CN103079580A - 抑制分离自受腹绞痛影响的婴儿的产气性大肠菌类细菌的乳杆菌的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含两种益生菌菌株的组合物,所述益生菌菌株能够针对分离自受腹绞痛影响的婴儿的大肠菌类细菌的物种起到抗氧化性和/或抗细菌性作用以及竞争性作用,所述大肠菌类细菌通过糖、特别是乳糖的发酵而产生气体。
Description
本发明涉及能够抑制分离自受腹绞痛(colic)影响的产气性大肠菌类细菌(coliformbacteria)的益生菌菌株。此外,本发明涉及包含所述细菌菌株的食物组合物或补充剂或药物组合物,其用于对肠道疾病和婴儿/幼儿中的腹绞痛的预防性和/或治疗性治疗。
众所周知,婴儿期腹绞痛代表了婴儿生命的前三个月的最频发病症之一。同样已知,婴儿期腹绞痛的病源学尚未完全清楚并有可能出于多种因素。
在过去数年间,越来越多的数据指出在腹绞痛的发病机制中涉及肠道细菌群。近期实验研究似乎表明,幼儿的微生物环境受腹绞痛影响所致的改变可能导致肠运动功能的失调和气体产生的增加,后者由过度气胀导致,代表了所述病症的经典症状之一。
最后,已知与健康婴儿相比,受腹绞痛影响的婴儿更频繁地受到作为产气性微生物的艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)的定殖。
目前,聚二甲硅氧烷是最常指示用于腹绞痛的治疗。聚二甲硅氧烷被推荐用于腹绞痛治疗,不过有研究倾向于驳斥其相对于安慰剂在患腹绞痛的婴儿/幼儿中的体内实际有效性(Metcalf TJ等,Simethicone in the Treatment of Infant Colic:A Randomized,Placebo-Controlled,Multicenter Trial.1994,Pediatrics.94(1):29-34;Sferra TJ等,Gastrointestinal gas formation and infantile colic.1996,Pediatr Clin North Am.43(2):489-510)。
因此,仍然存在对有效、无副作用且易于应用的用于婴儿中的胃肠道病症和腹绞痛的预防性和/或治疗性治疗的需要。
申请人着手于解决与婴儿/幼儿的胃肠道病症的预防性和/或治疗性治疗相关的问题。具体而言,申请人解决了与婴儿/幼儿的腹绞痛的预防性和/或治疗性治疗相关的问题。
在深入研究之后,申请人选择了属于德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruekii)物种的特定益生菌菌株。
本发明的目的是选自包含属于德氏乳杆菌物种的细菌菌株的组的益生菌菌株。
下文在以下具体描述中对本发明的优选实施方式进行了说明,但这并非是在任何方面对本发明的范围的限制。
表1涉及显示于板上的德氏乳杆菌MB386DSM22106对于分离自患有腹绞痛的婴儿的大肠菌类的拮抗活性。对病原体生长的抑制以抑制晕圈的半径来表示,所述抑制晕圈在浸渍有所选定乳杆菌的全细胞的圆纸片(discs)上显现。
表2涉及对受腹绞痛影响的20个婴儿在表现该病症期间的粪便样品中的总大肠菌类的定量。
(*)通过对已在MacConkey琼脂板上生长的菌落进行计数来确定大肠菌类的总数,而使用物种特异性PCR指纹图谱法和通过核糖分型来确定物种的浓度。
所选的益生菌菌株充当对大肠菌类细菌增殖的抑制剂。
优选地,所述大肠菌类细菌选自包含通过糖、优选乳糖的发酵而产生气体的大肠菌类细菌的组。
所选的益生菌菌株具有已经证实的针对分离自受腹绞痛影响的婴儿的以下物种的抗细菌和/或抗微生物活性(抑制活性):大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)以及粪肠球菌(Enterococcus faecalis),且这些细菌属于参与乳糖发酵和肠道气体产生的大肠菌类细菌的种属,而肠道气体产生被认为是婴儿期腹绞痛的病症中的主要伴随原因。
具体地,所述大肠菌类细菌选自包含大肠杆菌细菌的组。
在一个优选实施方式中,益生菌菌株是德氏乳杆菌MB386,该菌株于2008年12月10日由意大利佛罗伦萨的Steve Jones Srl公司保藏于DSMZ且保藏号为DSM22106。
德氏乳杆菌MB386DSM22106菌株具有针对分离自受腹绞痛影响的婴儿的大肠菌类细菌的有效抗细菌和/或抗微生物活性。
本发明的另一目的是包含至少一种属于如上所述的德氏乳杆菌物种的益生菌菌株的食物组合物或补充剂。
本发明的再一目的是用作医药的包含至少一种属于如上所述的德氏乳杆菌物种的益生菌菌株的组合物。
本发明的所有上述组合物均可应用于预防性和/或治疗性治疗与腹泻、腹绞痛、积滞和胃酸过多、肠易激综合征、气胀、消化性溃疡、胃溃疡或十二指肠溃疡、消化不良、克罗恩病、腹部损伤和胆道疾病有关的病症或病理。
在一个优选实施方式中,本发明的所有上述组合物均可应用于预防性和/或治疗性治疗受胃肠道病症、腹绞痛和气胀影响的受试对象、特别是婴儿/幼儿。
在一个优选实施方式中,本发明的所有上述组合物还包含至少一种具有抗氧化性的其它细菌菌株,其选自包含属于植物乳杆菌物种的细菌菌株的组;所述菌株优选为植物乳杆菌LP1,该菌株于2008年12月10日由意大利佛罗伦萨的Steve Jones Srl公司保藏于DSMZ且保藏号为DSM22107。
植物乳杆菌LP1DSM22107菌株具有抗氧化性。植物乳杆菌LP1DSM22107菌株是益生菌菌株,因为其在体外测试时在胃液和胆汁中显示出抗氧化剂活性以及优异的活力,这表明其对肠道运输耐受。
所有上述组合物均可有效预防细菌感染和克制胃肠道症状和病症、腹绞痛和气胀。
在本发明的一个实施方式中,所述食物组合物或补充剂或药物组合物可以包含处于微胶囊化形式(即,涂布有含有至少一种脂质(脂质组合物)、优选植物来源的脂质的组合物)的本发明的上述细菌菌株。
作为另一选择,所述食物组合物或补充剂或药物组合物可以包含本发明的上述菌株作为微胶囊化细菌和非微胶囊化细菌。
所述脂质组合物包含至少一种脂质,且所述至少一种脂质为植物来源。
有利的是,所述植物来源的脂质选自包含饱和脂肪的组。
有利的是,使用熔点低于75℃、优选为45℃~65℃的饱和脂肪。
在一个优选实施方式中,所述饱和脂肪选自包含饱和脂肪酸的单甘油酯和二甘油酯、用饱和脂肪酸酯化的聚甘油以及游离的饱和脂肪酸的组。优选地是,所述饱和脂肪选自二硬脂酸聚甘油酯、棕榈酸硬脂酸甘油酯、非月桂酸类来源的氢化植物油脂。
在第一实施方式中,本发明的上述细菌菌株被单层涂布。
就实际而言,实现了采用单一脂质的单涂层。有利的是,所述单涂层基于二硬脂酸聚甘油酯(商品名Plurol Stearique WL1009)。
将上述单层涂布的本发明的细菌菌株置于本发明的食物组合物或补充剂或药物组合物中。
在第二实施方式中,本发明的上述菌株被双层涂布。
就实际而言,通过相继采用彼此不同的两种脂质实现双涂层。
有利的是,所选的两种脂质为氢化棕榈油脂(Tm=60℃)和二棕榈酸硬脂酸甘油酯(Tm=57℃~60℃);其被相继喷涂在冻干物(lyophilate)上,即对该冻干物施加双层涂覆:第一层采用氢化棕榈油脂(例如用Revel C)而第二层用二棕榈酸硬脂酸甘油酯(例如Precirol Ato5),彼此的重量比为3:1,有利的是2:1,例如2/3重量的第一层和1/3重量的第二层。相对于组合物或补充剂的总重,上述细菌物种的存在量为0.1重量%~75重量%,优选为0.5重量%~15重量%;甚至更优选为1重量%~10重量%。然而,所述相对于组合物的总重的百分比取决于组合物或补充剂的产品类型。
在一个优选实施方式中,组合物或补充剂含有经涂布和/或未经涂布的细菌,其浓度为1×106CFU/g~1×1011CFU/g,优选为1×108CFU/g~1×1010CFU/g。
在一个优选实施方式中,组合物或补充剂包含浓度为1×106CFU/剂~1×1011CFU/剂、优选为1×108CFU/剂~1×1010CFU/剂的细菌。剂量可以为0.2g~10g;例如,其可以为0.25g、1g、3g、5g或7g。
本发明中所用的益生菌可以为固体形式,特别是粉末、脱水粉末、喷干粉末或冻干粉末的形式。所述益生菌可以经涂布和/或未经涂布。所述益生菌,优选为微胶囊化形式(经涂布),可以使用本领域技术人员公知的技术并且利用药物工业已知且可利用的机器来进行微胶囊化。例如,可以使用流化床技术(例如,顶喷或底喷),其中使用具有脂质性质的涂布材料。在微胶囊化期间,对生产过程的热控制很重要。具体而言,重要的是控制所用脂质的温度以避免所用菌株的死亡。
在一个优选实施方式中,组合物或补充剂处于包含以下物质的油性悬浮液的形式:
—选自包含以下物质的组的至少一种食物油:橄榄油、玉米油、大豆油、亚麻籽油、花生油、芝麻油、鱼油和米糠油,所述至少一种油相对于所述悬浮液的总重以大于或等于70重量%的量存在,和
—选自包含属于物种德氏乳杆菌和植物乳杆菌的细菌菌株的组的至少一种益生菌菌株,所述菌株相对于所述悬浮液的总重以小于或等于30重量%的量存在。
在一个优选实施方式中,所述悬浮液的油仅为橄榄油;优选为与玉米油和/或大豆油和/或亚麻籽油混合的橄榄油。
在一个优选实施方式中,所述油性悬浮液还可以包含相对于该悬浮物的总重其量为0.1重量%~15重量%的至少一种经精细细分的食物化合物,该化合物选自包含氧化硅、二氧化硅、硅胶、胶体氧化硅、沉淀氧化硅、滑石、硅酸镁、氧化镁、碳酸镁、硅酸钙、卵磷脂、单甘油酯或二甘油酯(如单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯)、PlurolOleique酸、淀粉、改性淀粉、魔芋胶、黄原胶、结冷胶和卡拉胶。
在一个优选实施方式中,所述油性悬浮液还可以包含相对于该悬浮液的总重其量为0.5重量%~25重量%的至少一种益生元纤维(prebiotic fibre)和/或双岐糖类(bifidogenic carbohydrate),所述益生元纤维和/或双岐糖类选自菊粉、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖和低聚反式半乳糖(transgalacto-oligosaccharide)(GOS和TOS)、低聚葡萄糖(GOSα)、低聚木糖(XOS)、壳寡糖(COS)、大豆低聚糖(SOS)、低聚异麦芽糖(IMOS)、麦芽糊精、抗性淀粉、果胶、欧车前、***半乳聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、木糖胶、乳蔗糖(lactosaccharose)、乳果糖、乳糖醇、***胶纤维、卡鲁巴纤维(carrubafibre)、橡树纤维、竹纤维和柑橘纤维。
在一个优选实施方式中,所述优选悬浮液包含至少一种纤维和选自低聚葡萄糖(GOSα)、低聚果糖(FOS)、菊粉和/或麦芽糊精的至少一种糖类。
在一个优选实施方式中,所述油性悬浮液包含经单涂层(或以双涂层)涂布的德氏乳杆菌MB386DSM22106和植物乳杆菌LP1DSMZ22107,所述涂层具有如上所述的熔点的至少一种脂质,所述熔点低于75℃、优选为45℃~65℃。
本发明的油性悬浮液根据本领域技术人员公知的技术且利用已知机器来制备。
就实际而言,将给定量的油引入设置有搅拌和加热装置的容器中。随后在搅拌下逐渐加入固体形式的益生菌,以避免形成团块和聚结。一旦益生菌的添加结束,将油性物质在搅拌下保持1至30分钟,必要时轻微加热至24℃~40℃、优选30℃~35℃的温度。
在本发明的一个优选实施方式中,益生菌可以以微胶囊化形式使用,即,涂布有含有至少一种脂质、优选植物来源的脂质的组合物。然后使用与上述相同的操作方法将微胶囊化细菌添加到油中。
在本发明的另一个优选实施方式中,加入油中的细菌可以为微胶囊化细菌的形式和“裸露”的、非微胶囊化的细菌的形式。
细菌,优选处于微胶囊化形式的细菌,可以使用本领域技术人员已知的普通技术来微胶囊化。例如,可以使用流化床技术(例如,顶喷或底喷),其中利用了具有脂质性质的涂布材料。
在一个优选实施方式中,使用熔点低于75℃、优选为45℃~65℃的饱和植物油脂。
在一个优选实施方式中,可以使用具有一定程度的亲水性的饱和植物油脂;这些油脂可以选自饱和脂肪酸的单甘油酯和二甘油酯、用饱和脂肪酸酯化的聚甘油和游离的饱和脂肪酸。
例如,可以使用二硬脂酸聚甘油酯(商品名Plurol Stearique WL1009)、棕榈酸硬脂酸甘油酯(商品名Precirol Ato5)、饱和脂肪酸(商品名Revel C)或非月桂酸类来源的氢化植物油脂。
在一个优选实施方式中,冻干的微生物与涂布其的脂质涂布材料的重量比为50:50或40:60。
在第一实施方式中,将两种脂质,氢化棕榈油脂(Tm=60℃)和二棕榈酸硬脂酸甘油酯(Tm=57℃~60℃),相继喷涂在冻干物上,即对该冻干物施以双层覆盖层:第一层是氢化棕榈油脂,第二层是二棕榈酸硬脂酸甘油酯,两者彼此的比例为3:1。对细胞的双涂层确保了将细菌更好地与环境密封隔开,从而产生不具有与外界连通的孔隙的连续膜。然而,这种包裹物必须在肠道水平打开,以释放细菌并使其能够定殖。所选的脂质实际上具有对酸性pH的抗性,从而该涂层在胃中保持完整无损,但对于即便微弱碱性的pH敏感,从而使得在运送通过肠道时在涂层中形成孔。
相对于油性悬浮液的总重,油性悬浮液包含量小于或等于30重量%、包括0.5重量%~20重量%的细菌;其量优选为0.5重量%~10重量%;相对于悬浮液的总重,其量进而更优选为1.5重量%~5重量%。
所述油性悬浮液具有用作治疗诸如儿科受试对象中的腹绞痛等肠道病症的药物的有效应用。
进行了评估产气性大肠菌类细菌在婴儿期腹绞痛的病源学中的作用的研究。
就实际而言,进行了随机化预期性研究,其中招募了受婴儿期腹绞痛影响的49名婴儿和35名健康婴儿;其年龄为相对于孕龄的20天至90天,仅用母乳喂养且没有胃肠***疾病。在预定时间从两组婴儿收集粪便样品并在接下来的48小时内检验。研究的目的在于确立就产气性大肠菌类的存在而言是否在两组婴儿中存在显著的定性/定量差异。
大肠菌类组中包含的典型种属有:柠檬酸细菌属、肠杆菌属、大肠杆菌、克雷伯菌属和其它次要菌属。使用PCR(聚合酶链式反应)和自动化核糖分型技术在分子水平进行对分离自粪便样品的最具代表性物种的鉴定。最后,检验了微生物菌落通过乳糖和其它糖的发酵而产生气体的能力。
对各种大肠菌类物种的分子和表型鉴定显示出在患有和未患腹绞痛的两组中的不同定殖模式,特别是大肠杆菌物种的浓度显示出在患腹绞痛的婴儿组中显著更高[(6.04Log10相比4.47Log10)CFUg-1粪便]。据信正是该大肠杆菌物种的异常浓度可能促进了该病症的发展。
无法排除的是,在我们研究中在受该病理影响的婴儿中观察到的大肠菌类物种的丰度可能与某些未鉴定出的其它对于宿主有益的细菌的物种的减少相关,其造成对宿主健康状态的可能影响。
实验部分
1.前言
申请人进行了旨在选择属于乳杆菌属的益生菌菌株的研究,就所述菌株针对分离自受腹绞痛影响的婴儿的大肠菌类细菌物种的抗氧化性、抗细菌性和抗微生物性作用的有效性进行选择和评估。
从受腹绞痛影响的婴儿粪便中分离出数十种通过糖、特别是乳糖的发酵而产生气体的大肠菌类细菌的菌株,以便在体外评估其生长受属于所考虑的乳杆菌属的益生菌菌株的抑制。
2.菌株的分离和培养条件
出于对大肠菌类的存在的定量和检验的目的,从仅用母乳喂养的49名受腹绞痛影响的婴儿收集粪便样品,该影响已在登记前的6±1天表现出来。在选择性MacConkey琼脂板(DIFCO n.0075.17.1)上进行菌株的分离,MacConkey琼脂是通常用于在将肠细菌(称为“大肠菌类”)置于理想生长条件(37℃,在受控气氛中)下之后对其进行分离和鉴定的培养基。
在温育12小时后,对出现在板上的菌落进行计数,并仔细观察菌落本身之间的形态学差异。数字结果以每克粪便的菌落形成单元(CFU)的Log10显示。然后单独取出每个分离的菌落并接种至一管LB(Luria-Bertani)液体培养基中以获得纯培养物。
3.大肠菌类菌落的鉴定
出于分离出最具代表性的大肠菌类种属的目的,对获自受腹绞痛影响的婴儿粪便的总共20种粪便培养物进行分析。
使用两种分子鉴定程序(引物特异性PCR和自动化核糖分型)实现了对菌落的物种特异性识别。结合通过两种方法得到的结果使得既能够以高精度鉴定出所分离的菌株也能够定义哪些物种是最具代表性的在受腹绞痛影响的婴儿肠内定殖的大肠菌类群体。
最后,通过计算在整个所分离的大肠菌类群体中每种细菌物种所代表的百分比来对所述每种细菌物种进行定量。
a.自动化核糖分型
自动化菌株特异性核糖分型涉及使用极为精密的仪器:RiboPrinter微生物表征***(Qualicon Inc.,Wilmington,DE,美国)。单独取出在板上分离的细菌菌落;在热步骤后并通过使用裂解酶,获得DNA的释放,该DNA通过限制性内切酶EcoR1被切割。最后,使用改进DNA印迹技术分析了通过凝胶电泳分离的DNA片段。将杂交分析翻译为分开的化学发光带的图像,仪器将其转化为电子数据或Riboprinter图并将其获取和储存在存储器中。通过将所获取的Riboprinter图与存储在仪器的Dupont数据库中的图进行比较来实现最终鉴定。将具有通过借助适当的算法算出的至少等于93%的相似性的图谱组合以形成动态Ribogroup,其反映所分离的菌落间的关系或遗传同一性。
b.引物特异性PCR
出于对大肠菌类细菌的分子鉴定的目的,对16S-23S内部转录的间隔区的核糖体DNA片段进行扩增。单独挑选在板上分离的纯菌落并将其在无菌蒸馏水中重悬浮,然后在95℃裂解5分钟以便使DNA能够释放。使用以下通用引物来获得扩增反应:16S-正向(5’–GCTGGATCACCTCCTTTC-3’)和23S-反向(5’–AGTGCCAAGGCATCCACC-3’)。
扩增反应在设定了特定的热循环程序的Biometra TGradient热循环仪(Biometra,Gottingen,德国)中进行。扩增物通过凝胶电泳分离;使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN,Hilden,德国)对约400bp的片段进行纯化;最后,将用16S和23S引物扩增的DNA片段送交自动化序列分析。
4.大肠菌类细菌的气体产生
评估了由所有分离的大肠菌类细菌介导的气体产生能力,所述评估通过将每个单独菌株接种在含有10g/L乳糖作为唯一碳源的液体LB培养液(broth)和/或十二烷基硫酸酯胰蛋白胨(LST)培养液中来进行。在接种后24小时至48小时并且在35℃温育后,根据Jiang T等51的方法对细菌培养物检验在液体培养基中的气泡的存在。气体的存在指示对于测试的阳性反应。
5.乳酸菌的随机选择和培养条件
其对于婴儿的大肠菌类细菌的抗微生物活性得到测试的乳酸菌(lactic bacteria)菌株是代表不同乳酸菌物种的30种随机选取的菌株。本研究中所用的乳杆菌来自ATCC和DSMZ保藏中心(分别为美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection),罗克维尔(Rockville),马里兰州(Md.)和德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismem und Zellkulturen),不伦瑞克(Braunschweig),德国)。
通过自动化核糖分型在物种水平证实了植物乳杆菌LP1菌株DSM22107的分类。通过筛选选择的菌株德氏乳杆菌MB386来自德国DSMZ保藏中心(DSM20074或ATCC9649)。
用在所考虑的研究中的所有乳杆菌都在37℃于含0.5g/L半胱氨酸作为还原剂的乳杆菌MRS培养液(Difco Laboratories,Sparks,Maryland,美国)(MRS)中培养24小时。
6.评估抗微生物性质的测试
使用两种策略评估了抗微生物性质:板上细菌生长的抑制或Kirby-Bauer圆纸片扩散法(disc diffusion method)(1940),和所选乳酸菌与源自受腹绞痛影响的婴儿的一种或多种大肠菌类细菌的共同培养物的制备。
a)板上抗微生物活性
该方法的目的在于检验所考虑的乳杆菌菌株对分离自婴儿的大肠菌类细菌的体外生长的抑制性效果。使乳杆菌菌株于37℃在MRS液体培养基中的无氧培养物中生长48小时。将通过离心从所述培养物收集的细胞在盐水溶液中重悬浮,直到获得104细胞/ml和106细胞/ml的浓度,该浓度通过测定在600nm处的光密度而确定。将分离自上述生物质的上清液中和至pH7.0。将含有浓度为103细胞/ml和106细胞/ml的所考虑的大肠菌类细菌的细胞悬浮液分配在LB(Luria Bertani)琼脂(0.7%)固体培养基上;随后,将两个圆纸片(直径6mm)置于培养基上,其中一个浸渍有所考虑的乳杆菌的细胞悬浮液而另一个浸渍有与之相关的上清液。以相同方式制备对照,但通过将两个未经浸渍的无菌圆纸片置于培养基上来进行。
在37℃培养18小时后,测定了出现在圆纸片周围的抑制假病原体(pseudopathogen)的区域。
b)液体共培养物中的抗微生物活性
通过如下证实由本研究中所考虑的乳杆菌所发挥的针对大肠菌类细菌生长的拮抗作用:在液体培养基中用最具代表性的分离自婴儿的大肠菌类与每种潜在的益生菌抑制剂共同温育。通过将益生菌和大肠菌类在最佳条件下分别培养来获得共培养物的接种物。通过离心收集来自两种培养物的每一种的细菌细胞,并将其重悬浮在新鲜的等同培养基中以避免在共培养物中因不希望的pH改变或营养素的减少而可能发生的对生长的任何调节作用。用总共105CFU/ml的乳杆菌和相同浓度的已知大肠菌类细菌悬浮液接种改性LB培养液(添加有3%的酵母菌提取物的Luria Bertani,pH7)的液体培养基。以相同方式制备对照,仅用没有任何细胞的新鲜培养基替代益生菌接种物。
将由此制备的共培养物和对照在37℃在受控的微需氧条件下温育,在8至10小时后通过确定大肠菌类细菌生长所受抑制来评估益生菌所发挥的拮抗活性。这通过从来自仅用大肠菌类细菌接种的对照试管的大肠菌类细菌的数目减去共培养物试管中所见的大肠菌类细菌的数目来计算。通过将已知等分试样的共培养物和对照分布于对乳杆菌(Lactobacilli MRS琼脂)和大肠菌类(MacConkey琼脂)均具有选择性的培养基上(Annuk2003)来测定已生长的活细菌群体的CFU/ml;最后,确定了在共温育24小时后的pH变化。与乳杆菌和大肠菌类的细菌浓度相关的结果以Log10CFU/ml表示。
仅出于说明性目的提供以下实施例,并非意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
将所选择的德氏乳杆菌MB386DSM22106菌株在37℃在液体培养基中无氧培养48小时。对分离自表现出婴儿期腹绞痛的临床诊断症状的15号婴儿的大肠菌类细菌大肠杆菌菌株a(参见表2)的过夜培养物进行如前述测试中的处理以便分析板上抗微生物活性。将具有浓度为103细胞/ml~106细胞/ml的大肠菌类细菌的悬浮液分布于固体LB培养基上;随后,将两个圆纸片置于培养基上,一个圆纸片(圆纸片B,图1)浸渍有所收集的德氏乳杆菌MB386DSM22106细胞的悬浮液而另一个浸渍有对应的经中和的上清液(圆纸片A,图1)。
使由此制备的板在4℃静置至少1小时。在37℃温育18小时后,对在两个圆纸片周围已发展出的抑制大肠杆菌菌株a的生长的区域进行测定。
结果:仅在浸渍有德氏乳杆菌MB386DSM22106细胞悬浮液的圆纸片周围可见到对抑制所检验的分离自受婴儿期腹绞痛影响的15号婴儿的大肠杆菌菌株的生长的晕圈,然而在浸渍有所述乳杆菌的对应上清液的圆纸片周围没有出现抑制区域。对抑制大肠菌类细菌生长的晕圈进行测定,其显示出具有13mm的半径(图1)。
实施例2
对于由益生性乳杆菌(德氏乳杆菌MB386DSM22106)针对分离自受婴儿期腹绞痛影响的12号婴儿的肺炎克雷伯菌菌株b所表现的抗微生物活性进行评估。出于测试目的,如实施例1所述对两种细菌菌株进行处理。
结果:对抑制分离自患婴儿期腹绞痛的12号婴儿的肺炎克雷伯菌菌株b的生长的区域进行测定,该抑制区域出现在用德氏乳杆菌MB386DSM22106细菌悬浮液浸渍的圆纸片周围。在本情形中同样地,仅用缺乏源自乳杆菌培养物的细胞的上清液浸渍的圆纸片不产生拮抗活性。据测定抑制晕圈具有12.5mm的半径,如图2中可见。
实施例3
对于由益生性乳杆菌(德氏乳杆菌MB386DSM22106)针对分离自受婴儿期腹绞痛影响的婴儿和来自健康对照的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌以及粪肠球菌的所有菌株所表现的抗微生物活性进行评估。
出于测试目的,如实施例1所述对乳酸菌的益生菌菌株和分离自婴儿的大肠菌类细菌进行处理。
结果:一般而言,所检验的德氏乳杆菌MB386DSM22106总是显示出针对所有受测大肠菌类的抑制活性。通过将两个既未浸渍有细胞悬浮液也未仅浸渍有培养液的相似无菌圆纸片置于LB琼脂培养基上来制备对照板。对照从未显示出对于所检验的大肠菌类菌株的生长的任何抑制效果。在表1中报道了获自为评估由所考虑的乳杆菌在板上表现的拮抗活性而进行的测试的所有结果,将其表示为抑制区域的平均半径。
实施例4
也对由所选择的益生性乳杆菌(植物乳杆菌LP1DSM22107)针对分离自受婴儿期腹绞痛影响的婴儿和来自健康对照的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌以及粪肠球菌的所有菌株所表现的抗微生物活性进行评估。出于测试目的,如实施例1所述对乳酸菌的益生菌菌株和分离自婴儿的大肠菌类细菌进行处理。
结果:一般而言,所检验的植物乳杆菌LP1菌株DSM22107从未显示出对于所检验的大肠菌类的任何抑制效果。
实施例5
对由本发明的两种益生性乳酸菌菌株(德氏乳杆菌MB386DSM22106和植物乳杆菌LP1DSM22107)针对分离自受婴儿期腹绞痛影响的婴儿的所有经分离的大肠菌类细菌菌株:大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌以及粪肠球菌所共同表现的抗微生物活性进行评估。出于测试目的,如实施例1所述将两种益生性乳酸菌菌株分别培养,并类似地如实施例1所述对每种大肠菌类细菌进行处理。将具有浓度为103细胞/ml~106细胞/ml的大肠菌类细菌的悬浮液分布于固体LB培养基上。随后,将两个圆纸片置于培养基上,一个浸渍有具有已知浓度的德氏乳杆菌MB386DSM22106的收集细胞的悬浮液以及具有类似浓度的收集自植物乳杆菌DSM22107培养物的细胞的悬浮液,另一个浸渍有由两种经中和的上清液(源自两种乳酸菌的培养物,不含细胞)形成的混合物。使由此制备的板在4℃静置至少1小时。在37℃温育18小时后,对在两个圆纸片周围已发展出的抑制所考虑的大肠菌类的生长的区域(如果存在)进行测定。
结果:对于以协同方式作用的抗微生物活性的测试揭示,抑制分离自患腹绞痛的婴儿的每种大肠菌类菌株的生长的区域总是仅出现在已用德氏乳杆菌DSM22106和植物乳杆菌DSM22107的两种细胞悬浮液浸渍的圆纸片周围,然而在用对应的源自两种乳酸菌培养物的上清液浸渍的圆纸片周围没有出现抑制晕圈。最后,对源自全细胞的抑制晕圈进行测定,显示其具有与由德氏乳杆菌DSM22106表现的单一拮抗活性所产生的抑制晕圈相当的平均半径(表1)。
实施例6
如下评估德氏乳杆菌MB386DSM22106在体外的拮抗活性:用总共105CFU/ml的乳杆菌和相同浓度的大肠杆菌菌株a的细胞(分离自受腹绞痛影响的15号婴儿)接种改良LB培养基(此前已在涉及液体共培养物的抗微生物活性的评估方法的段落中描述)(表3)。仅用大肠菌类细菌的细胞接种含有改良LB的第二试管。将共培养物和对照在37℃在微需氧条件下温育,并在8小时至10小时后,评估由所述乳酸菌表现的针对大肠杆菌菌株的拮抗活性。
为了测定从共温育测试和从对照所产生的德氏乳杆菌MB386DSM22106和大肠杆菌菌株的生长,通过将来自共培养物和来自对照的培养液等分试样分布在含有0.2%万古霉素的MRS琼脂(对乳酸菌有选择性)以及MacConkey琼脂(对大肠杆菌有选择性)上,来在接种的时间0点和在24小时评估两种细菌菌株的CFU/ml;最后,确定了24小时后在共温育试管中和对照中的pH变化。
结果:在t0(接种时间),将2.7×105个德氏乳杆菌DSM22106细胞与5.0*105个大肠杆菌细胞共同接种。初始pH为6.8。24小时(t24)后,选择性板上的计数揭示出7.0×109CFU/ml的德氏乳杆菌DSM22106和5.0*105CFU/ml的大肠杆菌,同时pH降至4.3。在对照试管中,在t0仅接种4.5×105CFU/ml的大肠杆菌;通过仅添加相等体积的不含任何细胞的新鲜培养基来代替乳酸菌的接种。在温育24小时后,计数揭示出1.0×109CFU/ml的所接种大肠杆菌。培养基pH等于6.8,在24小时后保持不变。
实施例7
如同实施例5,但是在与每种所鉴定的分离自婴儿的物种的最具代表性大肠菌类菌株共同温育时,对由德氏乳杆菌MB386DSM22106和植物乳杆菌LP1DSM22107的两种菌株的组合所表达的抗微生物活性进行评估。
如下评估两种乳酸菌以“协同”方式作用的拮抗活性:用总共102CFU/ml的德氏乳杆菌DSMZ22106和102个植物乳杆菌DSMZ22107细胞以及相等浓度(104)的所考虑的大肠菌类细菌的细胞对改良LB培养基进行接种。对含有改良LB的第二试管仅用两种乳酸菌的细胞接种。将由此制备的共培养物和对照在37℃在微需氧条件下温育,并在8小时至10小时后评估所产生的拮抗活性(如果存在)。
为了测定由共温育测试和由对照产生的乳酸菌和大肠菌类的生长,如实施例5所述在接种的时间0点和24小时后对每种细菌的CFU/ml进行评估。
计算了乳酸菌的总CFU/ml以及所考虑的大肠菌类的CFU/ml;最后,确定了在24小时后共温育试管中和对照中的pH变化。
结果:与物种和其所分离自的婴儿无关的是,在与两种益生性乳杆菌的共培养时大肠菌类细菌的浓度与对照试管相比减少了至少4个十进位对数单位(从E109到E105)。pH总是在温育前和温育后24小时测定,其值在将试管以两种乳酸菌与大肠菌类细菌菌株共同温育时改变了至少3.3±0.4,然而对照试管中的pH总是保持不变。
由前述可见,德氏乳杆菌DSMZ22106菌株具有明确的针对分离自受腹绞痛影响的婴儿的以下物种的抗细菌活性:大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌以及粪肠球菌,这些菌种属于参与乳糖发酵和肠道气体产生的大肠菌类细菌的种属且据认为是婴儿期腹绞痛病症的主要伴随原因。
据认为,减少肠道大肠菌类细菌的浓度对于要保持人肠道微生物丛的稳定平衡至关重要,因此对人的健康状态有益。
表1
表2
(*)大肠菌类的总数是通过已在MacConkey琼脂板上生长的菌落进行计数来确定,而物种浓度使用物种特异性PCR指纹图谱法和通过核糖分型来确定。
Claims (15)
1.一种作为大肠菌类细菌抑制剂的益生菌菌株,所述益生菌菌株选自包含属于德氏乳杆菌物种的细菌菌株的组。
2.如权利要求1所述的益生菌菌株,其中所述大肠菌类细菌选自包含通过糖、优选乳糖的发酵而产生气体的大肠菌类的组。
3.如权利要求1或2所述的益生菌菌株,其中所述大肠菌类细菌选自包含属于以下物种的细菌的组:大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌和粪肠球菌。
4.如权利要求1~3中任一项所述的益生菌菌株,其中所述益生菌菌株是德氏乳杆菌MB386,该菌株于2008年12月10日保藏于DSMZ,保藏号为DSM22106。
5.如权利要求4所述的益生菌菌株,其中所述德氏乳杆菌MB386DSM22106具有针对属于以下物种的细菌的抗细菌活性:大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌和粪肠球菌。
6.一种食物组合物或补充剂或药物组合物,其包含至少一种权利要求1~5中任一项所述的细菌菌株。
7.如权利要求6所述的食物组合物或补充剂或药物组合物,其中还存在至少一种具有抗氧化性的其它细菌菌株;所述菌株优选为植物乳杆菌LP1,该菌株于2008年12月10日保藏于DSMZ,保藏号为DSM22107。
8.如权利要求6或7所述的组合物,所述组合物用于对受腹绞痛影响的受试对象的预防性和/或治疗性治疗。
9.如权利要求6~8中任一项所述的食物组合物或补充剂或药物组合物,其中所述德氏乳杆菌MB386(DSM22106)和所述植物乳杆菌LP1(DSM22107)涂布有包含至少一种脂质、优选植物来源的脂质的组合物,所述脂质选自包含熔点低于75℃、优选为45℃~65℃的饱和脂肪的组。
10.如权利要求9所述的食物组合物或补充剂或药物组合物,其中所述饱和脂肪选自饱和脂肪酸的单甘油酯和二甘油酯、用饱和脂肪酸酯化的聚甘油以及游离的饱和脂肪酸。
11.如权利要求10所述的食物组合物或补充剂或药物组合物,其中所述饱和脂肪选自二硬脂酸聚甘油酯、棕榈酸硬脂酸甘油酯、饱和脂肪酸或非月桂酸类来源的氢化植物油脂。
12.如权利要求6~11中任一项所述的食物组合物或补充剂或药物组合物,其中所述德氏乳杆菌MB386(DSM22106)和所述植物乳杆菌LP1(DSM22107)涂布有第一涂层和第二涂层,所述第一涂层为熔点约为60℃的氢化棕榈油脂,而所述第二涂层为熔点为57℃~60℃的二棕榈酸硬脂酸甘油酯。
13.如权利要求6~12中任一项所述的食物组合物或补充剂或药物组合物,其形式为包含以下物质的油性悬浮液:
—选自包含以下物质的组的至少一种食物油:橄榄油、玉米油、大豆油、亚麻籽油、花生油、芝麻油、鱼油和米糠油,所述至少一种油相对于所述悬浮液的总重以大于或等于70重量%的量存在,和
—选自包含属于德氏乳杆菌物种和植物乳杆菌物种的细菌菌株的组的至少一种益生菌菌株,所述菌株相对于所述悬浮液的总重以小于或等于30重量%的量存在。
14.如权利要求13所述的食物组合物或补充剂或药物组合物,其中所述悬浮液的所述油为橄榄油,优选为与玉米油和/或大豆油和/或亚麻籽油混合的橄榄油。
15.如权利要求13或14所述的食物组合物或补充剂或药物组合物,其中所述细菌菌株为益生菌德氏乳杆菌MB386(DSM22106)和植物乳杆菌LP1(DSM22107),如权利要求9至12中任一项所述将所述细菌涂布。
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