CN103076415B - 一种富集水产品中天然四环素类抗生素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富集水产品中天然四环素类抗生素的方法，涉及食品安全分析领域中样品预处理。本发明方法包括样品经0.1mol/L的乙二胺四乙酸钠/Mcllvaine提取缓冲液预处理、苯酚或苯甲酸修饰的聚苯乙烯超顺磁球吸附、洗脱收集等步骤。洗脱液可以直接上液相或液质联用进行分析，与水产品中四环素类抗生素传统样品前处理方法相比，大大简化了样品前处理的操作流程，缩短了样品前处理时间，减少了吸附剂使用量少，提高了样品中四环素类抗生素的提取得率。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全分析领域，具体是涉及一种以表面修饰有苯酚或苯甲酸功能团的聚苯乙烯磁球富集水产品中天然四环素类抗生素的磁分散固相萃取方法。
背景技术
四环素类抗生素（Tetracyclines, TCs）是由放线菌产生的一类广谱抗生素，分为天然品（金霉素、土霉素、四环素和强力霉素）与半合成品（多西环素、美它环素、米诺环素和胍哌四环素等）两类。四环素族的化学结构：
四环素、土霉素、金霉素及多西环素因其优良的抗菌性、稳定的药性及低廉的价格，广泛应用于水产养殖业中水产疾病的预防、治疗和促进生长。但该类药物的过量使用导致其在可食性动物组织中高浓度残留，直接影响食用者的健康，并导致人体内细菌耐药性增加。世界食品法典委员会和世界各国对水产品中四环素族抗生素残留均有严格的限量要求，国际贸易中也对其限量有严格规定。目前欧洲已禁止该类抗生素作为促生长抗生素应用，美国和日本仍在使用金霉素和土霉素季胺盐，我国仍大量使用土霉素钙盐。因此世界各国对TCs 残留的检测十分关注，我国和欧盟明确规定：牛奶和肌肉组织中 TCs总含量不得超过100 μg/kg，鸡蛋中TCs总含量不得超过200 μg/kg；美国食品药品监督管理局规定：TC、OTC（土霉素）、CTC（金霉素）在动物肌肉组织中总量不得超过2 μg/g，在牛奶中总量不得超过300 ng/g。
高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC），由于具有高效分离及高灵敏度的特点，被广泛用于动物源性食品中四环素类抗生素的分离检测。中华人民共和国国家标准（GB/T 21317-2007）使用HPLC法检测动物源性食品中四环素类兽药残留量，其土霉素、金霉素、四环素的方法检测限为50.0 μg/kg；中华人民共和国水产行业标准（SCT 3015-2002）用HPLC法检测水产品中四环素类抗生素残留量，检测限为：土霉素≤0.05 mg/kg，四环素≤0.05 mg/kg，金霉素≤0.1 mg/kg；中华人民共和国国家标准（GB/T 20764-2006）采用液相色谱-紫外检测法对可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量进行测定，该方法检出限可达0.005 mg/kg。目前仪器法检测水产品中四环素类抗生素残留，其样品前处理均采用固相萃取柱进行样品浓缩和净化，柱材料粒径一般为几十至几百微米、材料表面修饰了疏水以及部分亲水性基团。固相萃取柱材料装柱量一般为100至500 mg，过柱速度为每分钟1至3 mL。
发明内容
传统的水产品中四环素提取方法多采用液液萃取或固相萃取方法，总体存在提取时间长，溶剂用量大，在痕量药物残留时提取回收率偏低等缺陷。
本发明的目的是提供一种灵敏度高、简便和快速的水产品中天然四环素类抗生素的高效富集和净化的样品前处理新方法。包括如下步骤：
（1）在水产品（如鱼类、虾和蟹等）肌肉组织中加入适量0.1 mol/L pH4.0的乙二胺四乙酸钠/Mcllvaine缓冲液，样品经匀浆后，离心至明显分层，取上清。抽提上清液调整pH至5.0-6.0，溶液中加入一定量苯酚或者苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯磁球（见图1），充分混匀吸附3-5分钟，磁力架分离磁球，弃去上清。
（2）1-5%甲醇水溶液洗涤磁球2-3次。
（3）加适量含20%乙腈以及10%甲醇的0.01 mol/L草酸溶液至吸附有四环素类抗生素的磁球中，分离磁球，收集洗脱液。
水产品样品包括各式新鲜或冷冻加工后的能顺利取肉的鱼、虾、蟹等水产品。提取缓冲液用量以能使抗生素充分溶出，并利于后续匀浆为准。为了更充分富集肉中的天然四环素，经提取缓冲液提取过后的沉淀可以再采用0.1mol/L pH4.0的乙二胺四乙酸钠/Mcllvaine缓冲液重新提取一次，合并两次抽提上清，然后进行后续吸附步骤。分离磁球的过程可以采用常规的磁力架分离或者通过离心分离磁球等方法。吸附时，磁球粒径大，磁球用量相对稍多。
采用本发明方案对天然四环素类抗生素具有优秀的富集效果，加标回收率高，这可能是由于四环素类抗生素含有氢化并四苯疏水母核结构以及多羟基或羰基取代功能团，而吸附剂表面修饰有苯酚或苯甲酸功能团，吸附剂可通过苯环范德华力或疏水作用与四环素抗生素母核结构结合，同时吸附剂上的羟基或羰基功能团与四环素类抗生素羰基或羟基可形成氢键相互作用，从而实现对该类抗生素的吸附。
为了达到富集效果又能节约材料，每1 g水产品肌肉组织所需磁球剂量为2-10 mg。为了达到洗脱效果又节约材料，每1 mg吸附有四环素类抗生素的磁球中加入的洗脱液体积为40-80 μL。
为了达到更好的富集效果所用的表面修饰了一定密度苯酚或者苯甲酸功能团的聚苯乙烯磁球，磁球粒径为70-300 nm之间。
表面修饰了一定密度苯酚或者苯甲酸功能团的，粒径为70-300 nm的聚苯乙烯磁球制备可以依照下列步骤：
化学共沉淀法合成超顺磁性Fe3O4纳米单颗粒，再将Fe3O4纳米颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后氮气吹干；取5 g表面油酸化的Fe3O4纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烷混合液5 mL悬浮Fe3O4纳米颗粒，超声5~10 min形成磁流体，将磁流体转入400 mL，0.01M含0.2~0.5%的SDS的NaHCO3溶液中，超声波频率为25KHz ，超声功率为200-300 W条件下功率继续超声乳化30min，形成细乳液；加0.1g K2S2O8于70℃反应20~40 min后加入0.5 g对乙烯基苯酚或对乙烯基苯甲酸，继续反应12~16 h；磁架吸附磁球，即获得内含多个超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的苯酚或者苯甲酸功能团修饰的磁球；磁架回收磁球，制备好的苯酚或者苯甲酸功能团修饰的磁球依次采用饱和食盐水、3% NaOH 以及3% HCl 浸泡洗涤各1~3 h，，最后以0.01 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液洗涤磁球至中性，并将磁球重悬于0.01 mol/L pH 7.0 磷酸盐缓冲液中于4 ℃保存备用。
化学共沉淀法合成超顺磁性Fe3O4纳米单颗粒，再将Fe3O4纳米颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后氮气吹干；取5 g表面油酸化的Fe3O4纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烷混合液5 mL悬浮Fe3O4纳米颗粒，超声5~10 min形成磁流体，将磁流体转入400 mL，0.01M含0.2~0.5%的SDS的NaHCO3溶液中，超声波频率为25KHz ，超声功率为200-300 W条件下功率继续超声乳化30min，形成细乳液；细乳液中加0.1g K2S2O8于70℃反应10~20 min后，然后加入0.5 g对乙烯基苯酚或对乙烯基苯甲酸，继续反应12~16 h；磁架吸附磁球，即获得内含超多个顺磁性Fe3O4纳米颗粒的苯酚或苯甲酸功能团修饰的磁球；磁架回收磁球，制备好的苯酚或苯甲酸功能团修饰的磁球依次采用饱和食盐水、3% NaOH 以及3% HCl 浸泡洗涤各1~3 h，，最后以0.01 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液洗涤磁球至中性，并将磁球重悬于0.01 mol/L pH 7.0 磷酸盐缓冲液中于4 ℃保存备用。
采用上述制备方法，可以使得磁球具有稳定性好、重现性高的优点。
本发明还涉及上述富集方法在分析检测水产品中天然四环素类抗生素中的应用，其特征在于收集洗脱液，过滤，直接上高效液相色谱或液质联用进行定量定性分析。过滤可以直接采取常规液相或液质联用进样所需的0.45 μm或0.22μm滤膜过滤，液相色谱或液相色谱-质谱联用的条件可以直接参照中华人民共和国标准GB/T20764-2006文件执行，此为常规实验技术，不再赘言。
采用本发明技术方案具有如下有益效果：
1、本发明采用磁固相萃取方法（具体原理见图2），有效的富集水产品中天然四环素类抗生素（金霉素、土霉素、四环素和强力霉素），且吸附效率高，样品提取回收率高。
2、本方案为磁球吸附，富集速度快。本磁球的溶液单分散性好，在溶液中可均匀分布，比表面积大，提高了萃取过程中吸附剂吸附待分离物的速率，缩短了吸附时间；每个样品前处理时间小于25 min，用时约为国标前处理方法的1/4。
3、吸附容量大，所用的有机溶剂少，节约材料，减少了环境污染。
5、磁球粒径小，比表面积远大于固相萃取材料，吸附容量大，吸附剂用量少，可实现微量洗脱液洗脱，富集倍数高，且可省去常规前处理流程中的旋转蒸发等浓缩步骤，对分析物破坏少，减少了检测误差。
附图说明
图1 苯酚以及苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯超顺磁磁球结构示意图。
图2 本发明所涉及的磁分散固相萃取技术的操作流程图。
具体实施方式
为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中乙二胺四乙酸钠/Mcllvaine缓冲液（pH4.0）的配制过程为：准确称取柠檬酸21.0 g，用水溶解稀释至1000 mL（A 液）；准确称取磷酸氢二钠71.6g，用水溶解稀释至 1000 mL（B 液）。准确称取乙二胺四乙酸二钠1.86 g，用307 mL A 液和 193 mL B 液溶解混匀即可。
实施例1 合成苯酚或苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯磁球（粒径70 nm）
参照文献（Yan F, Li J, Zhang J, Liu F, Yang W. J. Nanopart. Res.,2009,11(2):289～296）方法，化学共沉淀法合成超顺磁性Fe3O4纳米颗粒，再将Fe3O4纳米颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后氮气吹干；取5 g表面油酸化的Fe3O4纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烷混合液5 mL悬浮Fe3O4纳米颗粒，超声5 min形成磁流体，将磁流体转入400 mL，0.01M含0.5%的SDS的NaHCO3溶液中，300 W（25KHz）功率继续超声乳化30min，形成细乳液；在上述细乳液中加入0.1g K2S2O8于70℃反应20 min后加入0.5 g对乙烯基苯酚或对乙烯基苯甲酸，继续反应12 h。磁架吸附磁球，即获得内含超顺磁性Fe3O4纳米颗粒，表面修饰有苯酚或苯甲酸功能团的磁球。磁架回收磁球，制备好的苯酚或苯甲酸功能团修饰磁球依次采用饱和食盐水、3% NaOH 以及3% HCl 浸泡洗涤各2 h，最后以0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤磁球至中性，并将磁球重悬于0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中于4 ℃保存备用。
实施例2 合成苯酚或苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯磁球（粒径100 nm）
参照文献（Yan F, Li J, Zhang J, Liu F, Yang W. J. Nanopart. Res.,2009,11(2):289～296）方法，化学共沉淀法合成超顺磁性Fe3O4纳米颗粒，再将Fe3O4纳米颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后氮气吹干；取5 g表面油酸化的Fe3O4纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烷混合液5 mL悬浮Fe3O4纳米颗粒，超声5 min形成磁流体，将磁流体转入400 mL，0.01M含0.4%的SDS的NaHCO3溶液中，250 W（25KHz）功率继续超声乳化30min，形成细乳液；在上述细乳液中加入0.1g K2S2O8于70℃反应10 min后加入0.5 g对乙烯基苯酚或对乙烯基苯甲酸，继续反应12 h。磁架吸附磁球，即获得内含超顺磁性Fe3O4纳米颗粒，表面修饰有苯酚或苯甲酸功能团的磁球。磁架回收磁球，制备好的苯酚或苯甲酸功能团修饰磁球依次采用饱和食盐水、3% NaOH 以及3% HCl 浸泡洗涤各2 h，最后以0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤磁球至中性，并将磁球重悬于0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中于4 ℃保存备用。
实施例3 合成苯酚或苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯磁球（粒径200 nm）
参照文献（Yan F, Li J, Zhang J, Liu F, Yang W. J. Nanopart. Res.,2009,11(2):289～296）方法，化学共沉淀法合成超顺磁性Fe3O4纳米颗粒，再将Fe3O4纳米颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后氮气吹干；取5 g表面油酸化的Fe3O4纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烷混合液5 mL悬浮Fe3O4纳米颗粒，超声5 min形成磁流体，将磁流体转入400 mL，0.01M含0.3%的SDS的NaHCO3溶液中，200 W（25KHz）功率继续超声乳化30min，形成细乳液；在上述细乳液中加入0.1g K2S2O8于70℃反应10 min后加入0.5 g对乙烯基苯酚或对乙烯基苯甲酸，继续反应12 h。磁架吸附磁球，即获得内含超顺磁性Fe3O4纳米颗粒，表面修饰有苯酚或苯甲酸功能团的磁球。磁架回收磁球，制备好的苯酚或苯甲酸功能团修饰磁球依次采用饱和食盐水、3% NaOH 以及3% HCl 浸泡洗涤各2 h，最后以0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤磁球至中性，并将磁球重悬于0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中于4 ℃保存备用。
实施例4 合成苯酚或苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯磁球（粒径300 nm）
参照文献（Yan F, Li J, Zhang J, Liu F, Yang W. J. Nanopart. Res.,2009,11(2):289～296）方法，化学共沉淀法合成超顺磁性Fe3O4纳米颗粒，再将Fe3O4纳米颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后氮气吹干；取5 g表面油酸化的Fe3O4纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烷混合液5 mL悬浮Fe3O4纳米颗粒，超声10 min形成磁流体，将磁流体转入400 mL，0.01M含0.2%的SDS的NaHCO3溶液中，200 W（25KHz）功率继续超声乳化30min，形成细乳液；在上述细乳液中加入0.1g K2S2O8于70℃反应20 min后加入0.5 g乙烯基磺酸钠对乙烯基苯酚或对乙烯基苯甲酸，继续反应16 h。磁架吸附磁球，即获得内含超顺磁性Fe3O4纳米颗粒，表面修饰有苯酚或苯甲酸功能团的磁球。磁架回收磁球，制备好的苯酚或苯甲酸功能团修饰磁球依次采用饱和食盐水、3% NaOH 以及3% HCl 浸泡洗涤各1 h，，最后以0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤磁球至中性，并将磁球重悬于0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中于4 ℃保存备用。
实施例5 以粒径为100 nm 苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯磁球为吸附剂共同富集淡水鱼、虾或蟹中四环素类抗生素的加标回收实验
取经GB/T20764-2006方法验证不含四环素类抗生素的去皮、骨的鱼、虾或蟹肌肉组织各9份，每份重量为5 g，分别按50 ng/g、100 ng/g、200 ng/g添加剂量将土霉素、金霉素、四环素以及强力霉素分别加于上述空白样品中，静置30 min，每个浓度重复三个样品。加入15 mL的0.1 mol/L的乙二胺四乙酸钠/Mcllvaine提取缓冲液后高速匀浆2-3 min，匀浆液5000 g离心5分钟后分离上清，沉淀继续加入10 mL的0.1mol/L的乙二胺四乙酸钠/Mcllvaine提取缓冲液重新提取一次，合并两次抽提上清。提取液用NaOH调整pH值至5后，加入粒径100 nm苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯磁球15 mg，充分混匀吸附5分钟，5%甲醇水溶液洗涤磁球除非特异性吸附，加入750 μL洗脱液洗脱，洗脱液经微孔滤膜过滤后直接上高效液相色谱分析。高效液相色谱分析按按GB/T20764-2006文件执行。加标回收实验结果见下表，结果表明本实验方法提取回收率较高，可达到国标要求，但前处理时间是国标法的1/4。
实施例6 以粒径为100 nm 苯酚功能团修饰的聚苯乙烯磁球为吸附剂富集鲤鱼、虾或蟹中土霉素
分别取5 g去皮、骨的上述鲤鱼、螃蟹和虾肌肉组织（不含四环素类抗生素），添加25 ng的土霉素标准品后混匀，静置30 min；加入15 mL的0.1 mol/LpH4.0的乙二胺四乙酸钠/Mcllvaine提取缓冲液后高速匀浆2-3 min，匀浆液5000 g离心5分钟后分离上清，沉淀继续加入10 mL的0.1mol/L pH4.0的乙二胺四乙酸钠/Mcllvaine提取缓冲液重新提取一次，合并两次抽提上清。1 mol/L的HCl调整上清液pH值至5.0。将粒径100 nm的苯酚功能团修饰磁球15 mg加入上述提取液中充分混匀吸附3分钟，磁力架分离磁球，弃去上清液。1.5 mL甲醇水溶液 (甲醇含量5%) 洗涤磁球2次后加入0.01 mol/L草酸溶液（内含20%乙腈，10%的甲醇）750 μL浸泡磁球1-2 min。磁力架分离磁球，洗脱液经0.22 μm滤膜过滤后上高效液相色谱检测，检测方案按GB/T20764-2006文件执行。按如上流程提取肌肉组织中的土霉素，测定加标回收率，结果表明，鲤鱼中土霉素的提取回收率为91.9%,螃蟹中土霉素的提取回收率为94.4 %,虾中土霉素的提取回收率为89.1%。
实施例7 以粒径为200 nm 苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯磁球为吸附剂富集鲢鱼、虾或蟹中四环素
取5 g去皮、骨的上述鲢鱼、螃蟹和虾肌肉组织（不含四环素类抗生素），添加10 ng的四环素标准品后混匀，静置30 min；加入15 mL的0.1 mol/L PH4.0的乙二胺四乙酸钠/Mcllvaine提取缓冲液后高速匀浆2-3 min，匀浆液5000 g离心5分钟后分离上清，沉淀继续加入10 mL的0.1mol/L PH4.0的乙二胺四乙酸钠/Mcllvaine提取缓冲液重新提取一次，合并两次抽提上清。1 mol/L的HCl调整上清液pH值至5.0。将粒径200 nm的苯甲酸功能团修饰的磁球25 mg加入上述提取液中充分混匀吸附5分钟，磁力架分离磁球，弃去上清液。1.5 mL甲醇水溶液 (甲醇含量5%) 洗涤磁球2次后加入0.01 mol/L草酸溶液（内含20%乙腈，10%的甲醇）750 μL浸泡磁球1-2 min。磁力架分离磁球，洗脱液经0.22 μm滤膜过滤后上高效液相色谱检测，检测方案按GB/T20764-2006文件执行。按如上流程提取肌肉组织中的四环素，测定加标回收率，结果表明，鲢鱼中四环素的提取回收率为93.9%,螃蟹中四环素的提取回收率为91.5 %,虾中四环素的提取回收率为96.1%。
实施例8 以粒径为300 nm 苯酚功能团修饰的聚苯乙烯磁球为吸附剂富集草鱼、虾或蟹中的强力霉素
取5 g去皮、骨的上述草鱼、螃蟹和虾肌肉组织（不含四环素类抗生素），添加20 ng的强力霉素标准品后混匀，静置30 min；加入15 mL的0.1 mol/L PH4.0的乙二胺四乙酸钠/Mcllvaine提取缓冲液后高速匀浆2-3 min，匀浆液5000 g离心5分钟后分离上清，沉淀继续加入10 mL的0.1mol/L PH4.0的乙二胺四乙酸钠/Mcllvaine提取缓冲液重新提取一次，合并两次抽提上清。1 mol/L的HCl调整上清液pH值至6.0。将粒径300 nm的苯酚功能团修饰磁球50 mg加入上述提取液中充分混匀吸附4分钟，磁力架分离磁球，弃去上清液。2 mL甲醇水溶液 (甲醇含量1%) 洗涤磁球2次后加入0.01 mol/L草酸溶液（内含20%乙腈，10%的甲醇）750 μL浸泡磁球1-2 min。磁力架分离磁球，洗脱液经0.22 μm滤膜过滤后上高效液相色谱检测，检测方案按GB/T20764-2006文件执行。按如上流程提取肌肉组织中的强力霉素，测定加标回收率，结果表明，草鱼中强力霉素的提取回收率为96.9%,螃蟹中强力霉素的提取回收率为91.2 %,虾中强力霉素的提取回收率为87.9%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种富集水产品中天然四环素类抗生素的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）在水产品肌肉组织中加入适量0.1 mol/L pH4.0的乙二胺四乙酸钠/Mcllvaine缓冲液，经匀浆后，离心至明显分层，取上清；
抽提上清液调整pH至5.0-6.0，溶液中加入一定量苯酚或者苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯磁球，充分混匀吸附3-5分钟，磁力架分离苯酚或者苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯磁球，弃去上清；
（2）1-5%甲醇水溶液洗涤磁球2-3次；
（3）加适量内含20%乙腈以及10%的甲醇的0.01 mol/L草酸溶液至吸附有四环素类抗生素的苯酚或者苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯磁球中，分离苯酚或者苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯磁球，收集洗脱液。
2.根据权利要求1所述的富集水产品中天然四环素类抗生素的方法，其特征在于每1 g水产品肌肉组织所需苯酚或者苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯磁球剂量为2-10 mg。
3.根据权利要求1所述的富集水产品中天然四环素类抗生素的方法，其特征在于所述苯酚或者苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯磁球，粒径为70-300 nm之间。
4.根据权利要求1所述的富集水产品中天然四环素类抗生素的方法在分析检测水产品中天然四环素类抗生素中的应用，其特征在于收集洗脱液，过滤，直接上高效液相色谱或液质联用进行定量定性分析。
5.根据权利要求1~3任一所述的富集水产品中天然四环素类抗生素的方法，其特征在于所述苯酚或者苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯磁球按照如下步骤制备：
化学共沉淀法合成超顺磁性Fe3O4纳米颗粒，再将Fe3O4纳米颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后氮气吹干；取5 g表面油酸化的Fe3O4纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烷混合液5 mL悬浮Fe3O4纳米颗粒，超声5~10 min形成磁流体，将磁流体转入400 mL，0.01 mol/L含0.2~0.5%的SDS的NaHCO3溶液中，超声波频率为25KHz ，超声功率为200-300 W条件下功率继续超声乳化30min，形成细乳液；细乳液中加0.1g K2S2O8于70℃反应10~20 min后，然后加入0.5 g对乙烯基苯酚或对乙烯基苯甲酸，继续反应12~16 h；磁架吸附磁球，即获得内含超多个顺磁性Fe3O4纳米颗粒的苯酚或苯甲酸功能团修饰的磁球；磁架回收磁球，制备好的苯酚或苯甲酸功能团修饰的磁球依次采用饱和食盐水、3% NaOH 以及3% HCl 浸泡洗涤各1~3 h，，最后以0.01 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液洗涤磁球至中性，并将磁球重悬于0.01 mol/L pH 7.0 磷酸盐缓冲液中于4 ℃保存备用。
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