，其并不指示抗性。
选择合适的供体植物后，可将供体植物中鉴定出的合适基因座(QTL1和QTL2)引入或基因重组入所需受体植物的基因组。这可通过使用标准杂交(crosses)或基因渗入来实现，其中在子代中优选通过测定上述标记的存在来确定本发明的QTL的继承。特别优选的技术是重复回交，优选联合标记分析。
根据本发明，就其基因组而言，芸苔属受体植物与第一和第二甘蓝供体植物不同。在本文中，
这可通过指示供体和受体植物基因组的供体和受体植物之间的不同表型，或通过普通基因组分析来轻易确定。因此，术语“就其基因组而言，不同……”在本发明中指在供体植物和受体植物之间有一种或多种与Xcc抗性无关的表型差异。换言之，本发明的受体植物在本领域中一般被当成不同植物。
根据本发明的一个优选例，第一芸苔属供体植物和第二芸苔属供体植物就它们的基因组而言是相同的。这意味着选择第一和第二供体植物包括选择一种在其基因组中同时包含QTL1和QTL2的供体植物。换言之，该优选例包括鉴定一种合适的芸苔属供体品种，其同时具有QTL1和QTL2，然后在所需芸苔属受体植物中引入QTL1和QTL2，从而对该受体植物提供Xcc抗性。
根据本发明的优选例，该数量性状基因座1(QTL1)的特征是一个或多个RAMP标记，选自160bp的片段，具有引物组合1.1(SEQ ID No：1)和引物6；285bp 的片段，具有引物组合1.2(SEQ ID No：2)和引物6；372bp的片段，具有引物组合1.3(SEQ ID No：3)和6；以及43bp的片段，具有引物组合1.4(SEQ ID No：4)和6。根据本发明的另一个优选例，该数量性状基因座2(QTL2)的特征是一个或多个RAMP标记，选自90bp的片段，具有引物组合2.1(SEQ ID No：5)和6；127bp的片段，具有引物组合2.2(SEQ ID No：6)和6；336bp的片段，具有引物组合2.3(SEQ ID No：7)和6；以及49bp的片段，具有引物组合2.4(SEQ ID No：8)和6。
根据本发明的一个具体优选例，选择供体植物包括通过分子生物学技术确定或鉴定各芸苔属供体植物中1或多个，优选2或多个，更优选3或多个，或最优选4个各QTL的本发明RAMP标记的存在。
根据本发明的最优选例，选择或鉴定还包括在第一和第二芸苔属供体植物中选择纯合数量性状基因座1和2(QTL 1和2)。
本发明的芸苔属受体植物优选是甘蓝植物，优选自：Brassica oleracea convar.botrytis var.botrytis(花椰菜，罗马花椰菜)，Brassica oleracea convar.botrytis var.cymosa(椰菜)，Brassica oleracea convar.botrytis var.asparagoides(嫩茎甘蓝)，Brassica oleracea convar.oleracea var.gemnifera(芽甘蓝)，Brassica oleracea convar.capitata var.alba(白球甘蓝，牛心甘蓝)，Brassica oleracea convar.capitata var.rubra(红球甘蓝)，Brassica oleracea convar.capitata var.sabauda(皱叶甘蓝)，Brassica oleracea convar.acephela var.sabellica(羽衣甘蓝)，Brassica oleracea convar.acephela var.gongyloides(球茎甘蓝)和Brassica oleracea var.tronchuda syn.costata(葡萄牙甘蓝)。
考虑到上述Xcc抗性芸苔属植物的优点，本发明在另一个方面涉及如上定义的芸苔属受体植物，及其种子、果实和/或其它植物部分，在其基因组中包括：
上述数量性状基因座1(QTL1)和数量性状基因座2(QTL2)。
根据该方面的一个具体优选例，本发明涉及保藏号为NCIMB41553的芸苔属植物，及其种子、果实和/或其它植物部分。
根据另一个方面，本发明涉及如上定义的数量性状基因座1(QTL1)和数量性状基因座2(QTL2)的用途，用于提供野油菜黄单胞菌野油菜致病变种抗性芸苔属受体植物。
根据另一个方面，本发明涉及一种或多种引物的用途，这些引物选自SEQ ID No：1-8(分别是引物1.1，1.2，1.3，1.4，2.1，2.2，2.3和2.4)，用于提供本发明的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种抗性芸苔属受体植物。
用下列优选实施方式的例子进一步举例说明本发明。该实施例是说明性的，并不是要以任何方式限制以所附权利要求确定的本发明的范围。
附图简要说明 
图1显示了田间试验，其中存在Xcc抗性和Xcc易感性芸苔植物。图2以全彩色显示了图1的相同图像。
实施例
在甘蓝中进行野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)抗性育种是个复杂的过程。描述了几种不同的Xcc，在甘蓝中通常观察不到Xcc抗性。本文所述的甘蓝对Xcc的抗性具有数量性质，即抗性及其水平由遗传背景决定。这意味着有几种基因与此抗性有关，从而才能观察到此种程度的Xcc抗性。
为了获得数量抗性的甘蓝植物，即观察到抗性独立于遗传背景，使用抗性基本为隐性的遗传来源。通过回交程序在不同的遗传背景中(易感性亲本品系)引入抗性。通过田间试验确定植物的抗性水平。由于所涉及的性状是隐性的，每次与易感性植物杂交后要经过近交世代(inbreed generation)，以获得纯合形式的性状。必需在田间试验中测试该世代的子代的抗性水平。结果，对于一年生植物至少需要两年，对于两年生植物至少需要四年来观察新杂交的效应。
由于涉及的抗性可以表示成不同水平的抗性，抗性能表达成数量值(以0-9表示，其中0代表完全敏感，9代表完全抗性)。已显示在不同遗传背景下的抗性显示正常分布范围内的表型分级，而不是简单的孟德尔遗传。
该分布可以向易感性漂移，暗示抗性来源和各种易感性亲本品系之间的杂交产生的近交世代可提供不同水平的抗性植物。
基于分离比率(segregation ratio)和抗性水平中的差异，显示植物的抗性水平是由数个遗传因子或数量性状基因座决定的。为了鉴定数量性状的指标性或代表性DNA标记，常用QTL分析。QTL是独立的染色体区域，其与潜在基因联合，解释 或表明遗传性状。对不同遗传背景的甘蓝种群使用DNA标记进行跨基因组QTL分析。使用这些不同种群的植物进行田间试验，以确定各植株的抗性水平。标记分析的数据和田间试验评分能够鉴定引起所观察到的Xcc抗性的QTL。
总的说，鉴定出6种独立遗传的QTL，其在某种程度上对所观察到的抗性水平有贡献。在田间，植株之间观察到的抗性水平的变化是QTL的存在和/或不存在及其不同组合所致。在鉴定出的6种QTL中，两种QTL(在本文中称作QTL1和QTL2)在每种遗传背景下都存在，提供抗性。换言之，这两种QTL表示一种质上的抗性，而其余4种QTL贡献于量上的抗性。这些QTL之一，即QTL1，可被认为是主要QTL，即其对所观察到的抗性贡献最大。
通过育种获得的每种野油菜黄单胞菌野油菜致病变种抗性近交品系都拥有这种主要QTL。与主要QTL相似的第二QTL抗性水平有量上的贡献。然而，该贡献并不如主要QTL那么大，虽然它也独立于遗传背景。
在不同的遗传背景下发现了剩余的4种QTL。这4种QTL可能作用改变，导致抗性水平也改变。
下文表1证明了这一点，其中甘蓝植株1-6例证了这些观察结果。
表1多种QTL对Xcc抗性的影响概览
    QTL1   QTL2   QTL3   QTL4   QTL5   QTL6   抗性水平
 植株1   +   +   +   +   +   +   抗性
 植株2   +   +   ±   ±   ±   ±   抗性
 植株3   -   -   -   -   -   -   易感
 植株4   -   +   +   +   +   +   易感
 植株5   +   -   +   +   +   +   易感
 植株6   -   -   +   +   +   +   易感
该表图例：+存在
±视确切的遗传背景可能存在。-不存在
使用与两种主要QTL，即QTL1和QTL2相关的DNA标记为选择对Xcc抗性的植物提供了机会。
单独的疾病测试不能天然提供具有纯合形式的两种QTL的植株。疾病测试也 可能得到具有高度抗性水平的植株，其具有纯合形式的一种或多种QTL，其本身并不提供稳定抗性。
用一千株以上的植株进行疾病测试只可能作有限次数的杂交。然而，使用DNA标记为分析一千株植株的更大群体，以预选所需植株提供了机会。
此外，用DNA标记的筛选也为进行维持两个主要QTL的重复回交提供了机会。该方法的每代杂交可以节约一或二年，意味着能够使得育种计划加速10-20年。这种更迅速的方法能加速将新Xcc抗性引入杂交变体。
杂交变体生产中另一个复杂因素是在两个亲本中都必需存在隐形抗性。优选两个亲本品系或供体植株对于两种主要QTL是纯合的。通过使用DNA标记可在较短时间内鉴定出两种主要QTL的纯合亲本，因此适于产生新的抗性杂交子。
这种杂交子的种子保藏在英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心，阿伯丁，苏格兰，AB21，9YA，英国，保藏号为NCIMB 41553。
两个主要QTL的特征都是4个DNA标记，其代表了来源中QTL的存在。QTL1是主要QTL，QTL2是次要QTL。
用RAMP技术产生DNA标记。结合iSSR和RAPD引物的RAMP技术提供的条带图案中包括一个或多个与抗性共分离的DNA片段。通过对RAMP片段和表型抗性评分作图，鉴定出能够识别QTL的密切相关的RAMP标记(表2)。QTL内DNA标记之间的遗传距离用厘摩(cM)表示。
用于产生DNA标记的通用PCR条件如下： 
用于RAMP反应的PCR混合物：每次反应
～0.2ng/μl基因组植物DNA
75mM Tris-HCL(pH 8.8)
20mM NH4SO4
0.01％(v/v)Tween20
2.8mM MgCl2
0.25mM dNTPs
0.15μM正向引物
0.20μM反向引物
0.04单位/μl Red Hot DNA聚合酶(ABgene，Epsom)
PCR程序RAPD35：
                                               轮次
步骤1：2分钟，93℃                             1 
步骤2：30秒93℃
步骤3：30秒35℃
步骤4：0.3℃/秒加热到72℃
步骤5：1分钟，30秒72℃
重复步骤2-5                                    40 
步骤6：5分钟，72℃                             1 
PAGE/Licor：
为了分析RAMP模式，使用″基因读数IR 4200 DNA分析仪″(Licor公司)。
基于6.5％丙烯酰胺的最佳浓度，可分离大小差异为1个碱基的片段。为了在该***中观察片段，必需使用标记的(IRDye标记)引物。为此，用具有相同序列的标记引物替换1/3量的正向引物。
标记概况
在达成本发明的研究中，如表3所示的引物用于产生表2所示的DNA标记。
表2：每个QTL的RAMP标记概览
 QTL   RAMP标记组合   片段大小(bp)  QTL中的位置(cM)
 1   1.1+6   160  10，1
 1   1.2+6   285  18，5
 1   1.3+6   372  20，9
 1   1.4+6   43  21，3
 2   2.1+6   90  28，5
 2   2.2+6   127  29，4
 2   2.3+6   336  36，3
 2   2.4+6   49  37，2
表3：SEQ ID NO的概况
用各种引物组合进行PCR反应，提供了代表各种QTL存在的具有指定碱基对大小(见表2)的核酸片段。这些DNA标记物代表，或指明了所关注的QTL。这些QTL的特征性DNA标记组合提供了在受体植物中来自Xcc抗性来源的QTL基因渗入的不容置疑的证据。
定义
cM-厘摩-标记之间的遗传距离单位，基于每一百个个体中的交换数。
DNA标记-一种DNA片段，其与一种基因或在基因组中位置已知的另一DNA片段连接，用于监测该基因或该位置的遗传。
凝胶电泳-根据大小、形状或电荷在基质(琼脂糖或聚酰胺)中在电场影响下分离分子(DNA、RNA、蛋白质)的方法。
近交世代(自花受粉)-对个体用自己的花粉受精。
基因渗入-通过杂交，将一个品系((栽培)品种)的染色体片段引入另一个品系((栽培)品种)。
标记-用于Licor显影***的红外标记，其在700nm或800nm下检测。
单基因的-由一个基因决定。
PCR(聚合酶链式反应)用于使特定DNA片段倍增的体外扩增法。该合成反应使用最少一个与DNA片段杂交的寡核苷酸引物，
然后，DNA聚合酶通过连续温度周期扩增旁侧区域。
引物-一种短寡核苷酸(约20-50bp)，其与单链DNA分子互补，作为聚合酶的起始点。
QTL(数量性状基因座)-一种独立染色体区域，当与基因联合时共同解释一种性状。
RAMP(随机扩增微卫星多态性-基于RAPD和iSSR引物的DNA指纹分析技术，可检测不同DNA样品之间的多态性。
RAPD引物(随机扩增的多态性DNA引物)-一种具有“随机”序列的10聚体，其中GC含量在60％-70％之间，引物末端不与自身互补。
iSSR(简单序列重复区间)-一种设计在SSR(简单序列重复，一种由2或3个核苷酸的重复构成的DNA片段)的5’端的引物
BC(回交)-将个体与其原始亲本之一杂交。
XCC野油菜黄单胞菌野油菜致病变种

Claims (7)

1.提供野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris py.Campestris)抗性芸苔属受体植物的方法，包括：-选择第一甘蓝(Brassica oleracea)供体植物，其在基因组中含有数量性状基因座1(QTL1)和数量性状基因座2(QTL2)，其中所述甘蓝供体植物是保藏号为NCIMB41553的甘蓝植物；和
-将数量性状基因座1(QTL1)和数量性状基因座2(QTL2)基因渗入或基因组合并入甘蓝(Brassica oleracea)受体植物；其中，
数量性状基因座1(QTLl)的特征是一个或多个RAMP标记，选自158-162bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:1和引物6；283-287bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:2和引物6；370-374bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:3和引物6；以及41-45bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:4和引物6；
数量性状基因座2(QTL2)的特征是一个或多个RAMP标记，选自88-92bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:5和引物6；125-129bp的片段，具有引物组合SEQID No:6和引物6；334-338bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:7和引物6；
和47-51bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:8和引物6；
其中引物6是Operon公司的聚体试剂盒A-01-BH20。
2.如权利要求1所述的方法，其中数量性状基因座1(QTL1)的特征是一个或多个RAMP标记，选自160bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:1和引物6；285bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:2和引物6；372bp的片段，具有引物组合SEQ IDNo:3和引物6；以及43bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:4和引物6，
其中引物6是Operon公司的聚体试剂盒A-01-BH20。
3.如权利要求1所述的方法，其中数量性状基因座2(QTL2)的特征是一个或多个RAMP标记，选自90bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:5和引物6；127bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:6和引物6；336bp的片段，具有引物组合SEQ IDNo:7和引物6；以及49bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:8和引物6；
其中引物6是Operon公司的聚体试剂盒A-01-BH20。
4.如权利要求1-3任一所述的方法，其中数量性状基因座(QTL1)和/或数量性状基因座2(QTL2)的特征是两个或多个RAMP标记。
5.如权利要求1-3任一所述的方法，其中数量性状基因座(QTL1)和/或数量性状基因座2(QTL2)的特征是三个或更多个所述RAMP标记。
6.如权利要求1-3任一所述的方法，其中数量性状基因座(QTL1)和/或数量性状基因座2(QTL2)的特征是四个或更多个所述的RAMP标记。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述甘蓝受体植物选自：Brassica oleraceaconvar.botrytis var.botrytis(花椰菜,罗马尼亚语),Brassica oleracea convar.botrytisvar.cymosa(椰菜),Brassica oleracea convar.botrytis var.asparagoides(嫩茎花椰菜),Brassica oleracea convar.oleracea var.gemnifera(芽甘蓝),Brassica oleraceaconvar.capitata var.alba(白球甘蓝、牛心甘蓝),Brassica oleracea convar.capitatavar.rubra(红球甘蓝),Brassica oleracea convar.capitata var.sabauda(皱叶甘蓝),Brassica oleracea convar.acephela var.sabellica(羽衣甘蓝),Brassica oleraceaconvar.acephela var.gongyloides(球茎甘蓝)和Brassica oleracea var.tronchuda syn.costata(葡萄牙甘蓝)。
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