CN103060370A

CN103060370A - 可灵活置换调控元件的高效植物表达载体及其构建方法

Info

Publication number: CN103060370A
Application number: CN2012105009785A
Authority: CN
Inventors: 傅永福; 王旭; 朱金龙; 张晓玫
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-11-29
Filing date: 2012-11-29
Publication date: 2013-04-24

Abstract

本发明涉及一种可灵活置换调控元件的高效植物表达载体及其构建方法，该高效植物表达载体由三类载体组成：基因入门克隆载体GEC、启动子入门克隆载体PEC以及植物双元目的载体BDV；其中，GEC和PEC分别携带一套位点特异的重组序列SSR，GEC携带的SSR为attL1和attL2，PEC携带的SSR为attL3和attL4，BDV上携带两套SSR位点，其中一套为attR1和attR2，可分别与attL1和attL2进行位点特异的重组，另一套为attR3和attR4，可分别与attL3和attL4进行位点特异的重组，将GEC、PEC和BDV置于同一反应体系中，通过LR反应获得。本发明的高效植物表达载体具有通用性，可快速、高效组合任意启动子、基因及各种调控元件，实现各种研究目的。

Description

可灵活置换调控元件的高效植物表达载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及植物表达载体的构建，具体地说，涉及一种可灵活置换调控元件的高效植物表达载体及其构建方法。

背景技术

尽管植物基因组学研究取得了重大进展，很多种植物的基因组序列测序工作已完成，但基因的功能还是知之甚少，对于基因的特定时间和空间、特定发育阶段的功能、不同种植物同源基因的功能进化和分化同样缺乏了解。同样地，虽然对某些植物基因功能、基因间的互作有了较为深入的了解，但是它们在特定条件下的详细功能及互作关系了解甚少。

基因的表达量是基因功能体现的第一步，基因表达量的高低往往决定植物相应表型的强弱。将目标基因限定在特异的条件下表达，是分析基因特异功能的重要方法。目前大多数基因的过表达是采用组成型的启动子（如35S）驱动大多数基因在植物中表达，但是，这些启动子也有很多负效应。如35S启动子产生明显的异位效应，在有些器官组织中或有些植物中35S没有明显活性，甚至对邻近基因会产生不利的效应。

同时，现有植物表达载体***没有考虑在某一特殊的启动子下过表达某一基因，常常是在某一特定启动子直接表达目标基因，而分析增强特定启动子的活性下表达目标基因才是真正意义上的过表达基因；另外，现有基因沉默载体***采用35S启动子，未涉及在特定启动子指导下沉默目标基因。在自然启动子（nativepromoter）驱动下，分析基因表达量与植物表型之间的关系，方能对基因功能的解析提供真实的、有价值的可靠数据。

基因的功能是多方面，即某一基因往往具有多种受时空特异调节的功能，基因突变也就常常造成植物的多种表型。要研究基因在特殊器官、特殊发育时期、特异生长条件下的功能，通过特异启动子来分析是最重要和最有效的手段。

目前，DNA片段（基因和启动子等）克隆方法有酶切连接、同源DNA重组等。同源重组方法虽然高效，但是在植物中的应用常常仅针对基因而设计载体，启动子是固定在植物表达载体上。因而，如果要更换启动子，必须通过酶切连接的方法将新的启动子更换载体上原有的启动子。然而，植物表达载体常常会有酶切位点少、载体不易操作等缺点，导致克隆工作费时、费力。

尽管现在已有一些载体将DNA重组克隆同时用于基因和启动子，但因为它们采用多套重组***，导致重组反应效率很低；并且，不同的研究者根据各自的需求设计不同的载体，这些载体***之间难于兼容，从而导致这些载体的推广应用受到限制，无法实现同行之间的资源共享，造成不必要的资源浪费，且在一定程度上制约植物功能基因组研究的进展。

基因的标记是基因产物蛋白质功能研究的重要手段。现有的同源重组克隆基因方法中，常常将标记分子（如GFP、MYC、HA、FLAG等）放在植物表达双元载体上。这样，通过DNA重组后，虽然目标基因与标记分子产生融合蛋白，但是在目标基因与标记分子之间产生约20个氨基酸的间隔片段，这一间隔片段很有可能导致产生溶解性很差的或结构发生改变的、没有生物学功能的融合分子。

随着研究的不断深入，在实际工作中常常需要对蛋白进行新的、特殊的修饰、标记或增加新的调控元件，或需要对基因的表达进行特殊的调节，这样就需要对目标基因或启动子添加特殊的顺式或反式元件或是特殊标记。

现有的入门克隆是将基因或启动子直接克隆到载体上，不能将新的调控元件或标签应用于启动子和基因，更无法将标记蛋白的体系转换为标记其它分子（如RNA）的载体体系，即载体缺乏可塑性，难以实现研究者各种新的、特殊的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种可灵活置换调控元件的高效植物表达载体及其构建方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种可灵活置换调控元件的高效植物表达载体，由三类载体组成：基因入门克隆载体GEC、启动子入门克隆载体PEC以及植物双元目的载体BDV；其中，GEC和PEC分别携带一套位点特异的重组序列SSR，GEC携带的SSR为attL1和attL2，PEC携带的SSR为attL3和attL4，BDV上携带两套SSR位点，其中一套为attR1和attR2，可分别与attL1和attL2进行位点特异的重组，另一套为attR3和attR4，可分别与attL3和attL4进行位点特异的重组，将GEC、PEC和BDV置于同一反应体系中，通过LR反应，即得。

优选地，attL1、attL2、attL3、attL4、attR1、attR2、attR3和attR4的核苷酸序列分别如SEQ IDNo.1-8所示。

所述基因入门克隆载体GEC和启动子入门克隆载体PEC的出发载体优选为pUC19。

所述基因入门克隆载体GEC上优选含有下列元件中的一种或多种：多克隆位点MCS、AhdI酶切位点、ccdB基因、细菌筛选标记、蛋白标记。

所述启动子入门克隆载体PEC上优选含有下列元件中的一种或多种：多克隆位点MCS、AhdI酶切位点、ccdB基因、细菌筛选标记、顺式调控元件（例如，1或2个增强子）、反式调控元件。

更优选地，所述多克隆位点MCS含有18个酶切连接位点REL，所述多克隆位点MCS含有27个酶切连接位点REL。

所述植物双元目的载体BDV的骨架载体优选为pGreen和pClean。

所述植物双元目的载体BDV上优选含有细菌筛选标记和/或两端带有多个酶切连接位点REL的植物筛选标记。

本发明进一步提供上述植物表达载体的构建方法：将基因入门克隆载体GEC、启动子入门克隆载体PEC以及植物双元目的载体BDV置于同一反应体系中，通过LR反应获得；其中，GEC和PEC分别携带一套位点特异的重组序列SSR，GEC携带的SSR为attL1和attL2，PEC携带的SSR为attL3和attL4，BDV上携带两套SSR位点，其中一套为attR1和attR2，可分别与attL1和attL2进行位点特异的重组，另一套为attR3和attR4，可分别与attL3和attL4进行位点特异的重组。

本发明巧妙地整合常规酶切连接技术和DNA重组技术，创建可灵活置换调控元件的高效多功能载体体系。该体系在DNA片段（基因和启动子）克隆、蛋白标记、任意组装启动子和基因以及引入各种顺式或反式调控元件（cis or trans-elements）等方面具有显著的优势。

本发明采用的MCS位点如图1和图2所示，适合于现有通用的内切酶。

DNA重组事件发生在相互作用的DNA分子上的特异附属序列位点（specific attachment sites，att site）之间。本发明采用DNA重组位点是Invitrogen公司设计的attL1和attL2、attL3和attL4、attR1和attR2、attR3和attR4。attL位点总是与attR位点发生重组反应，并产生attB和attP位点。只有相应编码的重组位点（att）之间（如attL1与attR1之间、attL2与attR2之间、attL3与attR3之间或attL4与attR4之间）可以发生重组^[13-14]，从而保证重组位点的特异性和DNA重组的定向性。

本发明的载体***主要有三类载体组成：基因入门克隆（gene entry clone,GEC，图1和表1）、启动子入门克隆（promoter entry clone,PEC，图2和表2）以及植物双元目的载体（binary destination vector,BDV，图3-图6以及表3）。GEC和PEC分别携带一套位点特异的重组序列（site-specific recombination，SSR）：GEC所携带的SSR为attL1和attL2，PEC携带的SSR为attL3和attL4。BDV上则携带两套SSR位点，其中attR1和attR2与attL1和attL2相匹配，attR3和attR4与attL3和attL4相匹配，相互匹配的位点可以进行位点特异的重组，以确保重组位点的特异性。将GEC、PEC和BDV放在同一反应体系中，通过LR反应，就可以将基因和启动子同时组装到一个植物双元表达载体。

本发明的基因入门克隆和启动子入门克隆是基于pUC19上构建而成。pUC19载体是一个常用的基因克隆中间载体，并以其易操作著称。

本发明在GEC中引入含有18个酶切/连接位点（restriction enzyme/ligase，REL）的多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）（图1），目标基因或其标记基因是通过酶切/连接的方法进行克隆的；并且各GEC的MCS保持一致，这样目标基因或其标记基因就很容易通过酶切/连接的方法进行克隆构建，并可以很容易在不同的GEC之间进行克隆操作。本发明的GEC中含有AhdI酶切位点，可用于目标基因的TA克隆。本发明在GEC中引入了ccdB基因，作为基因连接产物转化的负筛选标记。

本发明的GEC由一组载体构成（表1），该组载体的各成员分别在不同的部位带有不同的标签，从而可以提供目标蛋白在N端或C端进行各种标签的标记。因为标签插在紧挨着SSR位点内的MSC内，这样就有可能实现蛋白与标签之间的距离最小化。由于常规的DNA重组连接技术（如GATEWAY技术）是将蛋白标签放在双元载体上，从而在经过DNA重组后常常导致蛋白与标签之间产生一个含22个氨基酸的间隔，而这段间隔可能导致产生的蛋白没有功能。本发明的载体可避免这一负效应。

本发明的所有GEC中所含MCS位点后都有终止密码，这样在进行基因克隆时就不必加上终止密码，而不含终止密码的基因可用于N端和C端进行标记。传统的DNA重组技术（如GATEWAY技术）必须分别构建用于N端或C端的入门载体。因而，本体系简化了载体构建流程。

本发明的所有GEC的MCS位点含有大量的REL位点，可以用于对载体进行各种改造。如在SSR内侧加上RNA结合的序列（16X BoxB或6X MS2）后的载体可用于标记RNA，跟踪RNA。

本发明在PEC中引入含有27个REL的MCS（图2），目标启动子或其调控元件是通过酶切/连接的方法进行克隆的；并且各PEC的REL保持一致，这样目标启动子或其调控元件也就很容易进行克隆构建，并可以很容易在不同的PEC之间进行克隆操作。本发明的PEC中含有AhdI酶切位点，可用于目标启动子的TA克隆。本发明在PEC中引入了ccdB基因，作为启动子连接产物转化的负筛选标记。

本发明有3种PEC（表2）：即没有***增强子的、***1个增强子和***2个增强子3种PEC。这样可以确保目标基因在不同强度的启动子驱动下进行表达，并且避免类似强启动子（如35S）带来的各种不利效应。

本发明的所有BDV是基于pGreen骨架设计完成（图3），并采用pClean的高效***T-DNA序列。为确保转基因材料始终携带目标基因，本发明的所有BDV将在植物中的选择标记基因放在紧挨着左边界（left border）区。本发明在BDV中引入了ccdB基因，作为LR反应产物转化的负筛选标记。

本发明的BDV骨架来源于pGreen和pClean，而pGreen和pClean适合于单子叶植物和双子叶植物的遗传转化。因而，本发明的所有BDV适用于各种植物的遗传转化，用于所有相关领域的研究，如研究基因组基因表达、蛋白编码区（CDS）表达、标记蛋白基因表达、蛋白互作、基因沉默、乙醇诱导表达等方面的研究。

本发明的BDV含有多种细菌筛选标记以及多种植物筛选标记（表3），可用于多个基因的共转化。

本发明的BDV上的筛选标记两端有多个酶切位点（图3），可用于根据实际需要更换新的筛选标记。

本发明的所有入门克隆上的重组位点是通用性的，具有很高的兼容性，可用于目前已有的植物、细菌、真菌等GATEWAY表达载体。

本发明的启动子入门克隆可用于构建启动子文库，基因入门克隆可用于构建基因文库。

本发明的启动子入门克隆和基因入门克隆具有大量的酶切/连接位点，因而都可以作为中间载体用于任何DNA片段的克隆。

本发明涵盖表1、表2及表3的所有载体以及在本***所有载体基础上进行改造或修饰后获得的植物表达载体。

表1 基因入门克隆载体（Gene entry clones，GEC）

载体名称	细菌筛选标记	重组位点类型	蛋白标记及位置
				Fu28	Cm	attL1-L2	C端GFP
Fu30	Cm	attL1-L2	N端GFP
				Fu41	Cm	attL1-L2	N端YFP

[0042]

Fu42	Cm	attL1-L2	C端YFP
				Fu43	Cm	attL1-L2	N端CFP
Fu44	Cm	attL1-L2	C端CFP
				Fu45	Cm	attL1-L2	N端mRFP
Fu46	Cm	attL1-L2	C端mRFP
				Fu47	Cm	attL1-L2	N端3MYC
Fu48	Cm	attL1-L2	C端3MYC
				Fu49	Cm	attL1-L2	N端3FLAG
Fu50	Cm	attL1-L2	C端3FLAG
				Fu55	Cm	attL1-L2	N端3HA
Fu56	Cm	attL1-L2	C端3HA
				Fu58	Cm	attL1-L2	N端GST
Fu59	Cm	attL1-L2	N端StrepII
				Fu60	Cm	attL1-L2	N端NLS
Fu61	Cm	attL1-L2	C端NES
				Fu62	Cm	attL1-L2	C端GUS
Fu63	Cm	attL1-L2	C端LUC
				Fu64	Cm	attL1-L2	FLAG端YFPc
Fu65	Cm	attL3-L4	MYC-YFPn
				Fu66	Cm	attL3-L4	YFPc-HA
Fu67	Cm	attL3-L4	YFPn-MYC
				Fu79	Cm	attL1-L2	无标记

表2 启动子入门克隆载体（Promoter entry clones，PEC）

表3 植物双元目的载体（Binary destination vectors，BDV）

本发明的优点在于：

（一）可以快速、高效组合任意启动子和基因，实现各种基因特异表达的目标。

（二）载体GEC、PEC和BDV具有很强的可塑性，可以在本发明载体的基础上任意添加或删减顺式调控元件和反式调控元件，或组合多个基因，或改变各种标记，即可实现各种研究目的。

（三）三类载体具有通用性，启动子入门克隆和基因入门克隆可用于构建启动子库和基因库。

（四）启动子入门克隆和基因入门克隆可以兼做基因克隆的中间载体。

附图说明

图1为本发明实施例1中基因入门克隆载体（GEC）的示意图。

图2为本发明实施例2中启动子入门克隆载体（PEC）的示意图。

图3为本发明实施例3中用于表达基因组DNA基因的植物表达载体（BDV1）的示意图。

图4为本发明实施例3中用于表达特异启动子驱动下基因的植物表达载体（BDV2）的示意图。

图5为本发明实施例3中用于表达特异启动子驱动下基因的植物表达载体（BDV2）的示意图。

图6为本发明实施例3中特异启动子加乙醇诱导性植物表达载体（BDV4）的示意图。

图7为本发明实施例4中荧光蛋白标签载体的验证结果。

图8为本发明实施例5中蛋白表达载体及蛋白标签载体验证结果。

图9为本发明实施例6中荧光蛋白标签载体的验证结果。

图10为本发明实施例7中荧光蛋白标签载体的验证结果。

图11为本发明实施例8中荧光蛋白标签载体的验证结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989）。

实施例1 基因入门克隆载体GEC的构建

根据本发明的相关序列（SEQ ID No.9）和图谱（图1），通过DNA直接合成的方法合成BspHI和ApaI位点之间的序列，然后克隆到pUC19质粒上，即得。然后根据载体图谱的酶切位点，各标签通过DNA直接合成后，利用酶切连接的方法，***至载体的相应部位，即获得各种标记的基因入门克隆。

基因入门克隆载体（GEC）的示意图如图1所示。Entry-F和SP6为两个特异测序引物位点；attL1和attL2为一对重组位点；MCS I和MSC II为多克隆位点；ccdB为细菌负筛选标记基因；pUC18ori为细菌复制起始位点；CmR为细菌氯霉素抗性位点；各内切酶位点标记在其后的括号内；AhdI为TA克隆位点。载体总长度为3013bp。该载体可用于构建各种基因的入门克隆。根据酶切位点，可以将目标基因***该载体合适位点；GEC包括一系列的载体（表1），可以对基因进行多种标记；并可按需求对载体进行改造，添加任意顺式调控元件，研究顺式调控元件对基因功能的调节机制；还可根据需求将载体改造，加上RNA茎环结构（stem loop序列，即B-box），实现对mRNA的标记；该载体还与现有的各种基因入门克隆载体相兼容，可由于现有的植物、细菌和等的GATEWAY重组载体***；该载体还可以作为中间载体，用于DNA片段的克隆。

实施例2 启动子入门克隆载体PEC的构建

根据本发明的相关序列（SEQ ID No.10）和图谱（图2），通过DNA直接合成的方法合成BspH I和Apa I酶切位点之间的序列，然后克隆到pUC19质粒上，即得。然后根据载体图谱上的酶切位点，增强子通过DNA直接合成后，利用酶切连接的方法，***至载体的相应部位，即获得不同的启动子入门克隆。

启动子入门克隆载体（PEC）的示意图如图2所示。Entry-F和SP6为两个特异测序引物位点；attL3和attL4为一对重组位点；MCS I和MSC II为多克隆位点；ccdB 为细菌负筛选标记基因；pUC18ori为细菌复制起始位点；CmR为细菌氯霉素抗性位点；各内切酶（褐色字体）位点标记在其后的括号内；AhdI为TA克隆位点。载体总长度为3221bp。该载体可用于构建各种启动子的入门克隆。根据酶切位点，可以将目标基因启动子***该载体合适位点；PEC包括3个的载体（表2），可以实现对启动子的活性进行调节；并可按需求对载体进行改造，添加任意反式调控元件，研究反式调控元件对基因启动子功能的调节机制；该载体还可以作为中间载体，用于DNA片段的克隆。

实施例3 植物双元目的载体BDV的构建

根据本发明的相关序列（SEQ ID No.11-14）和图谱（图3-图6），通过DNA直接合成的方法合成T-DNA序列（即LB与RB之间的序列），然后通过BglII和PacI双酶切连接的方法，将其***至pGreen质粒的相应部位。然后根据载体图谱的酶切位点，各筛选标记基因采用DNA直接合成法合成后，通过酶切连接的方法***至载体的相应部位，即获得各种筛选标记的植物双元目的表达载体。

用于表达基因组DNA基因的植物表达载体（BDV1）的示意图如图3所示。LB和RB分别为T-DNA左右边界；attR1和attR2为一对重组位点；BarR为植物草甘膦筛选标记基因；ccdB为细菌负筛选标记基因；AmpR为细菌氨苄青霉素筛选标记基因；35ST为35S终止子；CmR为细菌氯霉素抗性位点；pSa ori为农杆菌复制起始位点；ColE ori为细菌复制起始位点；各内切酶位点标记在其后的括号内。载体总长度为4972bp。BDV1是一个植物双元目标表达载体，含有1套DNA重组位点（attR1/attR2），用于与基因组基因入门克隆的重组。载体可用于基因组基因的表达，也可以表达不同的基因组片段的组合片段，研究基因组片段间的互作和进化关系。

用于表达特异启动子驱动下基因的植物表达载体（BDV2）的示意图如图4所示。LB和RB分别为T-DNA左右边界；attR1和attR2为一对重组位点；attR3和attR4为另一对重组位点；BarR为植物草甘膦筛选标记基因；ccdB为细菌负筛选标记基因；AmpR为细菌氨苄青霉素筛选标记基因；35ST为35S终止子；CmR为细菌氯霉素抗性位点；pSa ori为农杆菌复制起始位点；ColE ori为细菌复制起始位点；各内切酶位点标记在其后的括号内。载体总长度为5812bp。BDV2是一个植物双元目标表达载体，含有两套DNA重组位点（attR3/attR4和attR1/attR2），分别用于与启动子入门克隆和基因入门克隆的重组。载体可用于在特异启动子下表达目标基因；与不同PEC（表2）的组合，可以实现研究不同强度地表达基因对植物表型的调节作用；该载体含有一系列载体（表3），各载体具有不同的细菌和植物筛选标记，适合于不同的要求（如共转化不同基因，或用于对某些抗生素有特殊要求的植物材料的转化）。

用于表达特异启动子驱动下的植物RNAi干扰载体（BDV3）的示意图如图5所示。LB和RB分别为T-DNA左右边界；attR1和attR2为一对重组位点；attR3和attR4为另一对重组位点；BarR为植物草甘膦筛选标记基因；ccdB为细菌负筛选标记基因；KanR为细菌卡那霉素筛选标记基因；35ST为35S终止子；CmR为细菌氯霉素抗性位点；pSa ori为农杆菌复制起始位点；ColE ori为细菌复制起始位点；Intron为内含子位点；各内切酶位点标记在其后的括号内。载体总长度为6819bp。BDV3是一个植物双元目标表达载体，含有三套DNA重组位点（attR3/attR4和两套attR1/attR2，其中两套attR1/attR2方向相反），分别用于与启动子入门克隆和入门克隆的重组。载体可用于在特异启动子下沉默目标基因，研究基因功能的特异性。

特异启动子加乙醇诱导性植物表达载体（BDV4）的示意图如图6所示。LB和RB分别为T-DNA左右边界；attR1和attR2为一对重组位点；attR3和attR4为另一对重组位点；BarR为植物草甘膦筛选标记基因；ccdB为细菌负筛选标记基因；AmpR为细菌氨苄青霉素筛选标记基因；35ST为35S终止子；CmR为细菌氯霉素抗性位点；pSa ori为农杆菌复制起始位点；ColE ori为细菌复制起始位点；AlcR乙醇脱氢酶基因启动子的转录激活基因；AlcA为乙醇脱氢酶基因启动子；Ω为烟草花叶病毒RNA翻译增强子；oscT为章鱼碱合成酶基因的终止子；各内切酶位点标记在其后的括号内。载体总长度为8912bp。BDV4是一个植物双元表达目标载体，含有2套DNA重组位点（attR3/attR4和attR1/attR2），分别用于启动子入门克隆和基因入门克隆的重组。载体可用于在特异启动子和乙醇诱导启动子双重调控下表达目标基因，从而实现基因的时空特异，研究基因的时空特异功能；如果构建的基因为反义基因或是含miR173融合的基因特异片段^[20]，则该载体可实现时空特异的基因沉默（前者为基因共抑制，后者为小分子RNA沉默^[20]）；与不同PEC（表2）的组合，可以实现研究不同强度地、时空特异地表达基因对植物表型的调节作用。

实施例4 荧光蛋白标签载体的验证

如图7所示，荧光蛋白CFP、YFP和mRFP的编码序列分别通过克隆***基因克隆载体（pFu79）的多克隆位点XbaI和EcoRI之间，从而获得入门克隆 pFu79-CFP、pFu79-YFP和pFu79-mRFP；然后它们和35S启动子入门克隆pFu76-35S一起与植物表达载体pFu39-2进行LR反应获得荧光蛋白植物表达载体p35S::CFP（图A）、p35S::YFP（图B）以及p35S::mRFP（图C）。荧光蛋白植物表达载体转化拟南芥原生质体，经14小时候温浴后用激光共聚焦显微镜观察采集荧光信号（图D、E、F）。左列为荧光信号图片（图D、E、F分别为CFP、YFP、mRFP），中间列为白光下的图片（BF），右列为左列和中间列图的叠加图（Merge）。比例尺为10微米。结果显示基因入门载体、启动子入门载体以及植物双元目标载体都能正常工作，可以表达各种蛋白。

实施例5 蛋白表达载体及蛋白标签载体验证

如图8所示，GFP编码序列分别***pFu79（无标签、不含任何信号肽的蛋白表达载体）和pFu47（C-端标记3倍MYC标签载体），获得pFu79-GFP和pFu47-GFP入门克隆；这些入门克隆分别与35S启动子入门克隆pFu76-35S一起与植物表达载体pFu39-2进行LR反应，得到GFP以及3XMYC标记的GFP（3XMYC-GFP）的过表达载体p35S::GFP（图A）和p35S::3XMYC-GFP（图B）。过表达载体p35S::GFP和p35S::3XMYC-GFP分别转入拟南芥原生质体，经过14小时温浴后，收集原生质体，然后用2XSDS上样缓冲液煮沸裂解原生质体，离心后上清用于SDS-PAGE电泳，最后用GFP抗体检测表达蛋白（图C上图）。丽春红（Ponceau）染色为蛋白上样对照（图C下图）。结果显示载体能正常工作，蛋白表达正常，MYC标签也正常，检测到的蛋白大小与预测一致。GFP的分子量约为28KDa，3XMYC:GFP分子量约为32KDa。

实施例6 荧光蛋白标签载体的验证

如图9所示，GFP编码序列分别***pFu79（无标签、不含任何信号肽的蛋白表达载体）、pFu60（含N端核定位信号肽NLS）和pFu61（含出C端出核信号肽NES）获得入门克隆pFu79-GFP、pFu60-GFP和pFu61-GFP；这些入门克隆分别与35S启动子入门克隆pFu76-35S一起与植物表达载体pFu39-2进行LR反应，得到植物表达载体p35S::GFP（图A）、p35S::NLS-GFP（图B）和p35S::GFP-NES（图C）。另外，将核定位蛋白AHL22（拟南芥AT-hook基序蛋白22）***pFu45（含有N端mRFP标签）获得pFu45-AHL22入门克隆（图D），后者与35S启动子入门克隆pFu76-35S一起与植物表达载体pFu39-2进行LR反应，得到植物表达载体p35S::mRFP-AHL22（即荧光蛋白mRFP标记的核蛋白AHL22表达载体）。植物表达载体p35S::GFP、p35S::NLS-GFP和p35S::GFP-NES分别与核定位标记载体 p35S::mRFP-AHL22共转化拟南芥原生质体。经14小时候温浴后用激光共聚焦显微镜观察荧光信号。图E为游离GFP在核与细胞质定位图，F为GFP的核定位图，G为GFP的细胞质定位图。E、F、G的第一列为荧光信号图，第二列为核标记蛋白的定位图，第三列为第一列和第二列的重叠图，第四列为白场图。比例尺为10微米。结果显示，各载体工作正常，即GFP蛋白在细胞质和细胞核中广泛分布，NLS-GFP蛋白的分布仅限于细胞核，GFP-NES则分布于细胞质。

实施例7 荧光蛋白标签载体的验证

如图10所示，pFu63经内切酶BglII和BamHI酶切并平齐化末端后自连成Fu62-LUC入门载体。UBI启动子序列***pFu76载体的酶切位点Stu I和Fsp I之间，得到启动子UBI入门克隆Fu76-UBIpro。入门克隆pFu62-LUC和pFu76-UBIpro与pFu39-8一起，通过LR反应，获得乙醇诱导的LUC植物表达载体（图A）。该植物表达载体通过农杆菌EHA105介导转化烟草（Nicotiana benthamiana）叶片（Injected组），以不含载体的空农杆菌为对照（Non-injected组）。转化后第三天，剪下叶片置于1/2MS液体培养基中培养。并在培养液中加入2%(v/v)的乙醇（Ethanol）。温育不同时间（Time，“h”为小时，“+”为加入乙醇后的时间，“-”为加入乙醇前的时间）后，加入荧光素并使其终浓度为100μM。荧光信号通过冷CCD相机（Princeton Instrument）采集。图B最下行图为荧光信号（Signal intensity）示意图，其中强荧光（High）为红色，浅荧光（Low）为蓝色；上排图片为白光下的照片；下排照片为荧光照片。结果显示，乙醇诱导型载体能有效工作。结果显示，乙醇诱导启动子工作正常。在乙醇诱导前为检测到荧光信号，在诱导后明显有荧光信号。荧光信号在诱导后2小时达到峰值，3小时后开始逐渐减弱。

实施例8 荧光蛋白标签载体的验证

如图11所示，SUCROSEH⁺SYMPORTER2(SUC2)启动子分别***pFu76（没有增强子的载体），pFu77（含一个增强子1XEnh的载体）和pFu78（含二个增强子2XEnh的载体），获得启动子入门克隆pFu76-SUC2、pFu77-SUC2和pFu78-SUC2。pFu62载体经内切酶Bgl II和BamH I酶切，并平齐化后自连成GUS入门克隆pFu61-GUS。pFu76-SUC2、pFu77-SUC2和pFu78-SUC2分别与pFu61-GUS组合后，与pFu39-2载体进行LR反应，从而获得植物表达载体pSUCpro::GUS（图A）、pSUCpro:1XEnh::GUS（图B）和pSUC2pro:2XEnh::GUS（图C）。3个植物表达载体分别转化拟南芥COL-0。转化植物用于GUS活性分析（图D），每个载体至少分析3个独立的转化系。WT为非转基因拟南芥对照组。第一列为早期幼苗染色图，第二列为子叶染色图，第三列为晚期幼苗染色图，第四列为第一真叶染色图。no Enh表示没有增强子的载体pFu76-SUC2的转基因植株，1XEnh表示含有一个增强子的载体pFu77-SUC2的转基因植株，2XEnh表示含有两个增强子的载体pFu78-SUC2的转基因植株。结果显示，增强子有效增强启动子活性，GUS染色深度和范围与增强子数量成正相关。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列说明

SEQ ID No.1-8：分别为attL1、attL2、attL3、attL4，attR1、attR2、attR3和attR4重组位点序列。

SEQ ID No.9：基因入门克隆载体GEC序列。

SEQ ID No.10：启动子入门克隆载体PEC序列。

SEQ ID No.11-14：分别为植物双元目的载体BDV1-BDV4序列。

SEQ ID No.15：CFP青色荧光蛋白基因序列。

SEQ ID No.16：mRFP红色荧光蛋白基因序列。

SEQ ID No.17：YFP黄色荧光蛋白基因序列。

SEQ ID No.18：YFPc黄色荧光蛋白基因的C端序列。

SEQ ID No.19：YFPn黄色荧光蛋白基因的N端序列。

SEQ ID No.20：GFP绿色荧光蛋白基因序列。

SEQ ID No.21：LUC荧光素酶基因序列。

SEQ ID No.22：GST谷胱甘肽转移酶基因序列。

SEQ ID No.23：β-葡萄糖苷酸酶基因序列。

SEQ ID No.24-32：分别为MYC标签序列、3XMYC标签序列、HA标签序列、3xHA标签序列、FLAG标签序列、3xFLAG标签序列、StrepII序列、NLS核定位序列、NES出核序列。

SEQ ID No.33：增强子序列。

SEQ ID No.34-38：分别为Spec壮观霉素基因、Kan卡那霉素基因、Amp氨苄青霉素基因、Bar草甘膦抗性基因、Cm氯霉素基因序列。

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Claims

1.可灵活置换调控元件的高效植物表达载体，其特征在于，由三类载体组成：基因入门克隆载体GEC、启动子入门克隆载体PEC以及植物双元目的载体BDV；其中，GEC和PEC分别携带一套位点特异的重组序列SSR，GEC携带的SSR为attL1和attL2，PEC携带的SSR为attL3和attL4，BDV上携带两套SSR位点，其中一套为attR1和attR2，可分别与attL1和attL2进行位点特异的重组，另一套为attR3和attR4，可分别与attL3和attL4进行位点特异的重组，将GEC、PEC和BDV置于同一反应体系中，通过LR反应，即得。

2.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，attL1、attL2、attL3、attL4、attR1、attR2、attR3和attR4的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1-8所示。

3.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述基因入门克隆载体GEC和启动子入门克隆载体PEC的出发载体为pUC19。

4.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述基因入门克隆载体GEC上含有下列元件中的一种或多种：多克隆位点MCS、Ahd I酶切位点、ccdB基因、细菌筛选标记、蛋白标记。

5.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述启动子入门克隆载体PEC上含有下列元件中的一种或多种：多克隆位点MCS、AhdI酶切位点、ccdB基因、细菌筛选标记、顺式调控元件、反式调控元件；优选所述顺式调控元件为1或2个增强子。

6.根据权利要求4所述的植物表达载体，其特征在于，所述多克隆位点MCS含有18个酶切连接位点REL。

7.根据权利要求5所述的植物表达载体，其特征在于，所述多克隆位点MCS含有27个酶切连接位点REL。

8.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物双元目的载体BDV的骨架载体为pGreen和pClean。

9.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物双元目的载体BDV上含有细菌筛选标记和/或两端带有多个酶切连接位点REL的植物筛选标记。

10.权利要求1-9任一项所述植物表达载体的构建方法，其特征在于，将基因入门克隆载体GEC、启动子入门克隆载体PEC以及植物双元目的载体BDV置于同一反应体系中，通过LR反应获得；其中，GEC和PEC分别携带一套位点特异的重组序列SSR，GEC携带的SSR为attL1和attL2，PEC携带的SSR为attL3和attL4，BDV上携带两套SSR位点，其中一套为attR1和attR2，可分别与attL1和attL2进行位点特异的重组，另一套为attR3和attR4，可分别与attL3和attL4进行位点特异的重组。