CN103113627B - 一种用于细胞培养的多糖/Matrigel复合凝胶膜及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于细胞培养的多糖/Matrigel复合凝胶膜及其制备方法和应用。该多糖/Matrigel复合凝胶膜中含有多糖和Matrigel，采用钙离子作为交联剂，通过留延法制备。该方法过程简单且制备的复合凝胶膜可模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，能够促进多种细胞的增殖。可根据细胞类型的不同选择不同用量的交联剂进而调节基底刚度以调控细胞的粘附和分化行为。同时该复合凝胶膜具有良好的力学性能，可适合细胞的长期培养。成本相对低廉，应用更加安全。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养的技术领域，具体涉及一种用于细胞培养的多糖/Matrigel复合凝胶膜及其制备方法和应用。
背景技术
细胞扩增是细胞治疗和组织工程发展的必要前提，近年来发展的多种规模化培养贴壁细胞的新措施，已经在工程细胞系等大规模培养中广泛应用，即通过模拟细胞在体内的生长微环境与增殖活动，控制其扩增与定向分化是培养细胞的基本出发点。目前多用具有良好生物相容性材料来模拟细胞外基质，促进细胞的体外扩增，主要包括透明质酸、胶原、壳聚糖、海藻酸盐、明胶等。近年来，Matrigel由于其独特的性能在细胞培养中受到越来越多的关注，Matrigel在EHS小鼠肿瘤中分离出，主要包含层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含有一些微量的生长因子、表皮生长因子、转化生长因子-β、纤维细胞生长因子等。适用于作为多种细胞的培养基底，构建多种组织。但是其价格昂贵，同时其操作不方便，使其在细胞扩增培养上的大规模应用受到了一定的限制。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种用于细胞培养的多糖/Matrigel复合凝胶膜及其制备方法，以该方法制得的复合凝胶膜含有具有生物相容性的多糖以及Matrigel，可模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，能够促进多种细胞的增殖。
本发明通过下述技术方案加以实现：
本发明的一种用于细胞培养的多糖/Matrigel复合凝胶膜，其特征在于以多糖和Matrigel为原料，采用钙离子作为交联剂，通过留延法（也称“流延法”）制备。
在本发明中，优选的，所述的多糖为海藻酸盐、果胶、透明质酸、硫酸软骨素中一种或多种多糖的组合。
在本发明中，优选的，所述的多糖/Matrigel复合凝胶膜是通过以下方法制备得到：
(1)称取一定量多糖，将其溶于去离子水中，制备成质量百分比浓度为0.1%-3%多糖溶液，搅拌直至全部溶解，备用；
(2)配制0.1M的氯化钙溶液，过滤灭菌，备用；
(3)取一定体积的Matrigel溶液（自制或购自BD公司，货号：354234），在其中加入一定量的去离子水形成蛋白浓度为9-15mg/ml的Matrigel溶液，整个操作过程需在冰上操作；
(4)在超净工作台中量取步骤(1)制备的溶液5ml，在其中加入步骤(3)制备的Matrigel溶液0.1-8ml，加入0.5-5ml步骤(2)配制的氯化钙溶液，混合搅拌，然后将其倒入细胞培养器皿或细胞培养板中，以上过程需在冰上操作，然后将其置于37℃培养箱中孵育2-5min，形成用于细胞培养的复合凝胶膜。
9mg/ml的蛋白浓度（胶浓度）是Matrigel在特定温度下（22-35℃）自己形成凝胶的最低浓度，本发明中形成凝胶通过两种方式：
（1）依靠多糖与交联剂（氯化钙）发生化学反应而形成，在复合膜中matrigel含量比较低时，主要通过与多糖交联形成凝胶，Matrigel可与多糖形成半互穿网络结构而形成复合凝胶；
（2）当Matrigel浓度达到9mg/ml或以上时则与多糖共同形成双网络凝胶。
进一步的，本发明还提出了一种制备所述的用于细胞培养的多糖/Matrigel复合凝胶膜的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)称取一定量多糖，将其溶于去离子水中，制备成质量百分比浓度为0.1%-3%多糖溶液，搅拌直至全部溶解，备用；
(2)配制0.1M的氯化钙溶液，过滤灭菌，备用；
(3)取一定体积的Matrigel溶液（自制或购自BD公司，货号：354234），在其中加入一定量的去离子水形成蛋白浓度为9-15mg/ml的Matrigel溶液，整个操作过程需在冰上操作；
(4)在超净工作台中量取步骤(1)制备的溶液5ml，在其中加入步骤(3)制备的Matrigel溶液0.1-8ml，加入0.5-5ml步骤(2)配制的氯化钙溶液，混合搅拌，然后将其倒入细胞培养器皿或细胞培养板中，以上过程需在冰上操作，然后将其置于37℃培养箱中孵育2-5min，形成用于细胞培养的复合凝胶膜。
在本发明中，优选的，所述的多糖为海藻酸盐、果胶、透明质酸、硫酸软骨素中一种或多种多糖的组合。
该方法过程简单且通过该方法制备的复合凝胶膜，能够促进多种细胞的增殖，同时该复合凝胶膜具有良好的力学性能，可适合细胞的长期培养，并且可以根据细胞类型选择不同的Matrigel含量来调控基底膜的组成，选择不同交联剂的用量来调节基底刚度以调控细胞的粘附和分化行为。
因此，更进一步的，本发明提出了所述的用于细胞培养的多糖/Matrigel复合凝胶膜在培养细胞中应用。
附图说明
图1为心脏干细胞在海藻酸钠/Matrigel复合凝胶膜表面培养3天时的图；
图2为心脏干细胞在透明质酸/Matrigel复合凝胶膜表面培养3天时的图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1海藻酸钠/Matrigel复合凝胶膜的制备
（1）称取0.1g海藻酸钠于9.9ml去离子水中，制备成质量百分浓度为1%海藻酸钠溶液，搅拌直至全部溶解，以备后用；
（2）配制0.1M的氯化钙溶液，过滤灭菌备用；
（3）取一定体积的自制Matrigel溶液（按照实施例5的方法制备得到），在其中加入一定量的去离子水形成蛋白浓度为9mg/ml的Matrigel溶液，整个操作过程需在冰上操作；
（4）在超净工作台中量取步骤(1)制备的溶液5ml，在其中加入步骤(3)制备的Matrigel溶液4ml，加入1ml步骤(2)配制的氯化钙溶液，混合搅拌，然后将其倒入细胞培养器皿或细胞培养板中，以上过程需在冰上操作，然后将其置于37℃培养箱中孵育2-5min，便可形成用于细胞培养的复合凝胶膜。
实施例2透明质酸/Matrigel复合凝胶膜的制备
（1）称取0.3g透明质酸于9.7ml去离子水中，制备成质量百分浓度为3%透明质酸溶液，搅拌直至全部溶解，以备后用；
（2）配制0.1M的氯化钙溶液，过滤灭菌备用；
（3）取一定体积的Matrigel溶液（购自BD公司，货号：354234），在其中加入一定量的去离子水形成蛋白浓度为15mg/ml的Matrigel溶液，整个操作过程需在冰上操作；
（4）在超净工作台中量取步骤(1)制备的溶液5ml，在其中加入步骤(3)制备的Matrigel溶液4ml，加入0.5ml步骤(2)配制的氯化钙溶液，混合搅拌，然后将其倒入细胞培养器皿或细胞培养板中，以上过程需在冰上操作，然后将其置于37℃培养箱中孵育2-5min，便可形成用于细胞培养的复合凝胶膜。
实施例3硫酸软骨素/Matrigel复合凝胶膜的制备
（1）称取0.2g硫酸软骨素于9.8ml去离子水中，制备成质量百分浓度为2%硫酸软骨素溶液，搅拌直至全部溶解，以备后用；
（2）配制0.1M的氯化钙溶液，过滤灭菌备用；
（3）取一定体积的自制Matrigel溶液（按照实施例5的方法制备得到），在其中加入一定量的去离子水形成蛋白浓度为9mg/ml的Matrigel溶液，整个操作过程需在冰上操作；
（4）在超净工作台中量取步骤(1)制备的溶液5ml，在其中加入步骤(3)制备的Matrigel溶液2ml，加入2ml步骤(2)配制的氯化钙溶液，混合搅拌，然后将其倒入细胞培养器皿或细胞培养板中，以上过程需在冰上操作，然后将其置于37℃培养箱中孵育2-5min，便可形成用于细胞培养的复合凝胶膜。
实施例4果胶/Matrigel复合凝胶膜的制备
（1）称取0.2g果胶于9.8ml去离子水中，制备成质量百分浓度为2%果胶溶液，搅拌直至全部溶解，以备后用；
（2）配制0.1M的氯化钙溶液，过滤灭菌备用；
（3）取一定体积的自制Matrigel溶液（按照实施例5的方法制备得到），在其中加入一定量的去离子水形成蛋白浓度为9mg/ml的Matrigel溶液，整个操作过程需在冰上操作；
（4）在超净工作台中量取步骤(1)制备的果胶溶液5ml，在其中加入步骤(3)制备的Matrigel溶液2ml，加入2ml步骤(2)配制的氯化钙溶液，混合搅拌，然后将其倒入细胞培养器皿或细胞培养板中，以上过程需在冰上操作，然后将其置于37℃培养箱中孵育2-5min，便可形成用于细胞培养的复合凝胶膜。
实施例5Matrigel的制备
一、以一管EHS细胞样品为例（1.5ml）
1、材料准备：雌性C57BL/6小鼠，PBS，1ml（16G针头）
2、步骤：
1）冰上或4℃冰箱融化（选择4℃冰箱，温度可控）
2）麻醉小鼠：（通风橱内进行）将浸有饱和***的纸巾至于大烧杯底部，放入小鼠。不要把***直接洒到小鼠上。
3）每只小鼠注射0.5ml EHS细胞于于右后只外侧面。将针头远端***主肌肉块，肉瘤应被注射进后肢肌肉内。
4）标记笼子，做好记录，清理实验用具及实验室。
5）3-4周后进行EHS传代。
二、EHS肉瘤传代与收集保存
（一）材料准备：
1.解剖用具-小剪刀，镊子（提前高压灭菌）
2.6ml/20-30ml注射器：16G针头
3.50ml离心管，烧杯，冰桶多个，干冰
4.PBS，70%乙醇，***，4℃离心机，灭菌好的小烧杯
5.吸水纸，所料袋-保存肉瘤及处理小鼠用
（二）肉瘤传代的准备
注意事项
1.准备好大量的冰和预冷的PBS，操作时样品尽可能处于冰上
2.EHS肿瘤的传代的过程中一定要注意细菌感染
1）肿瘤区域内出现水状、发黄的区域和浓汁后丢弃
2）抗生素的运用
3）各个肿瘤在传代过程中分开操作
步骤：
1.干冰处死小鼠：小烧杯中加干冰，放入大烧杯：向干冰加几毫升水，将小鼠放入大烧杯中。
2.1L大烧杯中准备好70%乙醇，上盖保鲜膜，处死后的小鼠浸入其中，进行消毒可以防止把小鼠毛带到后面的实验中。
3.小心沿肉瘤周围剪破皮肤，掀开皮肤暴露肉瘤。
4.小剪刀和镊子小心将肉瘤取下，放入50ml离心管中，每只小鼠肉瘤单独存放，离心管上编号。
5各管中加入20-25ml预冷的PBS，震荡。
6将步骤5得到的混合物倒入20-30ml注射器中，随后分散肉瘤细胞
1）将混和物贴离心管内壁推压回50ml离心管中
2）将混合物再倒入注射器，并装上16G针头。
3）推压混合物回50ml离心管。
必要的话可重新操作一次
7加入PBS至总量为40ml，充分震荡分散组织。
8将离心管放入离心机，打开离心机，当转速上到1000rpm时立即断开
9倒掉上清，加入40ml PBS，充分震摇。
10重复步骤8
11每10ml混合物加入约1ml青链霉素并混合。注射前始终保持样品在冰上。可以加入5%DMSO冻存。
（三）收集肉瘤
注意事项
1.不要让肿瘤生长的太大，否则易发生坏死，组织坏死后Matrigel产量下降。
2.含有大量的血和黄色浓汁的肿瘤不能用。
3.一般情况下，大于4克的肿瘤容易坏死
步骤：
1.干冰处死小鼠-小烧杯中加干冰，放入大烧杯；向干冰加几毫升水，将小鼠放入大烧杯中
2.小鼠死亡后，将它们浸泡于70%乙醇内。
3.剪开皮肤，暴露肉瘤。
4.将肉瘤收于大烧杯中去除被摸，烧杯至于冰上。
5.所有肉瘤都被收集后，将之混合，立即制作Matrigel
制作M:100g肉瘤量
（一）材料准备：
1.50ml离心管，透析用的大烧杯：搅拌子：透析袋（预处理），大量的冰
2.溶液：3.4M NaCl溶液；2M urea缓冲液；Tris-saline；氯仿；1%高糖溶液
3.止血钳和剪刀提前高压灭菌
4.保存Matrigel的无菌容器
（二）注意事项
1.所有试剂、用品和仪器需要4℃预冷。整个制备过程中，组织至于冰上，低温处理。
2.Matrigel制备过程中应尽可能的快速，否则其活性降低，整个分离和透析要在4天内完成。
3.一旦分离出Matrigel，4℃保存，因为其一旦凝固，将不在液化
4.Matrigel的最终蛋白浓度不低于9mg/ml（9-15mg/ml）
5.Matrigel浓度过低时，可以运用硫酸铵沉淀的方法进行浓缩，然后透析。
（三）步骤：
1.（洗涤）肉瘤中加入3.4M NaCl溶液200ml，匀浆直至分散。
匀浆时间不能太长，以免温度过高使蛋白降解。
2.7000rpm4℃离心15min，弃粉红色上清。
3.重复步骤1、2两次。
4.肉瘤中加入2M urea缓冲液100ml混匀
5.4℃搅合过夜。
6.14000rpm4℃离心20min，保留上清于冰上。
7.加2M urea缓冲液50ml于肉瘤残余物中并混匀。
8.14000rpm4℃离心20min,保留上清于冰上。
9.混合步骤6和步骤8得到的上清，运用2L Tris透析，1L加5ml氯仿，消毒
10.透析4小时以上，在末端旋转袋子
11.单独加Tris不加氯仿处理2小时以上
12.重复步骤11
13.最后一次透析取消盐介质，换为：1%（w/w）高糖溶液
14.在超净台中，止血钳固定透析袋，用70%乙醇冲洗后，用剪刀将袋子剪开，将提取物转移到无菌容器中，必须是整块的，操作在冰上进行。
15.立即分装、冷却，-20℃保存一年
胶凝化作用：将提取物倾倒在所需容器中，复温30-120min铺薄层即可。
应用实施例1
将心脏干细胞以1×104个/cm2密度分别种植在实施例1制备得到的海藻酸钠/Matrigel复合膜表面与实施例2制备得到的透明质酸/Matrigel复合膜表面培养3天，隔天换液。当细胞铺满整个凝胶膜时，将其置于4℃，15min，加入少量胰酶，离心收集细胞。
同时，按照以上相同的方法将心脏干细胞以1×104个/cm2密度种植在普通细胞生长板上作为对照组。显微镜下观察细胞生长情况，图1为在实施例1制备得到的海藻酸钠/Matrigel复合膜表面上生长3天时的心脏干细胞图；图2为在实施例2制备得到的透明质酸/Matrigel复合膜表面上生长3天时的心脏干细胞图。从显微镜观察结果可以看出在本发明的多糖/复合膜上表面生长3天时的心脏干细胞表现出良好的生长状态，并具有心脏干细胞的特定功能，而且随着Matrigel含量的增加，心脏干细胞的粘附能力越好。在普通细胞培养板上生长的心脏干细胞则出现球形且生长较缓慢。
Claims (5)
1.一种用于细胞培养的多糖/Matrigel复合凝胶膜，其特征在于以多糖和Matrigel为原料，采用钙离子作为交联剂，通过留延法制备得到：
(1)称取一定量多糖，将其溶于去离子水中，制备成质量百分比浓度为0.1％-3％多糖溶液，搅拌直至全部溶解，备用；
(2)配制0.1M的氯化钙溶液，过滤灭菌，备用；
(3)取一定体积的Matrigel溶液，在其中加入一定量的去离子水形成蛋白浓度为9-15mg/mL的Matrigel溶液，整个操作过程需在冰上操作；
(4)在超净工作台中量取步骤(1)制备的溶液5mL，在其中加入步骤(3)制备的Matrigel溶液0.1-8mL，加入0.5-5mL步骤(2)配制的氯化钙溶液，混合搅拌，然后将其倒入细胞培养器皿或细胞培养板中，以上过程需在冰上操作，然后将其置于37℃培养箱中孵育2-5min，形成用于细胞培养的复合凝胶膜。
2.如权利要求1所述的复合凝胶膜，其特征在于所述的多糖为海藻酸盐、果胶、透明质酸、硫酸软骨素中一种或多种多糖的组合。
3.制备权利要求1或2所述的多糖/Matrigel复合凝胶膜的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)称取一定量多糖，将其溶于去离子水中，制备成质量百分比浓度为0.1％-3％多糖溶液，搅拌直至全部溶解，备用；
(2)配制0.1M的氯化钙溶液，过滤灭菌，备用；
(3)取一定体积的Matrigel溶液，在其中加入一定量的去离子水形成蛋白浓度为9-15mg/mL的Matrigel溶液，整个操作过程需在冰上操作；
(4)在超净工作台中量取步骤(1)制备的溶液5mL，在其中加入步骤(3)制备的Matrigel溶液0.1-8mL，加入0.5-5mL步骤(2)配制的氯化钙溶液，混合搅拌，然后将其倒入细胞培养器皿或细胞培养板中，以上过程需在冰上操作，然后将其置于37℃培养箱中孵育2-5min，形成用于细胞培养的复合凝胶膜。
4.如权利要求3所述的制备复合凝胶膜的方法，其特征在于步骤(1)所述的多糖为海藻酸盐、果胶、透明质酸、硫酸软骨素中一种或多种多糖的组合。
5.权利要求1或2所述的多糖/Matrigel复合凝胶膜在培养细胞中应用。
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| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150325 Termination date: 20190117 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |