CN103097370A - 用于治疗丙型肝炎的苯并呋喃衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供式I化合物，包括它们的盐以及组合物和使用所述化合物的方法。所述化合物具有抗丙型肝炎病毒(HCV)的活性，并可用于治疗被HCV感染的那些患者。

Description

用于治疗丙型肝炎的苯并呋喃衍生物
相关申请的交叉参考
本专利申请要求2010年6月30日提交的美国临时专利申请61/359,881的权益。
技术领域
本发明大体上涉及新的式I化合物(包括它们的盐)，它们具有抗丙型肝炎病毒(HCV)的活性并用于治疗感染有HCV的那些患者。本发明还涉及使用这些化合物的组合物和方法。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)是主要的人类病原体，其在世界范围内感染估计一亿七千万人--大致是1型人类免疫缺陷病毒感染数量的5倍。这些HCV感染个体中相当大的部分发展成严重的进行性肝脏疾病，包括肝硬化和肝细胞癌(Lauer，G.M.；Walker，B.D.N.Engl.J.Med.2001，345，41-52)。
HCV是正链RNA病毒。基于对所推断氨基酸序列进行的比较和5’-非翻译区的广泛相似性，已经把HCV归类为黄病毒科中独立的属。黄病毒科的所有成员都具有包封的病毒体，其含有的正链RNA基因组通过翻译单一的连续的可读框而编码所有已知的病毒专属性蛋白质。
在整个HCV基因组的核苷酸和所编码的氨基酸序列中发现了相当程度的异质性。已经表征了至少6种主要的基因型，且已经描述了多于50种的亚型。HCV的主要基因型在世界范围内的分布是不同的，且HCV遗传异质性的临床重要性仍然是难以确定的，尽管对基因型对发病和治疗的可能影响进行了大量的研究。
单链HCV RNA基因组的长度约是9500个核苷酸，且具有单一的可读框(ORF)，其编码由约3000个氨基酸组成的单一的大的多蛋白。在被感染的细胞中，这种多蛋白在多个位点被细胞蛋白酶和病毒蛋白酶裂解，从而产生结构蛋白和非结构(NS)蛋白。就HCV来说，成熟的非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的产生受到两种病毒蛋白酶的影响。认为第一种病毒蛋白酶是金属蛋白酶，且在NS2-NS3接合处进行裂解；第二种病毒蛋白酶是包含在NS3的N-末端区域内的丝氨酸蛋白酶(也称为NS3蛋白酶)，且介导NS3下游的所有随后裂解，既在NS3-NS4A裂解位点以顺式进行裂解，又在其余的NS4A-NS4B、NS4B-NS5A、NS5A-NS5B位点以反式进行裂解。NS4A蛋白似乎具有多种功能，其充当NS3蛋白酶的辅因子，且可能有助于NS3及其它病毒复制酶组分的膜定位。NS3蛋白与NS4A形成复合物，这似乎是在所有位点进行加工活动由此提高蛋白质水解效率所必需的。NS3蛋白还显示出三磷酸核苷酶和RNA解旋酶活性。NS5B(也称为HCV聚合酶)是依赖于RNA的RNA聚合酶，在HCV的复制中涉及所述酶。在“StructuralAnalysis of the Hepatitis C Virus RNA Polymerase in Complex withRibonucleotides”(Bressanelli；S.et a1.，Joumal of Virology2002，3482-3492)和Defrancesco and Rice，Clinics in Liver Disease2003，7，211-242中描述了HCVNS5B蛋白。
目前，最有效的HCV疗法使用α-干扰素和利巴韦林的组合，其在40％的患者中产生持续的效果(Poynard，T.et a1.Lancet1998，352，1426-1432)。最新的临床结果证明，作为单一疗法，PEG化的α-干扰素优于未修饰的α-干扰素(Zeuzem，S.et a1.N.Engl.J.Med.2000，343，1666-1672)。然而，即使就涉及PEG化α-干扰素和利巴韦林组合的实验性治疗方案而言，相当多的患者也没有出现病毒载量的持续减少。因此，就开发用于治疗HCV感染的有效疗法而言，存在明显和迫切的需要。
HCV-796为HCV NS5B抑制剂，其显示出降低患者HCV RNA水平的能力。在用所述化合物作为单一药物进行治疗的给药过程中，病毒RNA水平暂时性减小，随后反弹，但当与干扰素和利巴韦林形式的标准护理品组合时，所述水平猛烈降低。由于在联合方案的延长给药过程中观察到了肝毒性，因此对该药物的开发暂停。美国专利7,265,152和相应的PCT专利申请WO2004/041201A2描述了HCV-796类化合物。
本发明提供技术优点，例如本发明化合物为新的且有效抗丙型肝炎。此外，本发明化合物提供药物使用方面的优点，例如就它们作用机理、结合、抑制效力、靶标选择性、溶解性、安全性分布或生物利用度中的一项或多项而言。
发明内容
本发明一个方面为式I化合物或其药用盐，
Figure BDA00002870534600031
其中：
R1为苯基或吡啶基并且取代有0-3个取代基，所述取代基选自卤素、烷基、卤代烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、烷氧基、羟基烷基氧基和烷氧基烷基氧基，并且R1还取代有1个CON(R9)(R10)取代基；
R2为氢、卤素或烷基；
R3为CONHCH3；
R4为苯基，其对位取代有X-Ar1；
R5和R6独立地为氢、烷基、卤素、N(R7)(R8)或烷基磺酰基；
R7和R8独立地为氢、烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、烷基磺酰基或烷基磺酰基烷基；
或者N(R7)(R8)一起为氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基或哌嗪基，并且取代有0-2个选自烷基、羟基烷基或羟基的取代基；
R9为氢；
R10为
Figure BDA00002870534600032
R11和R12独立地为氢、烷基、羟基烷基或烷氧基烷基；
或者R11和R12一起为亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基或亚己基；
X为-O-或-NH-；
Ar1为苯基或对-卤代苯基；和
Ar2为苯基、吡啶基、吡唑基、异噁唑基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁二噻唑基(oxadiathiazolyl)、***基、四唑基、吡嗪基或嘧啶基，并且取代有0-3个选自卤素、烷基或二烷基氨基的取代基。
本发明另一个方面为式I化合物或其药用盐，其中
R1为取代有0-3个取代基的苯基，所述取代基选自卤素、烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、烷氧基或羟基烷基氧基，并且还取代有1个CON(R9)(R10)取代基；
R2为氢或F；
R3为CONHCH3
R4为苯基，其对位取代有X-Ar1；
R5和R6为氢；
R11和R12独立地为甲基，或者R11和R12一起为亚乙基或亚丙基；
X为-O-；
Ar1为对氟苯基；和
Ar2为苯基、吡啶基、吡唑基、异噁唑基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁二噻唑基、***基、四唑基、吡嗪基或嘧啶基，并且取代有0-3个选自卤素或烷基的取代基。
本发明另一个方面为式I化合物或其药用盐，其中R1为取代有1个CON(R9)(R10)、1个甲基取代基和1个甲氧基取代基的苯基；R2为氟；R4为对位取代有X-Ar2的苯基；R5和R6为氢；R10为
Figure BDA00002870534600041
R12和R13一起为亚乙基；和Ar2为嘧啶基。
另一个方面为式I化合物，其中R1为取代有1个CON(R9)(R10)取代基且还取代有0-2个卤素、烷基或烷氧基取代基的苯基。
本发明另一个方面为式I化合物，其中R10为
Figure BDA00002870534600042
以及R12和R13为亚乙基或亚丙基。
本发明另一个方面为式I化合物，其中R10为
Figure BDA00002870534600043
以及R12和R13为亚乙基。
本发明另一个方面为式I化合物，其中R10为
Figure BDA00002870534600044
以及R12和R13中的至少一个不是氢。
本发明另一个方面为式I化合物，其中R4为苯基或单氟苯基。
本发明另一个方面为式I化合物，其中Ar1为苯基。
任何变量(包括R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、X、AR1或AR2)的任何范围可独立与任何其它变量的范围一起使用。
除非另有说明，这些术语具有下述意义。“烷基”是指由1至6个碳所组成的直链或支链烷基。“烯基”是指由2至6个碳所组成且具有至少一个双键的直链或支链烃基。“环烷基”是指由3至7个碳所组成的单环环系。“羟基烷基”、“烷氧基”及具有经取代烷基部分的其它术语包括对所述烷基部分而言由1至6个碳原子所组成的直链与支链异构体。“卤代或卤素”包括用卤代定义的取代基(例如“卤代烷基”和“卤代烷氧基”、“卤代苯基”、“卤代苯氧基”)中的所有卤化异构体，从单卤素取代至全卤素取代。“芳基”包括碳环芳族取代基与杂环芳族取代基。括号与多重括号术语意在向本领域技术人员阐明键合关系。例如，如((R)烷基)那样的术语是指进一步被取代基R取代的烷基。由化学结构所示出的在多环系(例如二环环系)上的可变位置键合的取代基意在键合至被描绘所依附的环。例如，式IV上的取代基R1和R2意在键合至式IV的苯环，而不是键合至噻吩环。
亚乙基是指乙二基或-CH2CH2-；亚丙基是指丙二基或-CH2CH2CH2-；亚丁基是指丁二基或-CH2CH2CH2CH2-；亚戊基是指戊二基或-CH2CH2CH2CH2CH2-。
本发明包括所述化合物的所有药用盐形式。药用盐为其中抗衡离子不会显著地助长化合物的生理活性或毒性且其本身作为药理等价物的那些药用盐。这些盐可根据一般有机技术使用商购试剂来制备。一些阴离子盐形式包括醋酸盐、醋硬脂酸盐、苯磺酸盐、溴化物、樟脑磺酸盐、氯化物、枸橼酸盐、富马酸盐、葡萄糖醛酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、碘化物、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐及昔萘酸盐。一些阳离子盐形式包括铵盐、铝盐、苄星盐、铋盐、钙盐、胆碱盐、二乙胺盐、二乙醇胺盐、锂盐、镁盐、葡甲胺盐、4-苯基环己胺盐、哌嗪盐、钾盐、钠盐、丁三醇胺盐及锌盐。
本发明一些化合物具有不对称碳原子。本发明包括所有立体异构形式，包括对映异构体与非对映异构体及立体异构体的混合物如外消旋体。一些立体异构体可使用本领域已知的方法来制备。所述化合物的立体异构混合物与相关中间体的立体异构混合物可根据本领域已知的方法来分离成单独的异构体。当在以下方案和表格中描绘分子结构时使用的楔形线(wedge)和虚线(hash)仅意在表示相对立体化学，而不应该被解释为暗示绝对立体化学指定。
本发明意欲包括在本发明化合物中出现的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子数而不同质子数的那些原子。一般举例但非限定，氢的同位素包括氘和氚。碳的同位素包括13C和14C。本发明同位素标记的化合物可大体通过本领域技术人员已知的常规技术制备或通过与本申请描述的那些方法类似的方法制备，使用适当的同位素标记的试剂代替否则会使用的非标记的试剂。这样的化合物可具有多种潜在用途，例如在确定生物活性时作为标准品和试剂。在稳定同位素的情况下，这样的化合物可具有有利改变生物学性质、药理学性质或药代动力学性质的潜能。
生物学方法
如在以下HCV RdRp测定中所确定那样，实施例化合物展现了对抗HCVNS5B的活性。
对HCV NS5B RdRp进行克隆、表达及纯化
将对HCV基因型1b的NS5B蛋白进行编码的cDNA克隆至pET21a表达载体中。将所述蛋白质表达成截掉C末端的18个氨基酸以提高溶解度。大肠杆菌感受态细胞系BL21(DE3)用于所述蛋白质的表达。使培养物在37℃生长约4小时，直到培养物达到600纳米处的光密度为2.0。使培养物冷却至20℃，并用1mM IPTG进行诱导。加入新鲜的氨苄青霉素至最终浓度为50微克/毫升，并使细胞在20℃生长过夜。
使细胞沉淀(3升)溶解以供纯化，得到15-24毫克经纯化的NS5B。溶胞缓冲液由20mM Tris-HCl(pH7.4)、500mM NaCl、0.5％Triton X-100、1mMDTT、1mM EDTA、20％甘油、0.5毫克/毫升溶菌酶、10mM MgCl2、15微克/毫升脱氧核糖核酸酶I及完全TM蛋白酶抑制剂药片(Roche)所组成。加入溶胞缓冲液后，使用组织匀浆器来使经冷冻的细胞沉淀重新悬浮。为了降低样品的粘度，使用与Branson超声波处理器相连的微尖头来使溶胞产物的等分液在冰上接受超声波处理。经超声波处理的溶胞产物在4℃以100,000×g离心30分钟，并过滤经过0.2微米滤器单元(Corning)。
使用两个连续的色谱步骤来纯化蛋白质：肝素琼脂糖CL-6B和PolyU琼脂糖4B。色谱缓冲液与溶胞缓冲液相同，但不含有溶菌酶、脱氧核糖核酸酶I、MgCl2或蛋白酶抑制剂，且缓冲液的NaCl浓度根据将蛋白质加载至色谱柱上的需要而调整。各色谱柱以NaCl梯度液洗脱，所述梯度液的长度在5-50个柱体积之间变化，这取决于色谱柱的类型。在最终色谱步骤后，所得到的酶纯度＞90％(基于SDS-PAGE分析)。将酶分成等分液，并贮存在-80℃。
标准HCVNS5B RdRp酶测定
在96孔板(Costar3912)中在最终体积为60微升的情况下进行HCV RdRp基因型1b测定。测定缓冲液由20mM Hepes(pH7.5)、2.5mM KCl、2.5mMMgCl2、1mM DTT、1.6单位RNAse抑制剂(Promega N2515)、0.01毫克/毫升BSA(Promega3961)及2％甘油所组成。所有化合物在DMSO中连续稀释(3倍)并在水中进一步稀释以使DMSO在测定中的最终浓度为2％。HCV RdRp基因型1b酶以28nM的最终浓度使用。聚A(polyA)模板在6nM时使用，且生物素化的寡-dT12引物以180nM的最终浓度使用。模板是商购得到的(Amersham27-4110)。生物素化的引物由Sigma Genosys制备。3H-UTP在0.6μCi(0.29μM总UTP)时使用。通过加入酶来引发反应，在30℃孵育60分钟，并通过加入25微升含有SPA珠粒(4微克/微升，Amersham RPNQ0007)的50mM EDTA来停止。在室温孵育＞1小时后，将板在Packard Top CountNXT上读取。
经改进的HCV NS5B RdRp酶测定
还用珠子上固相均质测定(on-bead solid phase homogeneous assay)来评价NS5B抑制剂(WangY-K，Rigat K，Roberts S，and Gao M(2006)Anal Biochem，359：106-111)。所述测定是对上述标准测定的改进并且在96-孔或384-孔板式中使用。通过以下方式将生物素化的寡DT12引物捕获在链霉抗生物-偶联的珠子(SPA珠子(GE，RPNQ0007))或成像珠子(GE，RPNQ0261)上，所述方式为：将引物和珠子在缓冲液中混合，在室温孵育3小时。离心除去未结合的引物。使与引物结合的珠粒重新悬浮在3x反应缓冲液(40mM Hepes缓冲液(pH7.5)，7.5mM MgCl2，7.5mM KCl，dT引物偶联的珠子，多聚腺苷酸模板(polyA template)，3H-UTP和RNAse抑制剂(Promega N2515))中。将化合物在DMSO中以1∶3连续稀释并等分装在测定板中。在测定板上，将等体积(对于96-孔测定为20μL，和对于384-孔测定为10μL)水、3X反应混合物和酶/20mMHepes缓冲液(pH7.5)、0.1mg/ml BSA加至所述稀释混合物中。96-孔测定中组分的最终浓度为：0.36nM模板、15nM引物、0.43μM(1μCi)3H-UTP、0.08U/μLRNAse抑制剂、7nM NS5B酶、0.033mg mL BSA和2μg/μL珠子、20mMHepes缓冲液(pH7.5)、2.5mM MgCl2、2.5mM KCl、2％DMSO。在384-孔测定中组分的最终浓度为：0.2nM模板、15nM引物、0.29μM3H-UTP(0.3μCi)、0.08U/μLRNAse抑制剂、7nM NS5B酶、0.033mg/mL BSA和0.33μg/μL珠子、20mM Hepes缓冲液(pH7.5)、2.5mM MgCl2、2.5mM KCl、2％DMSO。
使反应在30℃进行4小时并通过加入50mM EDTA(10μL)来终止。孵育至少15分钟后，在Packard NXT Topcount或Amersham LEADseeker多模态成像***上读板。
化合物的IC50值使用七种不同的[I]来确定。使用方程式
y＝A+((B-A)/(1+((C/x)∧D)))通过抑制作用来计算IC50值。
细胞系
用于评价化合物的细胞系由人肝细胞衍生的细胞系(Huh-7)构成，所述细胞系组成性表达含有Renilla荧光素酶受体基因的基因型1a或1b HCV复制子。将这些细胞维持在Dulbecco’s改进的Eagle培养基(DMEM)中，所述Dulbecco’s改进的Eagle培养基含有10％FBS、100U/mL青霉素/链霉素和1.0mg/mL G418。
HCV复制子荧光素酶测定
为了评价化合物效力，将HCV复制子细胞接种在于DMEM(含有10％FBS)中的96-孔板中，细胞密度为104/孔。在37℃孵育过夜后，将在DMSO中连续稀释的化合物加至细胞板中。可选择地，将滴定的化合物转移至无菌384-孔组织-培养液处理的板中并在DMEM(含有4％FCS(DMSO的最终浓度为0.5％))中向板接种50μL细胞，密度为2.4x103个细胞/孔。在37℃孵育3天后，根据制造商的指示用EnduRen底物(Promega目录号#E6485)分析Renilla荧光素酶活性。简言之，将EnduRen底物在DMEM中稀释，然后加至板中至最终浓度为7.5μM。将所述板在37℃孵育至少1小时然后在使用发光程序的TopCount NXT微孔板闪烁和发光计数仪(Packard)或Viewlux成像仪(PerkinElmer)上读板。用中效方程(median effect equation)的指数形式计算50％有效浓度(EC50)，其中EC50＝100-[(δFinh/δFcon)x100]。
为了评价化合物的细胞毒性，将Cell Titer-Blue(Promega)加至含EnduRen的板中并在37℃孵育至少4小时。用Cytoflour400(PE Biosystems)或Viewlux成像仪读取来自每个孔的荧光信号。所有CC50值用中效方程计算。
化合物的代表性数据记录在表1中。
表1.
药物组合物和治疗方法
所述化合物展现出对抗HCV NS5B的活性，且可用于治疗HCV与HCV感染。因此，本发明另一个方面为一种组合物，其包含所述化合物或其药用盐及药用载体。
本发明另一个方面为一种组合物，其还包含具有抗HCV活性的化合物。
本发明另一个方面为一种组合物，其中具有抗HCV活性的化合物为干扰素。在本发明另一个方面，所述干扰素选自干扰素α2B、PEG化的(pegylated)干扰素α、同感干扰素(consensus interferon)、干扰素α2A及淋巴细胞样干扰素τ。
本发明另一个方面为一种组合物，其中具有抗HCV活性的化合物为环孢菌素。在本发明另一个方面，所述环孢菌素为环孢菌素A。
本发明另一个方面为一种组合物，其中具有抗HCV活性的化合物选自白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素12、可提高1型辅助T细胞应答发展的化合物、干扰RNA、反义RNA、Imiqimod、利巴韦林、5’-单磷酸肌苷脱氢酶抑制剂、金刚烷胺及金刚乙胺。
本发明另一个方面为一种组合物，其中具有抗HCV活性的化合物可有效抑制靶标的功能以治疗HCV感染，所述靶标选自HCV金属蛋白酶(HCVmetalloprotease)、HCV丝氨酸蛋白酶(HCV serine protease)、HCV聚合酶(HCVpolymerase)、HCV解螺旋酶(HCV helicase)、HCV NS4B蛋白(HCV NS4Bprotein)、HCV进入(HCV entry)、HCV组装(HCV assembly)、HCV释出(HCVegress)、HCV NS5A蛋白(HCV NS5Aprotein)、IMPDH及核苷类似物(nucleosideanalog)。
本发明另一个方面为一种组合物，其包含化合物或其药用盐、药用载体、干扰素及利巴韦林。
本发明另一个方面为一种抑制HCV复制子功能的方法，其包括使HCV复制子与化合物或其药用盐接触。
本发明另一个方面为一种抑制HCV NS5B蛋白功能的方法，其包括使HCV NS5B蛋白与化合物或其药用盐接触。
本发明另一个方面为治疗患者中HCV感染的方法，其包括向所述患者给予治疗有效量的化合物或其可药用盐。在另一个实施方案中，所述化合物可有效抑制HCV复制子的功能。在另一个实施方案中，所述化合物可有效抑制HCV NS5B蛋白的功能。
本发明另一个方面为治疗患者中HCV感染的方法，其包括向所述患者给予治疗有效量的所述化合物或其药用盐，且给予(之前、之后或同时)另一种具有抗HCV活性的化合物。
本发明另一个方面为其中其它具有抗HCV活性的化合物为干扰素的方法。
本发明另一个方面为其中所述干扰素选自干扰素α2B、PEG化的干扰素α、同感干扰素、干扰素α2A及淋巴细胞样干扰素τ的方法。
本发明另一个方面为其中其它具有抗HCV活性的化合物为环孢菌素的方法。
本发明另一个方面为其中所述环孢菌素为环孢菌素A的方法。
本发明另一个方面为其中其它具有抗HCV活性的化合物选自白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素12、可提高1型辅助T细胞应答发展的化合物、干扰RNA、反义RNA、Imiqimod、利巴韦林、5’-单磷酸肌苷脱氢酶抑制剂、金刚烷胺及金刚乙胺的方法。
本发明另一个方面为其中其它具有抗HCV活性的化合物可有效抑制靶标功能以治疗HCV感染的方法，所述靶标选自HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解螺旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV进入、HCV组装、HCV释出、HCV NS5A蛋白、IMPDH及核苷类似物。
本发明另一个方面为其中其它具有抗HCV活性的化合物可有效抑制HCV生命循环中靶标的功能而非抑制HCV NS5B蛋白的功能的方法。
“治疗有效”是指提供有意义的患者益处所需要的药物量，如肝炎与HCV感染领域中的执业医师所理解的那样。
“患者”是指被HCV病毒感染且适于治疗的人们，如肝炎与HCV感染领域中的执业医师所理解的那样。
“治疗”、“疗法”、“给药方案”、“HCV感染”及相关术语如肝炎与HCV感染领域中的执业医师所理解的那样来使用。
本发明化合物一般以药物组合物的形式来给予，所述组合物包含治疗有效量的所述化合物或其药用盐及药用载体，且可含有常规赋形剂。药用载体为那些具有可接受安全性的常规已知载体。组合物涵盖所有常见的固体形式与液体形式，包括例如胶囊剂、片剂、锭剂与粉末剂及液体混悬剂、糖浆剂、酏剂及溶液剂。组合物使用一般制剂技术来制备，且常规赋形剂(诸如粘合剂与润湿剂)与媒介物(诸如水与醇)通常用于组合物。参见例如Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA，17th edition，1985。
固体组合物通常被配制成剂量单位，且每份剂量提供约1至1000毫克活性成份的组合物是优选的。剂量的一些实例为1毫克、10毫克、100毫克、250毫克、500毫克及1000毫克。通常，其它药物可按与临床上所使用的经典单位范围类似的单位范围存在。典型地，其为0.25-1000毫克/单位。
液体组合物通常在剂量单位范围内。通常，液体组合物的单位剂量范围可以是1-100毫克/毫升。剂量的一些实例为1毫克/毫升、10毫克/毫升、25毫克/毫升、50毫克/毫升及100毫克/毫升。通常，其它药物可按与临床上所使用的经典单位范围类似的单位范围存在。典型地，其为1-100毫克/毫升。
本发明涵盖所有常规给药模式，且口服方法与肠胃外方法是优选的。通常，给药方案可类似于临床上所使用的其它药物的给药方案。典型地，每日剂量可以是每日1-100毫克/公斤体重。通常，口服方式需要较多的化合物，而肠胃外方式需要较少的化合物。然而，具体的给药方案可由医师通过合理的医药判断来确定。
本发明也涵盖在组合疗法中给予所述化合物的方法。即所述化合物可与可用于治疗肝炎及HCV感染的其它药物一起使用，但所述化合物与所述其它药物分开使用。在这些组合方法中，所述化合物通常可搭配其它药物而以每日1-100毫克/公斤体重的每日剂量来给予。其它药物一般可按治疗上所使用的量来给予。然而，具体的给药方案可由医师通过合理的医药判断来确定。
适于组合物及方法的化合物的一些实例列在表2中。
表2.
Figure BDA00002870534600121
Figure BDA00002870534600131
合成方法
所述化合物可通过本领域已知的方法(包括如下所述的那些方法)来制备。一些试剂和中间体在本领域中是已知的。其它试剂和中间体可通过本领域已知的方法使用商购原料来制备。用于描述化合物合成的变量(例如所编号的“R”取代基)仅意在说明如何制备，而不应该与权利要求书中或本说明书其它段落中所使用的变量相混淆。方案中所使用的缩写通常符合本领域中所使用的惯用意义。
方案中所使用的缩写通常符合本领域中所使用的惯用意义。在说明书和实施例中使用的化学缩写如下定义：“NaHMDS”表示二(三甲基甲硅烷基)氨基钠；″DMF″表示N，N-二甲基甲酰胺；“MeOH”表示甲醇；“NBS”表示N-溴代琥珀酰亚胺；“Ar”表示芳基；″TFA″表示三氟乙酸；“LAH”表示氢化铝锂；“BOC”、“DMSO”表示二甲基亚砜；“h”表示小时；“rt”表示室温或保留时间(上下文会指出)；“min”表示分钟；″EtOAc″表示乙酸乙酯；″THF″表示四氢呋喃；“EDTA”表示乙二胺四乙酸；“Et2O”表示***；″DMAP″表示4-二甲基氨基吡啶；“DCE”表示1，2-二氯乙烷；“ACN”表示乙腈；“DME”表示1，2-二甲氧基乙烷；“HOBt”表示1-羟基苯并***水合物；“DIEA”表示二异丙基乙基胺，“Nf”表示CF3(CF2)3SO2-；和“TMOF”表示原甲酸三甲酯。
根据下面的方案制备2-(4-溴苯基)-5-羟基苯并呋喃-3-羧酸乙酯：
Figure BDA00002870534600141
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.50(s，1H)，7.91(m，2H)，7.74(m，2H)，7.50(d，J＝8.9Hz，1H)，7.37(d，J＝2.5Hz，1H)，6.86(dd，J＝8.9，2.5Hz，1H)，4.32(q，J＝7.1Hz，2H)，1.32(t，J＝7.1Hz，3H)。HPLC方法：SUNFIREC18(4.6X150)mm，3.5微米；缓冲液：0.05％TFA/水(pH2.5)；流动相A：缓冲液∶MeCN(95∶5)；流动相B：MeCN∶缓冲液(95∶5)；流速：1ml/min；时间：0；B％：10；时间：12；B％：100；时间：15；B％：100；时间：18；B％：10；时间：23；B％：10；波长：254nm，RT(分钟)：12.856；波长：220nm，RT(分钟)：12.856。
2-(4-溴苯基)-4-氟-5-羟基苯并呋喃-3-羧酸乙酯.在室温，向2-(4-溴苯基)-5-羟基苯并呋喃-3-羧酸乙酯(5g，13.84mmol，1.0eq)于乙腈(300m1)中的混合物中逐份加入选择性氟试剂Selectfluor(6g，16.9mmol，1.22eq)，将混合物搅拌24小时。反应完成后，真空蒸发溶剂。将残余物用水稀释，用EtOAc(100ml x3)萃取。合并的萃取物用饱和盐水溶液洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。将粗制产物通过硅胶(60-120目)柱(使用10％EtOAc/石油醚作为洗脱剂)来纯化并进一步通过制备性HPLC纯化。收率：1.35g(25.8％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.75(s，1H)，7.81-7.74(m，4H)，7.39(d，J＝8.4Hz，1H)，7.08(t，J＝8.4Hz，1H)，4.35-4.30(q，J＝6.8Hz，2H)，1.27(t，J＝6.8Hz，3H)。Column：ZORBAXSB C18(4.6X50mm，5μm)；流动相A：10％MeOH-90％H2O-0.1％TFA；流动相B：90％MeOH-10％H2O-0.1％TFA；流速：1ML/min；时间：0；％A：100；％B：0；时间：2；％A：0；％B：100；保留时间(min)：2.137，波长：220nm。
制备性HPLC方法
柱：Symmetry C18(250x4.6)5μ；流动相A：0.05％TFA/水(15)；流动相B：MeOH(85)；流速：1ml/min，；RT：9.33min。
4-氟-2-(4-溴苯基)-5-羟基苯并呋喃-3-羧酸.在室温，向4-氟-2-(4-氟苯基)-5-羟基苯并呋喃-3-羧酸乙酯(0.75g，1.97mmol，1.0eq)于MeOH/THF的1∶1混合物中加入1M NaOH水溶液(0.35g，8.75mmol，4.4eq)，将混合物加热至60℃，保持4小时。然后将混合物冷却至室温，浓缩，用水稀释并用1.5N HCl酸化。过滤固体，用水洗涤并真空干燥。收率：0.62g(89.3％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.38(bs，1H)，9.70(s，1H)，7.83-7.75(m，4H)，7.37(d，J＝8.0Hz，1H)，7.07(t，J＝8Hz，1H)。柱：purospherstarRP-18(4X55)mm，3μm；流动相A：20mM NH4Oac/90％H2O，10％MeCN；流动相B：20mM NH4Oac/10％H2O，90％MeCN；流速：2.5ML/min；时间：0；％A：100；％B：0；时间：2；％A：0；％B：100；RT(分钟)：1.23，波长：220nm。
4-氟-2-(4-溴苯基)-5-羟基-N-甲基苯并呋喃-3-甲酰胺.在室温和氮气中，向4-氟-2-(4-溴苯基)-5-羟基苯并呋喃-3-羧酸(0.62g，1.77mmol，1eq)、2M甲基胺于THF中的溶液(5.4ml，10.8mmol，6.1eq)、HOBT(0.43g，3.18mmol，1.8eq)、EDCI.HCl(0.61g，3.18mmol，1.8eq)于THF中的混合物中加入二异丙基乙基胺(1.9ml，10.9mmol，6.2eq)。将澄清反应混合物在室温搅拌过夜。浓缩反应混合物并用水稀释，然后过滤收集固体析出物。将产物用石油醚洗涤并真空干燥。收率：0.51g(79.7％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.67(s，1H)，8.63(t，J＝4.4Hz，1H)，7.79-7.72(m，4H)，7.33(d，J＝8.8Hz，1H)，7.02(m，1H)，2.81(d，J＝4.4Hz，3H)。
柱：purospherstar RP-18(4X55)mm，3μm；流动相A：20mMNH4Oac/90％H2O，10％MeCN；流动相B：20mM NH4Oac/10％H2O，90％MeCN；流速：2.5ML/min；时间：0；％A：100；％B：0；时间：2；％A：0；％B：100.；RT(分钟)：1.704，波长：220nm。
4-氟-2-(4-溴苯基)-5-异丙氧基-N-甲基苯并呋喃-3-甲酰胺.在密封管中，将4-氟-2-(4-溴苯基)-5-羟基-N-甲基苯并呋喃-3-甲酰胺(0.17g，0.467mmol，1eq)、2-溴丙烷(0.18ml，1.46mmol，3.1eq)和碳酸铯(0.46g，1.41mmol，3eq)于N-甲基吡咯烷酮中的混合物在50℃加热16小时。将反应混合物冷却至室温，过滤除去无机物。将滤液用水稀释并将产物萃取到EtOAc中。有机物用饱和盐水溶液洗涤，过滤，用Na2SO4干燥并浓缩。粗制产物通过硅胶(60-120)柱色谱法(使用0-20％EtOAc/石油醚作为洗脱剂)来纯化。收率：0.15g(79.4％).1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.66(d，J＝4.4Hz，1H)，7.78-7.73(m，，4H)，7.46(d，J＝9.2Hz，1H)，7.26(t，J＝8.4Hz，1H)，4.53(m，1H)，2.82(d，J＝4.4Hz，3H).1.29(d，J＝6.0Hz，6H)。柱：purospherstar RP-18(4X55)mm，3μm；流动相A：20mMNH4OAc/90％H2O，10％MeCN；流动相B：20mM NH4Oac/10％H2O，90％MeCN；流速：2.5ML/min；时间：0；％A：100；％B：0；时间：1.8；％A：0；％B：100；RT(分钟)：2.117，波长：220nm。
4-氟-2-(4-(4-氟苯氧基)苯基)-5-异丙氧基-N-甲基苯并呋喃-3-甲酰胺.
在密封管中，将4-氟-2-(4-溴苯基)-5-异丙氧基-N-甲基苯并呋喃-3-甲酰胺(0.15g，0.37mmol，1eq)、4-氟苯酚(0.225g，2.0mmol，5.4eq)、Pd(OAc)2(5mg，0.02mmol，0.06eq)、X-phos(16mg，0.037mmol，0.1eq)和K3PO4(0.2g，0.94mmol，2.5eq)于甲苯中的混合物用氮气吹洗5分钟，将反应混合物在50℃加热16小时。将反应混合物冷却至室温，过滤除去无机物。将滤液用水稀释并用EtOAc萃取。有机物用饱和盐水溶液洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。粗制产物通过硅胶(60-120)柱色谱法(使用0-20％EtOAc/石油醚作为洗脱剂)来纯化。收率：0.12g(75.0％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.64(d，J＝4.8Hz，1H)，7.85(d，J＝8.8Hz，2H)，7.44(d，J＝8.8Hz，1H)，7.31-7.27(m，2H)，7.24-7.17(m，3H)，7.12(d，J＝9.2Hz，2H)，4.53(m，1H)，2.81(d，J＝4.4Hz，3H)，1.30(d，J＝6Hz，6H)。
LCMS：(ES+)m/z＝438.2(M+H)+；柱：Xbridge phe(4.6X30mm-3.5μm)；流动相A：2％MeCN/98％H2O-10mM NH4COOH；流动相B98％MeCN/2％H2O-10mM NH4COOH；流速：1.8ML/min；时间：0；％A：100；％B：0；时间：1.5；％A：0；％B：100；RT(分钟)：1.85，波长：220nm。
4-氟-2-(4-(4-氟苯氧基)苯基)-5-羟基-N-甲基苯并呋喃-3-甲酰胺.向4-氟-2-(4-(4-氟苯氧基)苯基)-5-异丙氧基-N-甲基苯并呋喃-3-甲酰胺(0.12g，0.27mmol，1eq)于CH2C12中的混合物中加入BCl3(5ml，5.0mmol，18.5eq，1M于甲苯中)。将反应混合物在室温搅拌3小时，然后用饱和NaHCO3溶液淬灭反应。将混合物用水稀释并将产物萃取到CH2Cl2中。将有机物用饱和盐水溶液洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。收率：0.1g(92.0％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.85(d，J＝2Hz，2H)，7.83-7.05(m，，7H)，6.97(d，J＝8.2Hz，1H)，2.96(d，J＝4Hz，3H).LCMS：(ES-)m/z＝394.0(M-H)；柱：Xbridge phe(4.6X30mm-3.5μm)；流动相A：2％MeCN/98％H2O-10mM NH4COOH；流动相B：98％MeCN/2％H2O-10mM NH4COOH；流速：1.8ML/Min；时间：0；％A：100；％B：0；时间：1.5；％A：0；％B：100；RT(分钟)：1.667，波长：220nm.
三氟甲磺酸4-氟-2-(4-(4-氟苯氧基)苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)苯并呋喃-5-基酯.在室温和氮气中，向4-氟-2-(4-(4-氟苯氧基)苯基)-5-羟基-N-甲基苯并呋喃-3-甲酰胺(0.1g，0.25mmol，1.0eq)于CH2C12中的溶液中加入三乙胺(0.1ml，0.71mmol，2.8eq)。将混合物冷却至0℃并添加N-苯基-二-(三氟甲磺酰胺)(0.11g，0.31mmol，1.2eq)，然后在室温搅拌3小时。真空浓缩反应混合物，将残余物用水稀释，然后用CH2C12萃取，有机层用饱和盐水溶液洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。粗制产物通过硅胶(60-120)柱色谱法(使用0-10％EtOAc/石油醚作为洗脱剂)来纯化，得到所需产物，其为灰白色固体。收率：0.126g(94.7％).1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.77(d，J＝4.4Hz，1H)，7.89-7.86(m，2H)，7.75-7.65(m，2H)，7.33-7.28(m，2H)，7.23-7.15(m，4H)，2.84(d，J＝4.8Hz，3H).LCMS：(ES+)m/z＝528.0(M+H)+；柱：Xbridge phe(4.6X30mm-3μm)；流动相A：2％MeCN/98％H2O-10mM NH4COOH；流动相B98％MeCN/2％H2O-10mM NH4COOH；流速：1.8ML/min；时间：0；％A：100；％B：0；时间：1.5；％A：0；％B：100；RT(分钟)：1.89，波长：220nm。
5-(4-氟-2-(4-(4-氟苯氧基)苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)苯并呋喃-5-基)-2-甲氧基-4-甲基苯甲酸甲酯.向三氟甲磺酸4-氟-2-(4-(4-氟苯氧基)苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)苯并呋喃-5-基酯(0.11g，0.208mmol，1eq)、2-甲氧基-4-甲基-5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂戊环-2-基)苯甲酸甲酯(0.075g，0.245mmol，1.18eq)于甲苯/EtOH(4∶1)中的混合物中加入1.0M Na2CO3(0.09g，0.849mmol，4.0eq)水溶液，将混合物用氮气吹洗10分钟。加入四(三苯基膦)钯(0)(0.022g，0.019mmol，0.09eq)，并再次使氮气吹洗通过所述反应混合物，保持10分钟。将上述反应混合物在100℃加热过夜。分离甲苯层，水层用EtOAc萃取。合并有机层并浓缩。将所得产物通过硅胶(60-120)柱色谱法(使用40％EtOAc/己烷作为洗脱剂)来纯化。收率：94mg(77.6％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.67(d，J＝4.4Hz，1H)，7.89(d，J＝8Hz，2H)，7.60(d，J＝6.4Hz，1H)，7.53(s，1H)，7.32-7.26(m，3H)，7.21-7.14(m，3H)，7.14(d，J＝6.8Hz，2H)，3.88(s，3H)，3.77(s，3H)，2.79(d，J＝4.8Hz，3H)，2.21(s，3H)。
LCMS：(ES+)m/z＝558.2(M+H)+.柱：Xbridge phe(4.6X30mm-3.5μm)；流动相A：2％MeCN/98％H2O-10mM NH4COOH；流动相B98％MeCN/2％H2O-10mM NH4COOH；流速：1.8ML/min；时间：0；％A：100；％B：0；时间：1.5；％A：0；％B：100；RT(分钟)：1.868，波长：220nm。
5-(4-氟-2-(4-氟苯氧基)苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)苯并呋喃-5-基)-2-甲氧基-4-甲基苯甲酸.在环境温度，向5-(4-氟-2-(4-(4-氟苯氧基)苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)苯并呋喃-5-基)-2-甲氧基-4-甲基苯甲酸甲酯(0.09g，0.16mmol，1.0eq)于MeOH/THF的1∶1混合物中加入1M NaOH(0.03g，0.75mmol，4.7eq)溶液，然后将混合物在60℃搅拌3小时。浓缩反应混合物，用水稀释并用1.5N HCl酸化。过滤固体并用石油醚洗涤。收率：0.05g(57.4％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.50(s，1H)，8.66(q，J＝4.8Hz，1H)，7.90-7.86(m，2H)，7.58-7.08(m，10H)，3.87(s，3H)，2.79(d，J＝4.8Hz，3H)，2.21(s，3H).LCMS：(ES+)m/z＝544.2(M+H)+；柱：Xbridge phe(4.6X30mm-3.5μm)；流动相A：2％MeCN/98％H2O-10mM NH4COOH；流动相B98％MeCN/2％H2O-10mMNH4COOH；流速：1.8ML/min；时间：0；％A：100；％B：0；时间：1.5；％A：0；％B：100；RT(分钟)：1.529，波长：220nm。
4-氟-2-(4-(4-氟苯氧基)苯基)-5-(4-甲氧基-2-甲基-5-(1-(嘧啶-2-基)环丙基氨基甲酰基)苯基)-N-甲基苯并呋喃-3-甲酰胺.在0℃，向5-(4-氟-2-(4-氟苯氧基)苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)苯并呋喃-5-基)-2-甲氧基-4-甲基苯甲酸(0.04g，0.073mmol，1.0eq)、1-(嘧啶-2-基)环丙胺HCl(0.020g，0.116mmol，1.6eq)于DMF中的混合物中加入三乙胺(0.1ml，0.717mmol，9.8.eq)和Py-BOP(0.06g，0.115mmol，1.58eq)。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后用水稀释并冷却至0℃。过滤析出的固体，用水洗涤并真空干燥。将粗制产物通过制备性HPLC纯化。收率：0.020g(41.1％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.66(d，J＝4.8Hz，2H)，7.91-7.88(m，3H)，7.50(d，J＝8Hz，1H)，7.27-7.20(m，2H)，7.18-7.12(m，7H)，4.09(s，3H)，2.95(s，3H)，2.30(s，3H)，1.80(m2H)，1.52(m，2H)。19FNMR(376.57MHz，CD3OD)δ-121.02，-122.94。(19F化学位移参考在0.0ppm的CFCl3)。LCMS：(ES+)m/z＝661.2(M+H)+；柱：AscentisExpressC8(2.1x50mm)-2.7μm；流动相A：2％MeCN/98％H2O-10mMNH4COOH；流动相B98％MeCN/2％H2O-10mM NH4COOH；流速：1ML/min；时间：0；％A：100；％B：0；时间：1.5；％A：0；％B：100；RT(分钟)：2.04，波长：220nm。HPLC方法：SUNFIRE C18(4.6X150)mm，3.5微米；缓冲液：0.05％TFA/水(pH2.5)；流动相A：缓冲液∶MeCN(95∶5)；流动相B：MeCN∶缓冲液(95∶5)；流速：1ml/min；时间：0；B％：10；时间：25；B％：100；波长：254nm，RT(分钟)：20.793；波长：220nm，RT(分钟)：20.793。HPLC方法：XBridege苯基(4.6X150)mm，3.5微米；缓冲液：0.05％TFA/水(pH2.5)；流动相A：0.05％TFA/水∶MeCN(95∶5)；流动相B：0.05％TFA/MeCN∶水(95∶5)；流速：1ml/min；时间：0；B％：10；时间：25；B％：100；波长：254nm，RT(分钟)：18.878；波长：220nm，RT(分钟)：18.878。制备性HPLC方法：柱：XTerraC18(250x4.6)5μ)；流动相A：20mM醋酸铵/水；流动相B：MeCN；流速：1ml/min，时间：0；B％：60；时间：20；B％：60；时间：22；B％：100；时间：25；B％：100；RT：11.962min。
对本领域技术人员来说明显的是，本发明并不限于前述示例性实施例，并且本发明可按其它具体形式实施而不背离本发明的基本特征。因此，所述实施例在所有方面都应被理解为是示例性的而非限制性的，参考随附的权利要求书而不是前述实施例，因此，落入权利要求含义和范围内的所有变化预期被本发明所涵盖。

Claims (6)

1.式I化合物或其药用盐，
其中：
R1为苯基或吡啶基并且取代有0-3个取代基，所述取代基选自卤素、烷基、卤代烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、烷氧基、羟基烷基氧基和烷氧基烷基氧基，并且R1还取代有1个CON(R9)(R10)取代基；
R2为氢、卤素或烷基；
R3为CONHCH3；
R4为苯基，其对位取代有X-Ar1；
R5和R6独立地为氢、烷基、卤素、N(R7)(R8)或烷基磺酰基；
R7和R8独立地为氢、烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、烷基磺酰基或烷基磺酰基烷基；
或者N(R7)(R8)一起为氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基或哌嗪基，并且取代有0-2个选自烷基、羟基烷基或羟基的取代基；
R9为氢；
R10为
Figure FDA00002870534500012
R11和R12独立地为氢、烷基、羟基烷基或烷氧基烷基；
或者R11和R12一起为亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基或亚己基；
X为-O-或-NH-；
Ar1为苯基或对-卤代苯基；和
Ar2为苯基、吡啶基、吡唑基、异噁唑基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁二噻唑基、***基、四唑基、吡嗪基或嘧啶基，并且取代有0-3个选自卤素、烷基或二烷基氨基的取代基。
2.权利要求1的化合物或其药用盐，其中
R1为取代有0-3个取代基的苯基，所述取代基选自卤素、烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、烷氧基或羟基烷基氧基，并且R1还取代有1个CON(R9)(R10)取代基；
R2为氢或F；
R3为CONHCH3，
R4为苯基，其对位取代有X-Ar1；
R5和R6为氢；
R11和R12独立地为甲基，或者R11和R12一起为亚乙基或亚丙基；
X为-O-；
Ar1为对-氟苯基；和
Ar2为苯基、吡啶基、吡唑基、异噁唑基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁二噻唑基、***基、四唑基、吡嗪基或嘧啶基，并且Ar2取代有0-3个选自卤素或烷基的取代基。
3.权利要求2的化合物或其药用盐，其中R1为取代有0-2个取代基的苯基，所述取代基选自烷基和烷氧基，并且R1还取代有1个CON(R9)(R10)取代基；R2为F；R3为CONHCH3；R4为苯基，其对位取代有X-Ar1；R5和R6为氢；R11和R12一起为亚乙基；X为-O-；Ar1为对-氟苯基；和Ar2为嘧啶基。
4.权利要求3的化合物或其药用盐，所述化合物为
Figure FDA00002870534500021
5.一种组合物，其包含权利要求1的化合物或其药用盐和药用载体。
6.一种治疗丙型肝炎感染的方法，所述方法包括向患者给药治疗有效量的权利要求1的化合物。
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