发明内容
本发明的目的是填补目前关于应用甘草多糖降低卷烟烟草凝集物(CSC)对人支气管上皮BEAS-2B细胞的细胞毒性方法的空白,提供一种甘草多糖的提取方法及应用。将本发明制备的甘草多糖加入到卷烟中,所得卷烟的烟草凝集物对人支气管上皮BEAS-2B细胞存活率显著高于空白样品,具有正面作用。
本发明同时提供了在卷烟中添加甘草多糖降低卷烟烟草凝集物(CSC)对人支气管上皮BEAS-2B细胞的细胞毒性的应用。
本发明的目的通过如下技术方案予以实现:
一种甘草多糖的提取方法,其包括如下步骤:
(1)甘草渣除沙洗净,晾干后粉碎得甘草渣原料;
(2)在甘草渣原料中加入有机酸溶液,于110-120℃下提取2-5小时,过滤,分离甘草渣提取液,用氢氧化钾调节提取液pH值至6.5-7.0;
(3)将步骤(2)所得的提取液用截留分子量5000道尔顿的膜进行超滤,收集截流液部分;
(4)将超滤透过液进行真空浓缩,至原来体积的1/7~1/3,得浓缩液;
(5)在浓缩液中加入乙醇,混合均匀后,在0-4℃下静置1-3小时,过滤,除去上层清液部分,得多糖沉淀;
(6)收集沉淀物,冷冻干燥,获得甘草多糖。
进一步改进的,步骤(1)所述甘草渣粉碎至40-100目。
进一步改进的,步骤(2)所述有机酸溶液为柠檬酸或苹果酸中任意一种,且溶液的pH值为1.0-3.0。
进一步改进的,步骤(2)所述有机酸溶液的用量按甘草渣原料重量的20-40倍加入。
进一步改进的,步骤(5)所述乙醇添加量满足混合均匀后乙醇最终浓度为75-90%(v/v)。
进一步改进的,步骤(5)所述多糖沉淀用乙醇浸洗2-3次。
进一步改进的,步骤(6)所得沉淀物进行冷冻干燥,得浅黄色甘草多糖。
上述方法得到的甘草多糖在卷烟中的应用,具体是按照烟丝质量的0.05-0.2%的比例,通过喷洒方式将其添加到烟丝或过滤嘴中。
本发明采用了以上技术方案,具有如下的优点和有益效果:
1、本发明提供了一种甘草多糖的提取分离方法,将本发明制备的甘草多糖以烟丝重量0.05%~0.2%加入到卷烟中,所得卷烟的烟草凝集物对人支气管上皮BEAS-2B细胞存活率显著高于空白样品,具有正面作用。此外,本发明制备的甘草多糖对卷烟的吸食品质无影响。
2、本发明以低值的甘草渣为原料,制备具有功能活性的甘草多糖,实现了甘草渣资源的高值化利用。所公开的甘草多糖提取方法具有工艺流程简单、易于产业化的特点。
具体实施方式
烟草凝集物细胞毒性试验:按标准吸烟条件(GB/T 16450-1996,常规分析用吸烟机定义的标准条件)收集卷烟烟气,制备烟气凝集物,用细胞培养液配制成1支烟/ml的溶液,液氮储存备用。实验时,稀释到实验设计浓度。人支气管上皮BEAS-2B细胞采用无血清的LHC-8培养基,在37度、5%二氧化碳和95%湿度条件下培养。
将指数生长期的细胞,以适当密度接种于96孔板中,24h后加入不同浓度的烟草凝集物,每种条件设6个平行洋,培养基总体积为200ul,在在37度、5%二氧化碳和95%湿度条件下继续培养72h。培养结束前4h,每孔加入5mg/ml MTT溶液20ul。培养结束后,取上清液,加入150ulDMSO,吹打混匀,待紫色结晶全部溶解后,用酶标仪测定490nm波长的OD值,计算细胞存活分数。
下面结合实施例和附表对本发明的具体实施作进一步说明。
实施例1
(1)甘草渣除沙洗净,晾干后粉碎,过40目筛得甘草渣原料;
(2)按甘草渣原料重量的35倍加入水,于110℃下提取5小时,过滤,分离甘草渣,得提取液,用氢氧化钾调节提取液pH值至7.0;
(3)将步骤(2)所得的提取液用截留分子量5000道尔顿的膜进行超滤,收集截流液部分;
(4)将提取液进行真空浓缩,至原来体积的1/5,得浓缩液;
(5)在浓缩液中加入乙醇,混合均匀后乙醇最终浓度为70%(v/v),在2℃下静置3小时,过滤,除去上层清液部分,得多糖沉淀;
(5)收集沉淀物,冷冻干燥,获得浅黄色甘草渣多糖1#。
实施例2
(1)甘草渣除沙洗净,晾干后粉碎,过40目筛得甘草渣原料;
(2)按甘草渣原料重量的35倍加入pH值为2的柠檬酸溶液,于110℃下提取5小时,过滤,分离甘草渣,得提取液,用氢氧化钾调节提取液pH值至7.0;
(3)将步骤(2)所得的提取液用截留分子量5000道尔顿的膜进行超滤,收集截流液部分;
(4)将截流液进行真空浓缩,至原来体积的1/5,得浓缩液;
(5)在浓缩液中加入乙醇,混合均匀后乙醇最终浓度为70%(v/v),在2℃下静置3小时,过滤,除去上层清液部分,得多糖沉淀;
(5)收集沉淀物,冷冻干燥,获得浅黄色甘草渣多糖2#。
实施例3
(1)甘草渣除沙洗净,晾干后粉碎,过80目筛得甘草渣原料;
(2)按甘草渣干粉重量的20倍加入pH值为1的柠檬酸溶液,于120℃下提取2小时,过滤,分离甘草渣渣得提取液,用氢氧化钾调节提取液pH值至6.5;
(3)将步骤(2)所得的提取液用截留分子量5000道尔顿的膜进行超滤,收集截流液部分;
(4)将超滤透过液进行真空浓缩,至原来体积的1/5,得浓缩液;
(5)在浓缩液中加入乙醇,混合均匀后乙醇最终浓度为85%(v/v),在4℃下静置12小时,过滤,除去上层清液部分,得多糖沉淀,并用乙醇和丙酮浸洗2-3次;
(6)收集沉淀物,冷冻干燥,获得浅黄色甘草渣多糖3#。
实施例4
(1)甘草渣除沙洗净,晾干后粉碎,过100目筛得甘草渣原料;
(2)按甘草渣干粉重量的25倍加入pH值为2.5的苹果酸溶液,于115℃下提取4小时,过滤,分离甘草渣渣得提取液,用氢氧化钾调节提取液pH值至6.7;
(3)将步骤(2)所得的提取液用截留分子量5000道尔顿的膜进行超滤,收集截流液部分;
(4)将超滤透过液进行真空浓缩,至原来体积的1/7,得浓缩液;
(5)在浓缩液中加入乙醇,混合均匀后乙醇最终浓度为80%(v/v),在3℃下静置10小时,过滤,除去上层清液部分,得多糖沉淀,用乙醇浸洗2-3次;
(6)收集沉淀物,冷冻干燥,获得浅黄色甘草渣多糖4#。
实施例5
(1)甘草渣除沙洗净,晾干后粉碎,过80目筛得甘草渣原料;
(2)按甘草渣干粉重量的25倍加入pH值为3.0的柠檬酸溶液,于110℃下提取5小时,过滤,分离甘草渣渣得提取液,用氢氧化钾调节提取液pH值至6.8;
(3)将步骤(2)所得的提取液用截留分子量5000道尔顿的膜进行超滤,收集截流液部分;
(4)将超滤透过液进行真空浓缩,至原来体积的1/3,得浓缩液;
(5)在浓缩液中加入乙醇,混合均匀后乙醇最终浓度为90%(v/v),在4℃下静置3小时,过滤,除去上层清液部分,得多糖沉淀,用乙醇浸洗3次;
(6)收集沉淀物,冷冻干燥,获得浅黄色的甘草渣多糖5#,。
卷烟CSC对人支气管上皮BEAS-2B细胞增殖的影响
产品 |
添加量 |
IC50 |
甘草多糖1# |
0.1% |
0.00299支烟/ml |
甘草多糖2# |
0.1% |
0.00485支烟/ml |
甘草多糖3# |
0.1% |
0.00496支烟/ml |
甘草多糖4# |
0.1% |
0.00499支烟/ml |
甘草多糖5# |
0.1% |
VC |
空白 |
|
0.00295支烟/ml |
由表1可见,用去离子水溶解甘草多糖,通过喷洒方式在卷烟中添加0.1%的甘草多糖,其卷烟CSC对人支气管上皮BEAS-2B细胞增殖的IC50值是空白样品的1.74倍。采用常规的热水提取得到的甘草多糖其卷烟CSC对人支气管上皮BEAS-2B细胞增殖的IC50值与空白样品相当。这表明,本发明所制备的甘草多糖可以显著提高卷烟CSC对人支气管上皮BEAS-2B细胞增殖的IC50值,即添加了甘草多糖的卷烟安全性更高。