CN103060298B - 一种头孢菌素c酰化酶突变体及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种头孢菌素C酰化酶突变体及其编码基因与应用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO.4衍生的氨基酸序列。本发明的头孢菌素C酰化酶突变体，在使用该突变体转变CPC→7-ACA酶促反应过程中，转化率达99%，得率达96%。

Description

一种头孢菌素C酰化酶突变体及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术制药领域，具体地涉及一种头孢菌素C酰化酶突变体及其编码基因与应用。

背景技术

近年来，由于头孢菌素类抗生素过敏反应小，对β-内酰胺酶较稳定，具有抗菌谱广、疗效好、毒低、同其他抗生素无交叉耐药性、与青霉素较少产交叉过敏反应等优点，已经成为抗感染最重要的有效药物。研究发现，头孢菌素的抗菌部为其母核7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid,7-ACA)，因此作为合成半合成头孢菌素重要中间体，7-ACA的研究生产显得至关重要。

头孢菌素C（Cephalosporin C,CPC)经化学法或是酶法裂解得到7-ACA。化学法的反应条件较为苛刻，反应过程必须在超低温条件下进行，而且涉及到大量有毒有害的有机溶剂，会带来环境污染等问题。因此，对环境友好的酶法开始成为工业生产的新方向。

目前使用两步酶法制备7-ACA在生产成本和环境保护方面有优势，但是从头孢菌素C到7-ACA的转化率与化学法相比要低，而且DAAO催化反应难以控制。

头孢菌素C酰化酶（CPC acylase）可以直接把头孢菌素C转变成7-ACA（不经过GL-7-ACA等中间产物），利用头孢菌素C酰化酶生产7-ACA的一步酶法既具有化学法的优势（高转化率和纯度）也具有两步酶法的优势（高经济性和环境保护）。但是野生型的头孢菌素酰化酶活力较低，不能胜任工业化生产的需要。本发明提供一种高酶活头孢菌素C酰化酶制备方法。

发明内容

本发明目的是提供一种头孢菌素C酰化酶突变体及其编码基因。

本发明另一目的是提供头孢菌素C酰化酶突变体的制备方法。

本发明又一目的是提供头孢菌素C酰化酶突变体及其编码基因在制备7-氨基头孢烷酸中的应用。

所述头孢菌素C酰化酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO.4衍生的氨基酸序列。所述头孢菌素C酰化酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

与野生型的头孢菌素C酰化酶相比，本发明的头孢菌素C酰化酶突变体具体的氨基酸序列的改变是：K171S（第171位赖氨酸变为丝氨酸），M270W（第270位蛋氨酸变为色氨酸），I314S（第314位异亮氨酸变为丝氨酸）,L535T（第535位亮氨酸变为苏氨酸）。

所述头孢菌素C酰化酶突变体的筛选方法，包括以下步骤:

（1）由产头孢菌素C酰化酶CPCA假单孢杆菌(Pseudomonas sp.）SE83，扩增CPCA的编码基因adfQ；

（2）采用易错PCR技术，以CPCA的编码基因adfQ为模板，扩增获得CPCA突变体基因；

（3）将步骤（2）所得易错PCR产物及表达质粒pET30a用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布至LB（Kan）平板，即得构建好的重组CPCA基因突变库；

（4）将LB（Kan）平板上长出的菌落一一对应转入LB（Kan）平板和LB（Kan、IPTG、CPC-Na）平板上，转板后将平板置37℃恒温培养箱培养，LB（Kan）平板培养8h后取出放入4℃冰箱保存，LB（Kan、IPTG、CPC-Na）平板继续25℃培养36h，然后分别破菌，测定CPCA酶活力，挑选酶活力最强的一株，并测定其基因序列，分别为SEQ ID NO.3所示的基因序列和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

其中，所述头孢菌素C酰化酶具有SEQ ID NO.1所示的基因序列和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明进一步提供含有所述基因的载体。含有所述基因或所述载体的宿主细胞。

本发明的另一方面提供所述头孢菌素C酰化酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

（1）PCR扩增上述头孢菌素C酰化酶突变体基因；

（2）将步骤（1）所得PCR产物连接表达载体pET-30b；

（3）连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，获得表达产物。

其中，步骤（1）中所用引物为：

正向引物：5′-AAA

ACGATGGCGGCCA-3′；

反向引物：

5′-AAA

TCAATGATGATGATGATGATGATGGGCCGGGACGAGTTCCTGCGAG-3′。

其中所述过表达的头孢菌素C酰化酶C-端含有6个组氨酸标签。

进一步，采用亲和层析法分离纯化表达产物，分离纯化包括步骤：

1）以NTA介质填柱，用2倍柱体积的去离子水洗涤，接着加NiSO4溶液至NTA介质结合度达到饱和，用5倍柱体积的NAT-0缓冲液（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl）洗柱；

2）将含有表达的头孢菌素C酰化酶的大肠杆菌破碎菌体离心后得到的上清加入到Ni2⁺-NTA树脂柱中，用5倍柱体积的NAT-1缓冲液（即NAT-0缓冲液含有80mmol/L咪唑）洗涤介质以去除杂蛋白，最后用含有300mmol/L咪唑的NAT-0缓冲液洗脱带有6个组氨酸标签的头孢菌素C酰化酶，并做SDS-PAGE分析。

本发明的另一方面提供一种7-氨基头孢烷酸的制备方法，其是通过在大肠杆菌中表达头孢菌素C酰化酶基因及其突变体，然后对表达的头孢菌素C酰化酶进行分离纯化，在有底物头孢菌素C的情况下，制备7-ACA。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明利用蛋白质亲和色谱技术，利用带有6个组氨酸标签的头孢菌素C酰化酶能与蛋白纯化树脂Ni-NTA层析柱特异性结合的原理，再用含有低浓度的咪唑洗去杂蛋白，保留在Ni-NTA层析柱上的6×His-XK，从而简化6×His-XK分离纯化步骤。

本发明涉及固定化酶技术，带有6个组氨酸标签的头孢菌素C酰化酶与蛋白纯化树脂Ni-NTA层析柱特异性结合，在洗去杂蛋白后，Ni-NTA层析柱保留特异性成分—头孢菌素C酰化酶，用此酶制备7-氨基头孢烷酸。

本发明涉及头孢菌素C酰化酶突变体，在使用该突变体转变CPC—>7-ACA酶促反应过程中，转化率达99%，得率达96%，而野生型转化率只有39%，得率只有32%。

附图说明

图1为PCR技术扩增头孢菌素C酰化酶基因片段，长度2.3kb；

图2为SDS-PAGE分析纯化前后头孢菌素C酰化酶，①为纯化前②为纯化后；

图3为HPLC分析头孢菌素C酰化酶酶促反应；①为头孢菌素酰化酶将头孢菌素C转化为7-氨基头孢烷酸的HPLC图谱；②为头孢菌素CHPLC图谱；③为7-氨基头孢烷酸HPLC图谱。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1头孢菌素C酰化酶基因的获得

以1μg假单孢杆菌(Pseudomonas sp.）SE83基因组DNA为PCR反应模板，按SEQ ID NO.1的序列设计正向引物CPC-F为5′-AAA

ACGATGGCGGCCA-3′；反向引物：5′-AAA

TCAATGATGATGATGATGATGATGGGCCGGGACGAGTTCCTGCGAG-3′。其中斜体字母部分分别为酶切位点NdeI和XhoI。PCR反应在50μL总体积中进行，反应条件为在94℃变性5min后开始循环，然后94℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环后，再于72℃延伸10min。取3μL PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1所示。取100μL PCR产物做琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒的步骤回收目的片段。

实施例2野生型头孢菌素C酰化酶基因表达载体的构建

实施例1中PCR产物经限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切消化后，与用相同内切酶消化的pET-30a质粒（购自Novagen公司）进行连接反应，构建的载体被称为pET-CPCA，然后用连接产物pET-CPCA混合物转化大肠杆菌DH5-a（购自promega公司），并进行序列测定提取转化菌体库的质粒，转化大肠杆菌BL（DE3）菌株（购自Novagen公司）。

实施例3易错PCR扩增头孢菌素C酰化酶基因

利用TaqDNA聚合酶不具有3′-5′校对功能的性质，在高镁离子浓度（5mmol/L-9mmol/L）和不同浓度dNTP的浓度下（1.5mmol/L-3.5mmol/L），来控制随机突变的频率，向目的基因中引入随机突变，构建突变库。实验中最优的突变率约为0.6%。

易错PCR反应体系（100μl）：

PCR程序为：96℃预变性4min，94℃变性1min，56℃退火1min，75℃延伸1min40s，反应45个循环，最后75℃延伸15min。采用胶回收方法回收PCR产物。取5μl产物1%琼脂糖凝胶电泳检验，-20℃保存备用。

实施例4突变体的构建

实施例3中PCR产物（DNA改组后的混合物）经限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切消化后，与用相同内切酶消化的pET-30a质粒进行连接反应，构建的载体被称为pET-CPCAM，然后用连接产物pET-CPCAM混合物转化大肠杆菌DH5-a，构建转化菌体库。

实施例5构建表达突变库及高酶活突变体的筛选

提取转化菌体库的质粒，分别转化大肠杆菌BL（DE3）菌株，获得转化子约500株，构建表达突变体库。挑取突变菌株至含150μlLB/kan培养基的96孔板中30℃、150rpm培养，待OD值达0.6-0.8，加入IPTG（终浓度0.2M），继续培养36h，收集菌体。超声破菌得上清，并进行酶活及蛋白含量测定。检测酶活力最高的菌株，并挑选其克隆，并提取质粒，测定与头孢菌素C酰化酶对应的基因序列。测定的基因序列为SEQ ID NO.3所示，其对应的氨基酸序列为SEQID NO.4所示。

头孢菌素C酰化酶的酶活检测：

（1）离心收集菌体，用0.1mol/L Tris-HC1缓冲液(pH8.0)洗涤后低温超声破碎，离心取适量上清液加入100μl底物头孢菌素C(CPC)(0.1mol/L Tris-HC1缓冲液配制)，并用缓冲液补加至200μl，37℃反应5分钟。

（2）终止条件：取20μl反应液，加入500μl终止液（20%乙酸与0.05M NaOH）。

（3）终止后处理：12000rpm离心5min，取500μl溶液加入样品瓶中。

（4）HPLC进样条件：采用C18柱（4.6mm*150mm），柱温30℃，进样体积10μl，检测吸收峰254nm，进样流量1ml/min。进样时间20min。

（5）流动相：0.1M柠檬酸（每1L加入1g辛烷磺酸钠）88%：乙腈12%，流速为1ml/min，进样体积为4μl，检测吸光度为254nm，C18柱。

（6）酶活单位定义为每分钟催化生成1μmol7-ACA所需的酶量。

表1野生型CPC酰化酶和高酶活CPC酰化酶突变体的酶活

表1为野生型CPC酰化酶和高酶活CPC酰化酶突变体的酶活结果。结果表明，通过易错PCR对CPC酰化酶进行改造，获得酶活力提高了108.6%的突变菌株。

实施例6利用Ni²⁺-层析柱纯化野生型和突变体头孢菌素C酰化酶

以测序验证的pET-CPCA和pET-CPCAM表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞；挑取阳性克隆，接种于含卡那霉素的LB培养基中，30℃振荡培养至约为0.6～0.8时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，30℃诱导36h。接种上述转化后的大肠杆菌BL21于1000mL LB培养基，待OD600值约达2.0时，诱导与上述相同。离心收集菌体，以50mmol/L、pH8.0Tris-HCl缓冲液悬浮（湿菌体与缓冲液的比例为1g湿菌体：5mL缓冲液），在冰浴中以超声波破碎菌体，离心后收集上清。

NTA介质填柱，用2倍柱体积的去离子水洗涤，接着加NiSO₄溶液至NTA介质结合度达到饱和，用5倍柱体积的NAT-0缓冲液（20mMTris-HCl pH7.9，0.5M NaCl）洗柱。将上述收集破碎菌体离心后得到的上清加入到Ni²⁺-NTA树脂柱中，反复加入2～3次后，用5倍柱体积的NAT-1缓冲液（即NAT-0缓冲液含有80mmol/L咪唑）洗涤介质以去除杂蛋白,最后用含有300mmol/L咪唑的上述缓冲液洗脱带有6个组氨酸标签的头孢菌素C酰化酶，并做SDS-PAGE分析和蛋白浓度测定。纯化分析如图2所示。

实施例7一步酶法制备7-ACA

（1）底物浓度20g/L，即1.2gCPC先用30mL0.1MTris-HCl(pH8.0)溶解，用1M NaOH调pH8.0。调pH前后各取一个样，取样20μl，加入500μl终止液。

（2）加入30mL透析处理后酶液，用1M NaOH调节pH使其维持pH8.0，维持反应温度31.5℃±1.5℃。

（3）分别于加入酶液后0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min、40min、50min、60min、1.5h、2h、3h取样，取样20μl，每次取的样立即加入500μl终止液终止，终止液为20%乙酸和0.05M NaOH按2：1配制。

（4）终止后溶液12000rpm离心5min，HPLC检测。测得转化率99%，得率96%。头孢菌素C酰化酶酶促反应结果的如图3所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种头孢菌素C酰化酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.编码权利要求1所述头孢菌素C酰化酶突变体的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求2或3所述基因或权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.权利要求1所述的头孢菌素C酰化酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

（1）PCR扩增权利要求2或3所述头孢菌素C酰化酶突变体基因；

（2）将步骤（1）所得PCR产物连接表达载体pET-30b；

（3）连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，获得表达产物。

7.根据权利要求6的制备方法，其特征在于，所用引物为：

正向引物：5′-AAACATATGACGATGGCGGCCA-3′；

反向引物：

5′-AAACTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGATGGGCCGGGACGAGTTCCTGCGAG-3′。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述头孢菌素C酰化酶突变体采用亲和层析法进行分离纯化。

9.权利要求1所述头孢菌素C酰化酶突变体、权利要求2或3所述基因在制备7-氨基头孢烷酸中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，以头孢菌素C为底物，采用一步酶法制备7-氨基头孢烷酸。

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