CN103060468B - 一种埃里希氏菌的荧光定量pcr检测和分型的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种埃里希氏菌的荧光定量PCR检测和分型的引物、探针及试剂盒。所述引物序列如SEQIDNO.1和2所示，所述探针为SEQIDNO.3和4。用上述引物和探针PCR扩增待测菌，扩增出210bp条带，且荧光检测在640nm波长增强的为埃里希氏菌阳性样本；再根据熔解温度可对埃里希氏菌进行分型。本发明的技术优势明显，具有很高的特异性和敏感,且可以方便的检测所有种的埃里希氏菌,可广泛的用于人和各种动物（牛、狗、羊）和人的埃里希氏菌病的确诊和治疗判定，将会产生很好的经济效益。

Description

一种埃里希氏菌的荧光定量PCR检测和分型的引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及埃里希氏菌感染的分子诊断的荧光定量PCR检测和分型的引物、探针及试剂盒。

背景技术

埃里希氏菌是生存在单核白细胞和嗜中性白细胞的胞浆内的专性细胞内寄生菌。埃里希氏菌病经蜱虫传播，在世界范围内广泛存在，引起人和多种动物(牛、狗、羊)以发热和贫血为主要特征的疫病。此病的临床诊断主要依赖于流行病学和发病症状，结合血液涂片的显微镜观察法检出埃里希氏菌。临床诊断的灵敏度较低，现有的血清学诊断方法不能区分感染后的康复者和临床感染者。

感染人畜的埃里希氏菌的重要的种包括：犬型E.canis,人型E.chafeensis和E.ewingii,牛型E.ruminatium，羊型E.ovina,鼠型E.muris。不同种的埃里希氏菌感染宿主的专一性不强，而现有的分子诊断技术仅可以检测单一种的埃里希氏菌。本发明建立了一套高灵敏度和高特异性、快速的检测埃里希氏菌的、适合临床使用的分子诊断方法。

发明内容

为了解决现有分子诊断技术只能检测单一种埃里希氏菌的不足，本发明提供一种快速、特异性强、灵敏度高、适合临床使用的定量PCR检测所有种的埃里希氏菌的引物、探针及试剂盒。

本发明的原理和核心是科学地设计扩增和检测埃里希氏菌的特异、高效的引物和探针。在保证设计的引物高效扩增埃里希氏菌、设计的探针特异检测埃里希氏菌的同时，确保此引物和探针不扩增和检测其它类似的微生物（anaplasma无形体、Bartonella巴尔通体、Rickettsia立克次氏体、Neorickettsia新立克次氏体、Coxiella考克斯氏菌、Mycoplasma支原体）。此外，本发明设计的探针和不同种的埃里希氏菌的基因序列有不同程度的差异（有1-3个碱基的差异），高分辨率熔点曲线技术会显示不同种埃里希氏菌的熔解温度的差异，这可以方便的用于基因分型。

从GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）获取如下埃里希氏菌以及相关细菌的16S rDNA的序列后，用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法对所有序列进行对齐：无形体（基因序列号：Anaplasma equi AF172167，Anaplasmaplatys M82801,Anaplasma phagocytophilum AY055469,Anaplasma bovisHQ913646,Anaplasma marginale AF309866和AF414873），巴尔通体（Bartonella henselae AY513504），立克次氏体（Rickettsia rickettsiaL36127），考克斯氏菌（Coxiella burnetii D89798），支原体(FR869692),新立克次氏体(Neorickettsia helminthoeca U12457,Neorickettsiarickettsia NR_029162),牛型埃里希氏菌(Ehrlichia orCowdria ruminatiumU03776,U03777,CR925678,DQ647616),鼠型埃里希氏菌（Ehrlichia murisAB013008,AB196302),羊型埃里希氏菌（Ehrlichia ovina AF318946),犬型埃里希氏菌（Ehrlichia canis(GU810149),人型埃里希氏菌（Ehrlichiachafeensis AF147752,ECU60476；Ehrlichia ewingii M73227,U96436)。

引物和探针的选择基于对齐序列的保守区和变异区。附图1、2、3、和4显示设计的引物和探针：

上游引物：5’-GAGGATTTTATCTTTGTATTGTAGCTAA-3’（SEQ ID NO.1）；

下游引物：5’-TGTAAGGTCCAGCCGAACTGACT-3’（SEQ ID NO.2）；

探针-1：5’-ACGCGAAAAACCTTACCACTTTTTGAC-6-FAM-3’（SEQ ID NO.3）；

探针-2：5‘-LCred640 　GAAGGTCGTATCCCT CTTAACAGG-phos（磷酸）-3’（SEQID NO.4）

本发明还公开了埃里希氏菌的荧光定量PCR检测和分型试剂盒，该试剂盒由下列组成：（1）5x定量PCR反应液；22μl；（2）22μl的5x的探针和引物混合液有浓度为5μM的上游引物、5μM下游引物、1μM的探针-1、1μM的探针-2。

本发明进一步提供了一种埃里希氏菌分型方法，该方法包括以下步骤：

（1）用上述引物和探针PCR扩增待测菌，扩增出210bp条带，且荧光检测在640nm波长增强的为埃里希氏菌阳性样本；

（2）PCR完成后，对步骤（1）埃里希氏菌阳性样本扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，根据熔解温度对埃里希氏菌进行分型，分型标准是：E.chaffensis熔解温度为－57.5℃，E.ruminatium熔解温度为－56℃，E.canis/chafeensis/ovina/muris的熔解温度－63℃。

本发明能有效地检测所有埃里希氏菌的种，并基于高分辨率熔点曲线技术，方便地区分E.canis/ovina/muris/E.chafeensis,E.ewingii和E.ruminatium。和现有的传统和分子诊断技术相比，本发明的技术优势明显，具有很高的特异性和敏感,且可以方便的检测所有种的埃里希氏菌,可广泛的用于人和各种动物（牛、狗、羊）和人的埃里希氏菌病的确诊和治疗判定，将会产生很好的经济效益。

附图说明

图1：埃里希氏菌荧光定量PCR的上游引物。

上游引物（5’-GAGGATTTTATCTTTGTATTGTAGCTAA-3’）和重要种的埃里希氏菌的16S rDNA序列显示100%的吻合：E.canis,E.chafeensis,E.ewingii,E.muris and E.ruminatium。

图2：埃里希氏菌荧光定量PCR的下游引物。

下游引物（5’-TGTAAGGTCCAGCCGAACTGACT-3’）和重要种的埃里希氏菌的16S rDNA序列显示100%的吻合：E.canis,E.chafeensis,E.ewingii,E.muris andE.ruminatium.下游引物的序列和显示的序列成反义关系。

图3：埃里希氏菌荧光定量PCR的6-FAM探针。

此PCR***的6-FAM探针（5’-ACGCGAAAAACCTTACCACTTTTTGAC-6-FAM-3’）和重要种的埃里希氏菌的16S rDNA序列显示100%的吻合：E.canis,E.chafeensis,E.ewingii,E.muris and E.ruminatium。

图4：埃里希氏菌荧光定量PCR的LCred640探针。

此PCR***的LCred640探针（5’-LCred640　GAAGGTCGTATCCCTCTTAACAGG-phos-3’）和重要种的埃里希氏菌的16S rDNA序列显示不同程度的吻合：一个碱基的不同(E.canis，E.muris，E.chafeensis)，二个碱基的不同(E.ewingii)和三个碱基的不同（E.ruminatium）。

图5：埃里希氏菌的熔解温度

PCR完成后，对不同种的埃里希氏菌(E.canis,E.chaffensis and E.ruminatium)的核酸的扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，观察不同种埃里希氏菌的熔解温度。LCRed640探针和E.canis/chafeensis/ovina/muris,E.chaffensis and E.ruminatium的16S rDNA的序列显示不同程度的差异。因此，高分辨率熔解曲线分析显示，E.chaffensis（－57.5℃）和E.ruminatium（－56℃）的熔解温度低于E.canis/chafeensis/ovina/muris的熔解温度（－63℃）。

具体实施方式

本发明引物和探针（即埃里希氏菌PCR特异性的确定）：从三个方面保证本发明的PCR***的特异性：i)从GenBank获取相关埃里希氏菌及相关细菌的16S rDNA序列，用于埃里希氏菌的科学合理设计。设计的二个引物和二个探针，被用于GenBank的BLAST搜寻，确认本发明的引物和探针扩增所有种的埃里希氏菌，而不扩增其它类似的细菌；ii）用本发明的技术对不同株的埃里希菌和其他细菌的DNA进行扩增，观察不同扩增对象在PCR过程中荧光强度（640nm）的变化，和PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的条带的大小。结果显示，仅埃里希氏菌的DNA被有效的扩增，荧光在640nm波长增强，显示阳性；而其它类似的细菌的PCR扩增的F2/F1荧光呈水平趋势，没有显示随着PCR循环的增加而出现荧光强度的增加；此外，埃里希氏菌的16S rDNA的扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示预期的210bp的条带，其他类似的细菌核酸的扩增产物在电泳没有上述条带；iii）对扩增的PCR产物进行进行测序，测序的结果和GenBank的序列进行比较。如上所述，合理设计的埃里希氏菌荧光qPCR被实验证实为，扩增所有种的埃里希氏菌，而不扩增其他类似的细菌，具有极高的特异性。

本发明的埃里希氏菌荧光FRET-qPCR检测方法所用引物和探针的核苷酸序列如下：

上游引物：5’-GAGGATTTTATCTTTGTATTGTAGCTAA-3’；

下游引物：5’-TGTAAGGTCCAGCCGAACTGACT-3’；

探针-1：5’-ACGCGAAAAACCTTACCACTTTTTGAC-6-FAM-3’；

探针-2：5‘-LCred640 　GAAGGTCGTATCCCT CTTAACAGG-phos-3’

使用上述引物和探针进行检测的过程如下：

1．制备PCR用的标准定量试剂（standard）。由Intergrated DNA Technology合成犬型埃里希氏菌（E.canis）的16S rDNA的序列，此序列涵盖PCR的210bp的扩增区域。依据合成物的分子量和绝对重量以及PicoGreen的DNA定量技术，计算合成物所含的16S rDNA的基因拷贝数目。随后，对合成物进行稀释，制备每10μl合成物的稀释试剂含10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝的16SrDNA，作为PCR用的标准定量试剂。

2.制备待检样品的DNA模板。疑似埃里希氏菌感染者的全血（400μl）保存在EDTA试管中用于DNA提取，纯化的DNA洗脱在100μl T₁₀E_0.1（含10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA，pH8.5）用于PCR模板。

3.PCR扩增体系。20μl的扩增体系包含10μl的样品DNA模板或者定量标准试剂（standard）、1xPCR缓冲液、1μM上游引物、1μM下游引物、0.2μM的探针-1和0.2μM探针-2、2个单位的商业化Taq酶、200μM dNTP。

4.PCR扩增循环参数。PCR扩增包括18个温度递减的高严谨循环（high-stringency step-down）和25个欠严谨的荧光获得循环（relaxed-stringency fluorescence acquisition）。18个温度递减的高严谨循环：6x15sec95°C,60sec74°C;9x15sec95°C,60sec72°C;3x15sec95°C,10sec70°C,15sec72°C.25个欠严谨的荧光获得循环：25x15sec95°C,8sec58°C,10sec65°C,and15sec72°C。

5.高分辨率熔解曲线分析。PCR扩增结束后，立即实施高分辨率熔解曲线分析，温度从38°C上升到75°C，以每秒0.2°C/秒的速度递增。数据分析是分析640nm:530nm(F2/F1)的荧光强度的比例。F2/F1的第一衍生值(-d(F2/F1)/dt)被读为该DNA的熔解温度。

6.PCR结果的判定和定量分析。DNA模板的制备过程均设有DNA提取的阴性和阳性对照，随后的PCR扩增对象包括待测样品的DNA模板、DNA提取的阴性和阳性对照、定量的标准试剂（每10μl standard含10⁴，10³，10²，10¹拷贝的埃里希氏菌16S rDNA）。本发明的PCR扩增效率高，有效地扩增含10¹拷贝的埃里希氏菌16S rDNA的standard。

实施例1：埃里希氏菌的分子鉴定

对经过临床诊断、血涂片的显微镜观察和血清学确诊的10个患埃里希氏菌的犬进行分子诊断。操作的流程如上所述，400μl的EDTA全血提取DNA用于PCR扩增。所有10个样品均为埃里希菌PCR阳性，具有特征的63-64°C熔解温度（如图5所示）。基因测序证实PCR的结果。

实施例2：犬埃里希氏菌感染的分子流行病学调查

对279只来自加勒比海岛国（St.Kitts）的犬进行体检（血常规、生化试验）、临床检测、血清学检测（IDEXX SNAP4DX）和本发明的埃里希氏菌PCR检测。仅4%的犬的血涂片显微镜检查为阳性,而本发明检测犬的阳性率约为19%。SNAP4DX检测表明，约24%的犬有抗埃里希氏菌的抗体。通过对犬的健康状况和不同诊断方法的对比表明，血涂片显微镜观察法的灵敏度有限，不能检测相对健康但是血常规异常的埃里希氏菌的亚临床感染者;血清学检测方法不能区分感染后经治疗后的康复犬和感染犬。本发明的埃里希氏菌的荧光定量PCR技术，能准确地诊断临床和亚临床感染者，而且有效的区分感染后经治疗后的康复犬和埃里希氏菌的感染犬。

Claims (3)

1.一种埃里希氏菌的荧光定量PCR检测和分型的引物及探针，其特征在于检测引物为：

上游引物：5’-GAGGATTTTATCTTTGTATTGTAGCTAA-3’；

下游引物：5’-TGTAAGGTCCAGCCGAACTGACT-3’；

检测探针为：

探针-1：5’-ACGCGAAAAACCTTACCACTTTTTGAC-6-FAM-3’；

探针-2：5‘-LCred640　GAAGGTCGTATCCCT CTTAACAGG-phos-3’。

2.一种埃里希氏菌的荧光定量PCR检测和分型试剂盒，包括5倍定量PCR反应液22μl,以及22μl的5倍引物和探针的混合液；所述引物和探针混合液含浓度为5μM的上游引物、5μM下游引物、1μM的探针-1、1μM的探针-2。

3.一种埃里希氏菌分型方法，用于非诊断目的，包括以下步骤：

（1）用权利要求1所述引物和探针PCR扩增待测菌，扩增出210bp条带，且荧光检测在640nm波长增强的为埃里希氏菌阳性样本；

（2）PCR完成后，对步骤（1）埃里希氏菌阳性样本扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，根据熔解温度对埃里希氏菌进行分型，分型标准是：E.chaffensis熔解温度为－57.5℃，E.ruminatium熔解温度为－56℃，E.canis/chafeensis/ovina/muris的熔解温度－63℃。

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