CN103088157A - 鉴别和定量***双价苗以及多价苗中抗原的血清型的一种方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了鉴别和定量***双价苗以及多价苗中抗原的血清型的一种方法，通过样品处理提取疫苗破乳后水相中***病毒RNA，应用荧光定量PCR检测方法来扩增样品中不同血清型的***病毒RNA，进行鉴别和定量检测，其中，O型***病毒引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：1~3所示，AsiaI型***病毒引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：4~6所示，A型***病毒引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：7~9所示。本发明的方法具有灵敏性高、稳定性高、特异性好、可以分别准确定量样品中不同型的抗原等特点；具有检测范围广的特点，在100～10¹⁰拷贝范围内具有良好的线性关系，检测范围可以达到10个数量级。

Description

鉴别和定量***双价苗以及多价苗中抗原的血清型的一种方法

技术领域

本发明属于检验技术领域，具体是一种鉴别和定量***双价苗以及多价苗中抗原的血清型的检测方法。

背景技术

***(Foot and mouth disease，FMD)是由***病毒(FMDV)引起的一种严重危害偶蹄动物的疫病，被OIE列为A类传染病之首。***病毒培养物中可以分离出不同密度的粒子，主要有四种：完全病毒(146S)、空衣壳(75S)、12S蛋白质亚单位(12S)、病毒感染相关成分(VIA抗原4.5S)。在动物免疫中，刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞有关的主要是完全病毒颗粒146S抗原，该抗原含有***病毒所有的中和位点，是***病毒的有效抗原成分，能刺激机体产生坚强的体液免疫和细胞免疫。

***疫苗中146S抗原的含量直接决定了疫苗的质量，因此在国外***疫苗生产厂家中，***146S抗原的检测是重要的一个环节，这些厂家一般通过层析的方法提纯***病毒，并使用超速离心对146S抗原进行定量，根据定量的结果对病毒液稀释后做成146S的抗原含量为1μg/mL～10μg/mL成品疫苗，该疫苗可产生良好的免疫效果。用蔗糖密度梯度离心测量法对146S抗原定量是一种标准的方法，但是操作较为复杂，仪器设备要求较高，不能进行批量的抗原检测，此外，还可以用蛋白层析分析法、荧光定量PCR和间接夹心Elisa等进行疫苗中抗原含量的定量。

自PCR技术问世以来，国内外的研究者开始用该方法来检测动物不同组织中的FMDV，使检测的过程大大缩短，准确性进一步提高。Taqman探针荧光PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，该技术在原理上较SYBR GREENⅠ更为严格，所得数据更为准确。国内外已经有使用荧光RT-PCR检测FMDV的报道，该技术以其特异性强、灵敏度高、速度快等优点在FMDV定性和定量检测等方面得到广泛应用，并且已经成为当前FMDV快速检测的主要方法。

由于***O型、亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗以及O型、亚洲Ⅰ和A型三价灭活苗含有不同型的***抗原，而蔗糖密度梯度离心测量法只能定量疫苗中各血清型146S抗原的总体含量，而不能很好的将O型、亚洲Ⅰ型和A型抗原的含量相区分，为了进一步明确成品疫苗中各型抗原的实际含量情况，需要在现有工作的基础上，建立一种破乳后水相抗原分型定量的方法，从而完善***双价以及多价成品疫苗效力评价标准。

发明内容

本发明的目的是提供鉴别和定量***双价苗以及多价苗中抗原的血清型的一种方法，以克服现有技术不足，实现破乳后水相抗原分型定量，从而完善***双价以及多价成品疫苗效力评价标准。

本发明提供的鉴别和定量***双价苗以及多价苗中抗原的血清型的一种方法，通过样品处理提取疫苗破乳后水相中***病毒RNA，应用荧光定量PCR检测方法来扩增样品中不同血清型的***病毒RNA，进行鉴别和定量检测，其中，O型***病毒引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：1~3所示，AsiaI型***病毒引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：4~6所示，A型***病毒引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：7~9所示。

优选地，所有探针5’端标记的荧光基团都为FAM，3’端淬灭基团都为TAMAR。

优选地，以所述***病毒RNA为模版，在3个PCR反应管中分别加入不同型特异性引物和探针，进行RT-PCR扩增。

可以使用TAKARA公司的一步法RT-PCR试剂盒进行扩增；

提取所述***病毒RNA可以包括以下步骤：

（1）取100体积份ISA206佐剂乳化的***疫苗，放入分液漏斗中，加入10～12体积份分析纯正戊醇，充分振荡1分钟以上混匀；

（2）将分液漏斗放入4°C冰箱，静置30分钟以上，可见油、水分离；分离出下层水相，其中含有***抗原；

（3）取水相，使用Invitrogen公司的TRIzol试剂盒提取RNA。

优选地，所述实时荧光定量RT-PCR反应体系为25μL，每条特异性引物和特异性探针终浓度为0.2μmol/μL；

优选地，O型和A型***病毒实时荧光定量RT-PCR反应条件为，42℃反转录10min，94℃预变性2min，94℃变性5s，55℃退火30s，40个循环。

优选地，AasiI型***病毒实时荧光定量RT-PCR反应条件为，42℃反转录10min，94℃预变性2min，94℃变性5s，65℃退火30s，40个循环。

优选地，进行荧光定量PCR时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为定量标准质粒，阴性对照为灭菌水，若CT值小于35.0，且出现典型的S型扩增曲线，则判定为阳性结果；若CT值在35.0～40.0之间，则判定为可疑结果，重复检测一次，若仍在此范围内，则判定为阴性，若无扩增信号，则判定为阴性结果。

优选的计算公式如下：

O型定量PCR计算公式为：Y=10^{(-3.24x+44.82)}；

A型定量PCR计算公式为：Y=10^{(-3.82x+53.35)}；

AsiaI型定量PCR计算公式为：Y=10^{(-3.94x+54.26)}；

Y：样品中抗原拷贝数X：样品扩增CT值。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：与蔗糖密度梯度离心测量法相比，本发明的方法具有灵敏性高、稳定性高、特异性好、可以分别准确定量样品中不同型的抗原等特点；本发明的方法可以同时进行大量样品的检测，具有高通量性；与蔗糖密度梯度离心测量法相比，本发明的方法无需大型贵重的离心设备，节省了人力和物力；本检测方法具有检测范围广的特点，在100～10¹⁰拷贝范围内具有良好的线性关系，检测范围可以达到10个数量级。

附图说明

图1O型荧光定量PCR标准曲线；

图2AsiaI型荧光定量PCR标准曲线；

图3A型荧光定量PCR标准曲线；

图4O型荧光定量PCR特异性分析；

图5AsiaI型荧光定量PCR特异性分析；

图6A型荧光定量PCR特异性分析。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式做进一步说明。其中一种实施方式包括如下步骤：

步骤一，检索Genbank上的***病毒基因序列，用生物信息学的方法，经过比对分析，分别找到O型、亚洲Ⅰ和A型的特异性保守区，以保守区为靶目标，用引物设计软件PrimerExpress2.0，设计不同型的特异性引物和探针，扩增基因片段；

步骤二，利用步骤一所得基因片段构建重组质粒；

步骤三，疫苗样品处理和提取样品的RNA；

步骤四，按照常规荧光定量PCR检测方法检测疫苗样品中的抗原含量。

步骤一和步骤四中，扩增时所使用的引物和探针为：

（1）O型***病毒引物和探针

上游引物（SEQ ID NO：1）：5’-AACCCTCGGACGAACATGAC-3’

下游引物（SEQ ID NO：2）：5’-CGATGTTGGCGTACACCTTGAT-3’

探针（SEQ ID NO：3）：FAM-5'-TACGACCAGTACAAGGTWCACAA-3'-TAMAR

（2）AsiaI型***病毒引物和探针

上游引物（SEQ ID NO：4）：5’-CTGCCCACTTCCTTCAACTACG-3’

下游引物（SEQ IDNO：5）：5’-AGTATGTTTCCGCACGCTTCA-3’

探针（SEQ ID NO：6）：FAM-5'-TGAAGGCCGACACCATCACGGAGCT-3'-TAMAR

（3）A型***病毒引物和探针

上游引物（SEQ ID NO：7）：5’-CTTCAACTACGGCGCGATTC-3’

下游引物（SEQ ID NO：8）：5’-AGAGCTCGGCACGCTTCATG-3’

探针（SEQ ID NO：9）：FAM-5'-GCCACGGAGATCCAAGAGCTCCTC-3'-TAMAR

步骤二中，所述重组质粒使用的载体是pGEM-Teasy。

步骤三中，所述的RNA提取方法是使用Invitrogen公司的TRIzol试剂提取,操作步骤按试剂盒说明书进行。

步骤四中，所述荧光定量PCR检测方法中，O型和A型***病毒实时荧光定量RT-PCR反应条件为，42℃反转录10min，94℃预变性2min，94℃变性5s，55℃退火30s，40个循环;AsiaI型***病毒实时荧光定量RT-PCR反应条件为，42℃反转录10min，94℃预变性2min，94℃变性5s，65℃退火30s，40个循环。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

步骤一，设计引物和Taqman探针

检索Genbank上的***病毒基因序列，用生物信息学的方法，经过比对分析，分别找到O型、亚洲Ⅰ和A型的特异性保守区，以保守区为靶目标，用引物设计软件PrimerExpress2.0，设计不同型的特异性引物和探针；探针5′端荧光报告基团是FAM，3′端的荧光淬灭基团为TAMRA。序列如下：

（1）O型***病毒引物和探针

上游引物（SEQ ID NO：1）：5’-AACCCTCGGACGAACATGAC-3’

下游引物（SEQ ID NO：2）：5’-CGATGTTGGCGTACACCTTGAT-3’

探针（SEQ ID NO：3）：FAM-5'-TACGACCAGTACAAGGTWCACAA-3'-TAMAR

（2）AsiaI型***病毒引物和探针

上游引物（SEQ ID NO：4）：5’-CTGCCCACTTCCTTCAACTACG-3’

下游引物（SEQ IDNO：5）：5’-AGTATGTTTCCGCACGCTTCA-3’

探针（SEQ ID NO：6）：FAM-5'-TGAAGGCCGACACCATCACGGAGCT-3′-TAMAR

（3）A型***病毒引物和探针

上游引物（SEQ ID NO：7）：5’-CTTCAACTACGGCGCGATTC-3’

下游引物（SEQ ID NO：8）：5’-AGAGCTCGGCACGCTTCATG-3’

探针（SEQ ID NO：9）：FAM-5'-GCCACGGAGATCCAAGAGCTCCTC-3′-TAMAR

步骤二，定量标准质粒的构建与制备

定量标准质粒的构建

以提取的***病毒RNA（O型、A型和AsiaI型三种血清型）为模板，分别应用O型、A型和AsiaI型特异性引物和TAKARA公司的一步法RT-PCR试剂盒进行扩增，RT-PCR反应体系为25μL，每条特异性引物终浓度为0.2μmol/L，模板4μL；反应条件为42℃,10min，94℃2min，94℃5s，55℃30s，40个循环。PCR反应结束后，取20μLPCR产物于2%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。PCR产物经电泳鉴定后，通过胶回收纯化目的片段，然后将目的片段与pGEM-Teasy载体连接，将其转化JM109感受态细胞，进行测序验证。

定量标准质粒的制备

定量重组标准质粒用碱裂解法进行提纯，根据紫外分光光度计测定OD260和OD280值计算质粒浓度，并换算为质粒拷贝数。

质粒浓度（μg/μL）=OD260×稀释倍数×50/1000；

质粒拷贝数=质粒浓度×6.02×10²³mol/1000M，M：代表质粒分子量；

步骤三，疫苗样品的处理以及病毒RNA的提取

疫苗样品破乳处理：取100ml ISA206佐剂乳化的商品牛***（O型、A型和AsiaI型）三价疫苗，放入250ml分液漏斗中，加入10～12ml分析纯正戊醇，充分振荡1分钟以上混匀；将分液漏斗放入4°C冰箱，静置30分钟以上，可见油、水分离；分离出下层水相约34ml，其中含有***抗原。

抗原水相中***病毒RNA的提取：取200μL抗原水相，使用Invitrogen公司的TRIzol试剂提取RNA,操作步骤按试剂盒说明书进行；

步骤四，荧光定量PCR方法的建立和优化

（1）荧光定量PCR反应条件的优化

通过对反应体系中不同的引物浓度、Taqman探针浓度、反应条件中不同的退火温度等试验结果进行比较，最后选择反应灵敏度高、本底荧光信号低、具有典型S型扩增荧光信号曲线、扩增效率接近于1的最佳反应体系。

O型***病毒定量PCR最佳反应体系和反应条件为：

反应条件采用一步法，42℃反转录10min，94℃预变性2min，94℃变性5s，55℃退火30s，40个循环。

经优化后确定的25μL最佳反应体系为：

AsiaI型***病毒定量PCR最佳反应体系和反应条件为：

反应条件采用一步法，42℃反转录10min，94℃预变性2min，94℃变性5s，65℃退火30s，40个循环。

经优化后确定的25μL最佳反应体系为：

A型***病毒定量PCR最佳反应体系和反应条件为：

反应条件采用一步法，42℃反转录10min，94℃预变性2min，94℃变性5s，55℃退火30s，40个循环。

经优化后确定的25μL最佳反应体系为：

（2）荧光定量PCR标准曲线的建立

用RNase dH₂O将三种血清型的定量标准质粒稀释至1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³copies/μL，分别用最佳体系和最佳反应条件进行扩增反应，检测结束后荧光PCR仪自动绘制标准曲线（图1、图2、图3）。

（3）特异性分析

以O型、A型和AsiaI型三种血清型***病毒RNA为模板，分别进行O型定量PCR、A型定量PCR、AsiaI型定量PCR特异性分析，反应按照最佳反应体系和条件进行。结果显示该检测体系特异性良好，非目标病毒核酸没有扩增曲线而目标病毒有良好的扩增曲线（图4、图5、图6）。

（4）稳定性分析

选取4个不同浓度的定量标准质粒，分别进行批间重复检测和批内重复检测，通过检测其CT值的变异系数进行稳定性的评价，变异系数在1%范围内认为是可靠的，结果显示批内和批间变异系数均小于1%，所以可以判断本检测方法稳定性良好。

（5）结果判定及病毒的定量

进行荧光定量PCR时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为定量标准质粒，阴性对照为灭菌水，若CT值小于35.0，且出现典型的S型扩增曲线，则判定为阳性结果；若CT值在35.0～40.0之间，则判定为可疑结果，重复检测一次，若仍在此范围内，则判定为阴性。若无扩增信号，则判定为阴性结果；

样品病毒定量，根据建立的定量标准曲线计算其病毒含量。

O型定量PCR计算公式为：Y=10^{(-3.24x+44.82)}；

A型定量PCR计算公式为：Y=10^{(-3.82x+53.35)}；

AsiaI型定量PCR计算公式为：Y=10^{(-3.94x+54.26)}；

Y：样品中抗原拷贝数X：样品扩增CT值。

通过计算公式可以得出疫苗样品中O型抗原含量为2.53×10¹³个拷贝/ml，A型抗原含量为5.68×10¹²个拷贝/ml，AsiaI型抗原含量为1.26×10¹³个拷贝/ml。

Claims (10)

1.鉴别和定量***双价苗以及多价苗中抗原的血清型的一种方法，其特征在于，通过样品处理提取疫苗破乳后水相中***病毒RNA，应用荧光定量PCR检测方法来扩增样品中不同血清型的***病毒RNA，进行鉴别和定量检测，其中，O型***病毒引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：1~3所示，AsiaI型***病毒引物和探针的序列分别如SEQ IDNO：4~6所示，A型***病毒引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：7~9所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所有探针5’端标记的荧光基团都为FAM，3’端淬灭基团都为TAMAR。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR检测方法为：以所述***病毒RNA为模版，在3个PCR反应管中分别加入不同型特异性引物和探针，进行RT-PCR扩增。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，使用TAKARA公司的一步法RT-PCR试剂盒进行扩增。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，提取所述***病毒RNA包括以下步骤：

（1）取100体积份ISA206佐剂乳化的***疫苗，放入分液漏斗中，加入10～12体积份分析纯正戊醇，充分振荡1分钟以上混匀；

（2）将分液漏斗放入4°C冰箱，静置30分钟以上，可见油、水分离；分离出下层水相，其中含有***抗原；

（3）取水相，使用Invitrogen公司的TRIzol试剂盒提取RNA。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述实时荧光定量RT-PCR反应体系为25μL，每条特异性引物和特异性探针终浓度为0.2μmol/μL。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：O型和A型***病毒实时荧光定量RT-PCR反应条件为，42℃反转录10min，94℃预变性2min，94℃变性5s，55℃退火30s，40个循环。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：AasiI型***病毒实时荧光定量RT-PCR反应条件为，42℃反转录10min，94℃预变性2min，94℃变性5s，65℃退火30s，40个循环。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：进行荧光定量PCR时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为定量标准质粒，阴性对照为灭菌水，若CT值小于35.0，且出现典型的S型扩增曲线，则判定为阳性结果；若CT值在35.0～40.0之间，则判定为可疑结果，重复检测一次，若仍在此范围内，则判定为阴性，若无扩增信号，则判定为阴性结果。

10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

O型定量PCR计算公式为：Y=10^{(-3.24x+44.82)}；

A型定量PCR计算公式为：Y=10(^{-3.82x+53.35)}；

AsiaI型定量PCR计算公式为：Y=10^{(-3.94x+54.26)}；

Y：样品中抗原拷贝数X：样品扩增CT值。

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