CN103091467B

CN103091467B - 检测肉制品中恩拉霉素残留的方法

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Publication number: CN103091467B
Application number: CN201310007610.XA
Authority: CN
Inventors: 严玉宝; 余华; 叶健强; 廖党金; 胡娟; 谢晶; 崔鹏博; 周岷江
Original assignee: SICHUAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC; Sichuan Animal Science Academy
Current assignee: SICHUAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC; Sichuan Animal Science Academy
Priority date: 2013-01-09
Filing date: 2013-01-09
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2033-01-09
Also published as: CN103091467A; WO2014108016A1

Abstract

本发明涉及检测肉制品中恩拉霉素残留的方法，属于食品检测技术领域。本发明所解决的技术问题是提供了一种检测限更低的检测肉制品中恩拉霉素残留的方法。本发明检测肉制品中恩拉霉素残留的方法包括如下步骤：a、分别将待检测肉制品提取液和系列浓度的恩拉霉素标准液加入到预包被恩拉霉素抗原的微孔中；b、然后于各微孔中加入抗恩拉霉素抗体，混匀后孵育；c、于各微孔中加入辣根过氧化物酶HRP—羊抗兔IgG，混合后孵育；d、分别于各微孔中加入底物溶液，显色；e、分别于各微孔中加入终止液终止反应，用酶标仪读取各孔OD₄₅₀值；f、对照恩拉霉素标准液所得的曲线回归方程，计算出待检测肉制品中的恩拉霉素含量。

Description

检测肉制品中恩拉霉素残留的方法

技术领域

本发明涉及检测肉制品中恩拉霉素残留的方法，属于食品检测技术领域。

背景技术

恩拉霉素（Enramycin），又名恩来霉素、恩霉素、安来霉素、持久霉素，是由土壤中分离出来的放线菌Streptomyces fungicidious NO.B5477发酵产生的一种多肽类抗生素。该药于1966年由日本武田药品工业株式会社研发，1974年在日本正式注册，其后在许多国家被注册和广泛使用。该药对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎球菌、枯草杆菌、炭疽杆菌、破伤风梭菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌等革兰氏阳性菌有很强的杀菌活性，可通过抑制肠道中有害细菌的生长和繁殖来改变肠道内的菌群平衡，增加饲料中营养物质的吸收和利用。长期使用该药，不易产生耐药性，与其他抗生素之间不产生明显交叉耐药，同时有化学性能稳定，无致突、致畸、致癌作用，不易被吸收，残留少，适口性好等优势，因此被世界上许多国家推荐作为抗生素促生长剂，常作为饲料添加剂用于促进动物增重和提高饲料利用效率。1988年我国农业部批准进口该药，现在已有恩拉霉素预混料销售，并且呈现良好的市场发展前景。

随着全球贸易自由化进程的加快，以及“二噁英”、药物残留等有毒有害物质造成的重大动物源性食品污染事件的频发，世界各国都构筑起各具特色的动物产品质量安全管理体系，从法律法规体系、检验检疫监管体系、标准体系、认证体系等方面来保证动物源性产品的质量安全。由于对动物产品药残检测研究起步较晚，我国的药残检测标准和检测水平落后于发达国家。发达国家凭借在科技、管理、环保等方面的优势，从技术法规、标准、合格评定程序等方面对我国动物产品出口不断设置新的“绿色贸易壁垒”门槛，致使在我国国内合格的动物产品在出口后被进口国检出抗生素、农药、兽药残超标而被退回或销毁的事件屡见不鲜，造成的直接和间接经济损失在百亿美元以上。因此，提高我国动物产品药残的检测水平势在必行。

兽药残留检测是复杂混合物中痕量组分的分析技术，抗生素的残留量一般都在微克到纳克级,经典的化学分析法无法检测或定量不够准确,因此要求残留抗生素检测法必须达到灵敏、快速、高效。抗生素残留检测法总体可以归为3大类:微生物检测法、理化检测法和免疫分析技术。

微生物检测法是应用较广泛的方法，其测定原理是根据抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用，来定性或定量确定样品中抗生素微生物药物残留，其衍生出的纸片法（PD）对氯霉素最低检出量0.01mg/L；氯化三苯基四氮唑法（tripheye tetrazolium chloride，TTC法）对青霉素的最低检出量为0.004IU/mL；管碟法对青霉素的敏感度为0.01U/mL；戴尔沃检测法（SP）其灵敏度为：青霉素3ng/mL，链霉素300ng/mL,庆大霉素400ng/mL。随着研究的深入，还出现了拭子法、牛的抗生素和磺胺实验法（CAST）、快速抗生素筛选法（FAST）等更为灵敏、准确、简便、快速的微生物检测方法。微生物检测方法能检测出接近最高残留限量浓度水平的样品，能够进行大批量、快速、灵敏的测定，且可以非实验室环境下进行。微生物检测法具有不需要特殊设备、操作简单、易推广、灵敏度高、适用于大批量样品的同时检测等优点，缺点是操作繁琐，检测周期长，环境要求高，显色状态判断通过肉眼判断，其结果的主观性强。

理化检测法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法（GC）、质谱法、联用技术等，能进行定性、定量和药物鉴定，敏感性较高，但有的检测程序较复杂，检测成本高，仪器设备要求高，操作规范严格。

免疫分析技术是目前最理想的残留筛选性分析方法之一。在目前药物残留分析中主要分为两大类：一为相对独立的分析方法，即免疫测定法（Immunoassays,IAs），如RIA、ELESA、固相免疫传感器等；二是将免疫分析技术与常规理化分析技术联用，如免疫亲合色谱（IAC），它可使兽药残留分析将免疫技术的高选择性和理化技术的快速分离和灵敏性融为一体，避免了IA直接测定样本信息量太少、假阳性或理化分析技术选择性低等不足，分析过程简化。IAC-HPLC或IAC-GC是常见的联用方式，如氯霉素、阿维菌素和伊维菌素等残留分析。未来兽药残留分析技术中的免疫分析技术将向试剂标准化、使用更灵敏和抗干扰性强的标记物和理化分析技术联用方向发展。

免疫分析技术与常规的理化分析技术相比，最突出的优点是操作简单，速度快、分析成本低。如ELISA法，免疫测定方法取样量小，前处理简单，容量大，仪器化程度低，检测与GC/MS或GC/ECD相似，可达到ng/g-pg/g级，分析效率则为HPLC或GC的几十倍以上。目前大部分抗生素已经建立了免疫测定法，如磺胺二甲嘧啶、氯霉素、沙拉沙星、链霉素、四环素、莫能菌素等。

ELISA试剂盒是目前使用最广泛、快速、灵敏的检测抗生素残留的方法，但是各类抗生素试剂盒多为国外生产，使得国内检测花费非常大，如德国拜耳公司生产的抗生素检测试剂盒，一个96次检测试剂盒要花3800元，每个样品的检测要花30~50元，因此很有必要研制和开发出国产的试剂盒，以降低成本，提高经济效益。

日本已建立畜、水产性食品中恩拉霉素残留检测方法，我国建立了恩拉霉素预混料和饲料级的检测，袁而森（1999）在此基础上探索过对肉制品残留检测，检测限量为0.3ppm，其检测方法都是微生物检测法。Horie（1985）利用高效液相色谱分析猪、鸡肌肉恩拉霉素残留，检测限量为0.2ppm。恩拉霉素的ELISA检测方法和试剂盒都未曾见报道。由于目前世界各国的食品安全卫生控制指标限量逐步降低，食源性危害关键检测技术趋向高科技化、系列化（多残留检测）、速测化、器具便携化，建立新的高敏感度、便携化的、低成本的恩拉霉素药残检测方法以适应现在的动物产品检验检疫要求是非常有必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测限更低的检测肉制品中恩拉霉素残留的方法。

本发明检测肉制品中恩拉霉素残留的方法包括如下步骤：

a、分别将待检测肉制品提取液和系列浓度的恩拉霉素标准液加入到预包被恩拉霉素抗原的微孔中；其中，所述的肉制品提取液采用下述方法制备得到：取待检测肉制品剪碎，匀浆，加浓度为50%v/v的甲醇-水溶液，匀浆，用浓HCl调整pH值3.5～4.0，混匀，8000～12000rpm离心8～12min，取上清液，用NaOH调节pH值至8.0，8000～12000离心8～12min，取上清液，即得待检测肉制品提取液；所述的恩拉霉素抗原采用申请号为CN201010556432.2的方法制备得到；

b、然后于各微孔中加入抗恩拉霉素抗体，混匀后孵育；

c、于各微孔中加入辣根过氧化物酶HRP—羊抗兔IgG，混合后孵育；

d、分别于各微孔中加入底物溶液，显色；

e、分别于各微孔中加入终止液终止反应，用酶标仪读取各孔OD450值；

f、对照恩拉霉素标准液所得的曲线回归方程，计算出待检测肉制品中的恩拉霉素含量。

其中，采用a步骤中的方法制备肉制品提取液可以提高待检测肉制品中的恩拉霉素的溶解性和回收率，同时还提高了提取液中的恩拉霉素的稳定性。

其中，本发明检测肉制品中恩拉霉素残留的方法，所述的恩拉霉素抗原可以采用申请号为CN201010556432.2，发明名称为“一种恩拉霉素完全抗原的合成方法”的专利申请公开的方法制备得到。

其中，为了节约成本，本发明方法的b步骤中加入的抗恩拉霉素抗体可以采用含有抗恩拉霉素抗体的血清代替。

其中，OD值为1.0左右时的抗原抗体浓度为最适工作浓度，经本发明的发明人研究发现，本发明方法的a步骤中所述的预包被恩拉霉素抗原的包被浓度为2.30ug/mL，b步骤中加入的含有抗恩拉霉素抗体的血清的稀释度为1:10000。此时抗原抗体浓度为最适工作浓度。

其中，上述检测肉制品中恩拉霉素残留的方法，其e步骤中所述的终止液可以为ELISA法酶联免疫实验常用的终止液，如硫酸溶液。

进一步的，本发明检测肉制品中恩拉霉素残留的方法，优选包括如下步骤：

a、分别将待检测肉制品提取液和系列浓度的恩拉霉素标准液加入到预包被恩拉霉素抗原的微孔中；待检测肉制品提取液和系列浓度的恩拉霉素标准液的加入量为50uL/孔；

b、然后于各微孔中加入含有抗恩拉霉素抗体的血清50uL/孔，血清稀释度为1:10000，37℃孵育lh，洗涤，拍干；

c、于各微孔中加入辣根过氧化物酶HRP—羊抗兔IgGl:20000倍稀释，100uL/孔，混合后于37℃孵育lh，洗涤，拍干；

d、分别于各微孔中加入100uL底物溶液（可以为ELISA酶联免疫实验常用的底物溶液），37℃显色10min；

e、分别于各微孔中加入终止液2moL/mLH₂SO₄终止反应，用酶标仪读取各孔OD₄₅₀值；

f、以无恩拉霉素抑制时OD值为Bo,各相应浓度恩拉霉素抑制时的OD₄₅₀值为B值，以B/Bo为纵坐标，以恩拉霉素浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，对照恩拉霉素标准液所得的曲线回归方程，计算出待检测肉制品中的恩拉霉素含量。

其中，本发明方法适合于所有常见的肉制品，比如：为猪肉、羊肉、牛肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、鱼肉中至少一种，优选为鸡肉。

本发明方法对肉制品中的恩拉霉素的检测限范围为8.9ng/mL～982ng/mL，其灵敏度远高于现有方法，取得了意料不到的技术效果。

本发明方法提高了肉制品中的恩拉霉素的检测限，其检测范围为：8.9ng/mL～982ng/mL，比已有的微生物检测法更快捷、简便、灵敏和灵活，同时也比高效液相色谱法的检测成本更低，本发明为肉制品中的恩拉霉素残留的检验提供了一种可行的方法，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为恩拉霉素抗血清效价测定曲线图；

图2为恩拉霉素抗原抗体工作浓度的方阵滴定曲线图；

图3为检测恩拉霉素的间接竞争性ELISA标准曲线图。

具体实施方式

本发明检测肉制品中恩拉霉素残留的方法包括如下步骤：

b、然后于各微孔中加入抗恩拉霉素抗体，混匀后孵育；

c、于各微孔中加入辣根过氧化物酶HRP-羊抗兔IgG，混合后孵育；

d、分别于各微孔中加入底物溶液，显色；

e、分别于各微孔中加入终止液终止反应，用酶标仪读取各孔OD₄₅₀值；

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1本发明检测肉制品中恩拉霉素残留的方法的建立

1、试验材料与试验方法

1.1试验材料

新西兰大白兔；

恩拉霉素人工抗原(Er-BSA和Er-OVA，采用申请号为CN201010556432.2，发明名称为“一种恩拉霉素完全抗原的合成方法”的专利申请公开的方法合成)；

弗氏完全佐剂（FCA，Sigma公司）；

弗氏不完全佐剂（FICA，Sigma公司）；

酶标二抗(山羊抗兔IgG-HRP,华美生物工程公司进口分装)；

96孔酶标板(COSTAR)；

三甲基联苯胺(TMB，AMRESCO公司)，其余化学试剂均为分析纯。

1.2试剂的配制与用品准备

1.2.1配制试剂

0.85％生理盐水溶液:0.85gNaCL溶于100mL去离子水；

萘氏试剂溶液:11.50gHgI和8.00gKI溶于50mL蒸馏水中,搅拌溶解后,再加入50mL20%NaOH；

饱和硫酸铵溶液:425g硫酸铵加入500mL去离子水中，然后边加热边搅拌至基本溶解，趁热过滤，待其冷却到室温后用氨水调pH到7.0；

包被缓冲液(CBS,0.05M pH9.6)：0.159g碳酸钠和0.293g碳酸氢钠溶解于离子水中，定容到100mL：

稀释缓冲液(PBS,0.01M pH7.4)：800gNaCL,0.20gKCL,0.20gKH₂P04,3.58g,Na₂C03·12H₂0，溶于800mL去离子水中，用NaCL或HCL调pH7.2～7.4，定容到1000mL；

磷酸盐洗涤缓冲液:将PBS缓冲液中添加0.05％Tween-20；

TMB底物储存液：10mgTMB溶于2mLDMSO中，在4℃冰箱中避光保存；

柠檬酸缓冲液(pH5.0)：2.3328g柠檬酸,9.2006gNa₂C03·12H₂O,定容到500mL；

底物缓冲液:将柠檬酸缓冲液(pH5.0)500mL中加入0.5mLTween-20；

样品稀释液；1.0LPBS加1.0mLTween-20和1g明胶；

终止液：2mol/LH₂SO₄；

封闭液：明胶1.0g加入包被缓冲液（CBS)100mL；

1.2.2主要仪器

酶标仪（Bio－Tek ELX800型）;

各种规格移液枪(Eppendorf);

BS100S型分析天平(北京赛多利斯公司);

DF-101S型恒温加热磁力搅拌器(河南予华仪器公司);

漩涡振荡仪;

恒温水浴锅;

ULT1386-3-V38型低温冰箱(美国REVCO公司);

DCD-172K型常规冰箱(美国伊莱克斯公司);

培养箱（浙江科通仪器公司）;

RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）;

KQ-600型超声波清洗器;

1.3试验方法

1.3.1免疫方案

选10只健康的2月龄雄性实验用清洁级新西兰大白兔，体重为2.0~2.50kg/只,用兔子分笼饲养，自由饮食；在免疫前采集阴性血清备用,免疫程序见表1。

表1实验动物免疫方案程序

注：70天免疫结束后采血。

将人工抗原解冻，在无菌状态下以适量生理盐水稀释后，滴加到等体积的佐剂（FCA或FICA）中，混合乳化后成油包水(W/O)状态，使免疫的最终浓度为1mg/mL(以载体蛋白含量计算），据表1设计方案进行相关免疫程序和采血检测。免疫前采耳缘静脉血1mL，4℃放置4h后3000rpm*10min离心取血清，将血清与甘油(1:1)等体积混和，保存于-20℃冰箱,用于空白对照,在70d免疫结束后采用心脏直接采血法采血,20~30mL/只；按上述方法分离血清，分装和保存。

1.3.2EL1SA方法的建立

1.3.2.1抗原抗体最佳工作浓度的测定

分别从每只家兔的耳缘静脉采血1mL，室温静置1h，4℃冰箱2~3h，3000g/min15min离心分离血清。采用方阵滴定法确定抗原、抗体的最适工作浓度，具体步骤如下：

a、包被：用包被液将包被抗原稀释成一系列浓度加至酶标板，100uL/孔，37℃孵育2h，然后4℃过夜；

b、洗涤：用洗涤液洗3遍，200uL/孔，每次间隔1min，在吸水纸上拍干；

c、封闭：加入封闭液150uL/孔，37℃孵育1h后,4℃过夜，洗涤同b；

d、加样：加入事先系列稀释好的抗体，100uL/孔，37℃孵育1h；

e、洗涤：用洗液洗5遍，200uL/孔，每次间隔1min，在吸水纸上拍干；

f、加酶：加入HRP—羊抗兔lgG(1:20000倍稀释)100uL/孔，37℃孵育1h；洗板同(e)；

g、显色：加入100uL/孔TMB底物使用液/孔，37℃显色10min；

h、终止：加入2moL/mlH₂SO₄50uL/孔，用酶标仪读取各孔OD₄₅₀；

判定标准:阳性血清OD₄₅₀在1.0左右抗原包被浓度和抗体稀释度为最佳工作浓度。

阳性血清与阴性血清的P/N比值≥2.0倍的血清稀释倍数为血清效价。

1.3.2.2间接竞争ELISA方法的建立

a、包被：用包被液将包被抗原稀释成一定浓度加至酶标板100uL/孔，37℃孵育2h，然后4℃过夜；

c、封闭：加入封闭液150uL/孔，37℃孵育1h后拍干；

d、加样：加入系列稀释的Er标准品50uL/孔，再加入适当稀释的抗体50uL/孔，37℃孵育1h；

e、洗涤：用洗涤液洗3遍，250uL/孔，每次间隔1min，在吸水纸上拍干；

f、加二抗:加入HRP—羊抗兔IgG(1：20000倍稀释)100uL/孔，37℃孵育1h；洗板同(e)；

g、显色：分别加入100uL底物溶液/孔，37℃显色10min；

1.3.2.3饱和硫酸铵法纯化多抗血清

多抗血清的纯化采用饱和硫酸铵法，将最后一次免疫后的兔子取血后获得的血清一部分与等量灭菌甘油混合后于1.5mL离心管中分装保存；一部分纯化提取lgG后再与等量灭菌甘油混合分装保存。该法具体操作步骤如下：

取血清加等量生理盐水，于搅拌下逐滴加入与稀释血清等量的饱和硫酸铵[终浓度为50％饱和(NH4)2SO4]，然后于4℃，3小时以上，使其充分沉淀，心(3000rpm)20分钟，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至Xml。再逐滴加饱和硫酸铵Ｘ/2ml，置4℃，3小时以上［此时(NH4)2SO4的饱和度为33％)］。重复上述第二步过程2次。将末次离心后所得沉淀物以0.02M PH7.4PBS溶解至Xml装入透析袋。对PBS充分透析、除盐换液3次，至萘氏试剂测透析外液为无黄色，透析结束。纯化后血清一部分与甘油1:1等体积混合，其余直接冷冻干燥后保存于-20℃。

1.3.2.4标准曲线的制作

将1.3.2.2中的OD_450nm以无Er抑制时OD值为Bo,各相应浓度Er抑制时的OD值为B值，以B/Bo为纵坐标，以Er浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程。

1.3.2.5样品提取方法

按照恩拉霉素粗品的分离、纯化的方法进行粗品处理。取5.0g鸡肌肉组织剪碎，匀浆1~2min，置于100mL离心管中，加20毫升甲醇-水溶液中，匀浆10min，用浓HCL调整pH3.5~4.0，充分搅拌10min，10000rpm离心10min，取上清液，用NaOH调节pH至8.0，10000rpm离心10min，取上清液，作为检测液备用。

1.3.2.6添加回收率的测定

取空白的鸡肌肉组织，按照500、250、50n/g的浓度添加Er,且使其在肌肉组织中混匀，并室温静置20min，按照1.3.2.5中的提取方法进行提取，所得提取液进行ELISA检测。每个添加浓度做5份样品，ELISA检测时每份样品的提取液做2个平行重复孔。各样品经上述方法处理后，按1.3.2.2中的方法进行操作，检测OD_450nm的吸收值，根据1.3.2.4的方法计算抑制率，代入标准回归方程，计算Er的含量，并根据以下公式计算添加回收率：

2.结果分析

2.1Er抗血清效价的测定

采用间接ELISA方法，测得抗Er抗血清的最高效价大于1:320000，结果表明用戊二醛法制备免疫抗原来免疫家兔，能够产生特异性抗体。在进行了4次免疫后，试验家兔均产生了针对Er的抗体，其中4号样品的抗血清效价明显高于其他家兔的抗血清效价，结果见图1。

2.2ELISA检测方法的建立

2.2.1包被抗原Er-OVA与纯化后抗Er抗血清工作浓度的确定

根据ELISA检测的基本要求，选择OD值为1.0左右时的抗原抗体浓度为最适工作浓度。因此根据方阵滴定的结果确定包被抗原Er-OVA的最适包被浓度为2.30ug/mL，混合血清工作浓度为1:10000。结果见图2。

2.3.2标准曲线的建立

用间接竞争ELISA法建立检测Er的标准曲线，呈良好的线性相关。抑制率(B/B₀)与浓度的对数(LogC，母液为lmg/mL)之间的线性回归方程为：y=-0.2985x+1.0148；y：抑制率(B/B₀),x：浓度的对数,相关系数r²=0.9924；其抑制中点即抑制率为50%时对应的浓度是53.0ng/mL；检出范围在8.9ng/mL~982ng/mL之间，其标准曲线见图3.

2.3.4添加回收率测定

在鸡肌肉组织中以500、250、50n/g的浓度添加Er，提取液用ELISA检测，计算出相应Er的含量，并根据添加的量计算回收率，结果见表2。

表2样品中添加Er的回收结果(n=5)

添加回收率试验是确定本发明分析方法可靠性的标志。本试验在添加500、250、50n/g浓度水平下，鸡肌肉组织中的平均添加回收率范围在57.1%~78.62%，变异系数为4.83%~28.37%。即本发明方法的可靠性达到要求。

目前，我国对与恩拉霉素的检测方法仅仅利用微生物检测法建立了预混料和饲料级的检测手段，袁而森等和谢明权等报道的检测极限分别为0.30ug/g和大于0.025mg/g的检测限；另外，据文献报道，日本厚生省利用高效液相色谱法建立了畜、水产食品恩拉霉素残留检测法，检测限量也仅为0.20ug/g。本发明采用酶联免疫分析技术作为检测手段，建立了间接竞争ELISA法，对Er进行了检测，在实际中可以应用，与国内外免疫检测方法的比较见表3。

表3对Er检测法及检测限的比较

Claims

1.检测肉制品中恩拉霉素残留的方法，其特征在于包括如下步骤：

a、分别将待检测肉制品提取液和系列浓度的恩拉霉素标准液加入到预包被恩拉霉素抗原的微孔中；其中，所述的肉制品提取液采用下述方法制备得到：取待检测肉制品剪碎，匀浆，加浓度为50%v/v的甲醇-水溶液，匀浆，用浓HCl调整pH值3.5～4.0，混匀，8000～12000rpm离心 8～12min，取上清液，用 NaOH 调节 pH 值至 8.0，8000～12000 离心 8～12min，取上清液，即得待检测肉制品提取液；所述的恩拉霉素抗原采用申请号为 CN201010556432.2 的方法制备得到，其中，所述的预包被恩拉霉素抗原的包被浓度为 2.30ug/mL；

b、然后于各微孔中加入抗恩拉霉素抗体，混匀后孵育，其中，抗恩拉霉素抗体为含有抗恩拉霉素抗体的血清，血清的稀释度为1:10000；

c、于各微孔中加入l:20000 倍稀释的辣根过氧化物酶 HRP—羊抗兔 IgG，混合后孵育；

d、分别于各微孔中加入底物溶液，显色；

e、分别于各微孔中加入终止液终止反应，用酶标仪读取各孔 OD450 值；

2.根据权利要求1所述的检测肉制品中恩拉霉素残留的方法，其特征在于：e步骤中所述的终止液为硫酸溶液。

3.根据权利要求1所述的检测肉制品中恩拉霉素残留的方法，其特征在于包括如下步骤：

b、然后于各微孔中加入含有抗恩拉霉素抗体的血清50uL/孔，血清稀释度为1:10000， 37℃孵育 lh，洗涤，拍干；

c、于各微孔中加入辣根过氧化物酶 HRP—羊抗兔，100uL/孔，混合后于37℃孵育 lh，洗涤，拍干；

d、分别于各微孔中加入100uL 底物溶液，37℃显色 10min；

e、分别于各微孔中加入终止液2moL/mLH2SO4 终止反应，用酶标仪读取各孔 OD₄₅₀ 值；

f、以无恩拉霉素抑制时 OD 值为 Bo,各相应浓度恩拉霉素抑制时的 OD₄₅₀ 值为B值，以B/Bo 为纵坐标，以恩拉霉素浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，对照恩拉霉素标准液所得的曲线回归方程，计算出待检测肉制品中的恩拉霉素含量。

4.根据权利要求1～3任一项所述的检测肉制品中恩拉霉素残留的方法，其特征在于：所述的待检测肉制品为猪肉、羊肉、牛肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、鱼肉中至少一种。

5.根据权利要求4所述的检测肉制品中恩拉霉素残留的方法，其特征在于：所述的待检测肉制品为鸡肉。