CN103059102B - 抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽及其应用，该多肽的序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。本发明提供的多肽能够与HCV表达的E2蛋白进行结合吸附，从而阻断HCV对细胞的进入或转染。通过HCV假病毒（HCVpp）及HCV RNA转染的细胞培养（HCVcc）***检测多肽TD1和TD2对HCV入胞的抑制作用，结果显示TD1和TD2对HCVpp及HCVcc感染细胞具有一定的抑制效果，可以作为HCV的吸附抑制剂或阻断剂。

Description

抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽及其应用

技术领域

本发明属于预防HCV感染的技术领域，涉及抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽及其应用。

背景技术

HCV（丙型肝炎病毒）为黄病毒属，单股正链RNA病毒，由结构蛋白（Core、E1、E2）和非结构蛋白（NS2～NS5B）组成。HCV是丙型肝炎的病原体，急性感染后约75％发展为慢性肝炎，其中约20％结局为肝硬化或肝功能衰竭，并有可能进一步发展为肝癌。目前全世界有1.7亿感染者，我国约有4000万，HCV感染已经成为全球性的社会公共卫生问题之一。

HCV因病毒自身的高变异性，给疫苗研究造成极大困难。现今对HCV感染的治疗仅限于单独使用干扰素（interferon,IFN），或者与广谱抗病毒药物利巴韦林（ribavirin）联合用药，但治疗效果不佳，有一定的副作用，且不同型别对IFN反应性差别较大。多年来研究者一直在寻找防治感染的有效靶点，但还未得到特异有效的抑制剂，使用效果仍在实验或临床研究初步评估阶段。

根据病毒与细胞相互作用的理论，病毒与宿主细胞膜表面受体的特异性结合是病毒感染的始动环节，型别不同的同种病毒在与细胞结合过程中作用分子一般是固定的，阻断二者之间的结合，即可有效地抑制病毒性感染的发生。2003年美国FDA批准抗人免疫缺陷病毒（HIV）的新药T-20（又名Enfuvirtide或Fuzeon

）上市，T-20是穿入抑制剂中第一个上市的药物，含有36Aa，能够与HIV包膜糖蛋白gp41结合，阻止病毒与靶细胞的融合，临床试验证明效果较好，受试者副反应较小（Cervia JS,et al.Enfuvirtide(T-20):a novel human immunodeficiency virus type 1 fusion inhibitor.Clin Infect Dis.2003;37(8):1102-6）。

目前已经确证HCV包膜糖蛋白E1-E2是与宿主细胞受体结合的唯一关键性分子，其中E2被认为是最重要的分子。1998年Pileri等的研究表明人CD81（hCD81）可能是HCV的受体（Pileri,P.et al.Binding of hepatitis C virusto CD81.Science.1998;282:938-941）。随后低密度脂蛋白受体(LDLR)(Agnello V，et al.Hepatitis C virus and other flaviviridae viruses enter cells vialow density lipoprotein receptor.Proc Natl Acad Sci U S A.1999;96:12766-71)、清道夫受体B族Ⅰ型(SR-BI)（Scarselli E,et al.The human scavenger receptorclass B type I is a novel candidate receptor for the hepatitis C virus.EMBO J.2002;21(19):5017-25）、钙离子依赖型(C型)凝集素DC/L-SIGN（PohlmannS,et al.Hepatitis C virus glycoproteins interact with DC-SIGN and DC-SIGNR.JVirol.2003;77(7):4070-80）、Occludin（Ploss A,et al.Human is a hepatitis Cvirus entry factor required for infection of mouse cells.Nature.2009;457:882-6）和细胞连接骨架蛋白Clauding-1（Evans MJ,et al.Claudin-1 is a hepatitis Cvirus coreceptor required for a late step in entry.Nature.2007;446:801-5）等都被证实是HCV的可能受体，目前比较一致的看法是HCV通过包膜糖蛋白E2与CD81特异性结合，使病毒吸附于宿主细胞表面，但由于CD81介导的内吞作用弱，病毒最终进入细胞可能还需其他分子，如LDLR、SR-BI等来辅助，Clauding-1则在病毒穿入过程的后期起到关键作用（Helle F,et al.Hepatitis C virus entry into host cells.Cell Mol.2008;65:100-12）。不同研究小组利用噬菌体肽库法筛选HCV的穿入抑制剂，结果显示具有SPQYWTGPA基序的多肽可以竞争抑制HCV E2与hCD81的结合（Cao J,et al，Phage displayselection on whole cells yields a small peptide specific for HCV receptor humanCD81.Cell Res.2003;13(6):473-9）、具有TSQNIRS基序的多肽可以抑制HCV侵染细胞（Hong HW，et al.Selection of Peptides Binding to HCV E2 andInhibiting Viral Infectivity.J Microbiol Biotechnol.2010;20:1769-71）,这些都显示了以阻断HCV与受体结合为基础设计抗病毒药物的可行性（MeanwellNA.Hepatitis C virus entry:an intriguing challenge for drug discovery.Curr OpinInvestigate Drugs.2006;7(8):727-32.和Pawlotsky JM,et al.The hepatitis Cvirus life cycle as a target for new antiviral therapies.Gastroenterology.2007;132(5):1979-98）。

发明内容

本发明解决的问题在于提供抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽及其应用，筛选能与HCV包膜糖蛋白E2结合的多肽序列，获得以HCV E2为靶位的多肽，以阻断病毒与细胞的结合，抑制病毒侵染细胞。

本发明是通过以下技术方案来实现：

抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽，该多肽的序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

所述的抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽应用于丙型肝炎病毒侵染细胞的吸附抑制剂或阻断剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明以HCV E2蛋白做配基淘筛噬菌体随机7肽库，淘筛能够与HCVE2蛋白特异性结合的噬菌体，在确定其结合特异性之后，获得阳性克隆的序列，以阳性克隆所推导出的序列人工合成多肽，命名为TD1和TD2。

本发明提供的多肽TD1和TD2，能够与HCV表达的E2蛋白进行结合吸附，从而阻断HCV对细胞的进入或转染。通过HCV假病毒（HCVpp）及HCV RNA转染的细胞培养（HCVcc）***检测多肽TD1和TD2对HCV入胞的抑制作用，结果显示TD1和TD2对HCVpp及HCVcc感染细胞具有一定的抑制效果，可以作为HCV的吸附抑制剂或阻断剂。

附图说明

图1-a～图1-b为Western blot分析E2661蛋白的表达情况，其中图1-a为以anti-His标签的单抗作为一抗的检测结果，图1-b为以HCV阳性血清作为一抗的的检测结果；

图2为第三轮噬菌体与HCV E2结合的ELISA检测结果；

图3为随机挑选的噬菌体克隆与HCV E2结合力的ELISA检测结果；

图4为阳性克隆测序后推导的氨基酸序列，其中下划线表示克隆间的相似序列；

图5为荧光素酶活性检测合成多肽对HCVpp侵染细胞的抑制效果；

图6为Western blot法检测HCVcc与多肽孵育后细胞内HCV蛋白的表达；

图7为RT-PCR法检测HCVcc与多肽孵育后细胞内HCV RNA的表达。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、HCV E2蛋白的构建与表达

1.1利用分子克隆的方法构建E2重组质粒

采用PCR扩增HCV的包膜糖蛋白E2的基因（属于1a基因型），并分别在上、下游引物的5’端设计EcoRⅠ、3’端设计HindⅢ酶切位点，将扩增的克隆产物通过构建的酶切位点克隆于pET28a载体（购自Novagen公司，货号69864-3）当中，获得重组载体命名为pET28a-E2661，具体构建方法如下：

首先通过PCR方法扩增HCV E2661基因编码区片段，两端引物两端分别设计EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，PCR产物克隆于pMD18-T中，获得pMD18-E2661；

分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pMD18-E2661和pET28a，胶回收载体和目的片段，T4连接酶14℃连接过夜，连接产物转化（JM109感受态）后涂布含卡那抗性的LB固体培养基，37℃孵箱培养12～14小时，挑选单菌落摇菌提质粒后酶切鉴定，获得阳性克隆，命名为pET28a-E2661；

用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定含目的片段E2661的重组质粒，结果显示E2-661基因克隆到预定的酶切位点上。

1.2 HCV E2在原核细胞中的表达与纯化

将重组质粒pET28a-E2661转化大肠埃希菌（E.coli）BL21（DE3），并以pET28a空载体为对照同时进行转化。从转化有pET28a-E2661及pET28a空载体的BL21（DE3）平板上挑取单菌落于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，次日以1：100接种新鲜的LB培养基，37℃培养约2.5～3h，至A600值约为0.5，以终浓度分别为0.6、0.8和1mmol/L的IPTG诱导，在诱导后3、4、5h时分别取样。离心收集菌体，超声波裂解菌体后，经SDS-PAGE电泳分析E2-661蛋白的表达情况，结果显示目的蛋白大量表达，分子量约32kD，主要以包涵体形式存在，Western blot显示表达蛋白与抗His标签单抗及HCV阳性血清具有良好的反应原性。

由于之后噬菌体随机肽库的筛选需要，还需对所表达蛋白进行了纯化，将原核表达产物过镍离子（Ni-NTA）亲和层析柱，重组蛋白E2-661在洗脱液（elution buffer）中含量最多，从而获得了纯化的目的蛋白；

对纯化的重组蛋白E2-661进行Western blot检测（分别以anti-His标签的单抗作为一抗、以HCV阳性血清作为一抗进行表达检测和抗原性检测）和SDS-PAGE分析，如图1所示的Western blot检测结果：

图1-a为anti-His标签检测，其中泳道1：空载体转化菌IPTG诱导；泳道2：pET28a-E2661转化菌经IPTG诱导；泳道3：pET28a-E2661转化菌IPTG诱导后超声裂解沉淀；泳道4：pET28a-E2661转化菌未经IPTG诱导，只有泳道2、3具有相应的条带显示，超声处理的结果显示经IPTG诱导之后，目的蛋白主要存在于裂解沉淀中，说明该蛋白以包涵体形式存在。

图1-b为目的蛋白抗原性检测，其中泳道1：pET28a-E2661转化菌经IPTG诱导；泳道2：pET28a-E2661转化菌IPTG诱导后超声裂解沉淀；泳道3：pET28a-E2661转化菌未经IPTG诱导，泳道1、2中显示了相应的预期条带，这表明所纯化的重组蛋白能够与阳性血清反应，具有相应的抗原性。

以上分析结果显示所纯化的重组蛋白HCV E2-661纯度较好，能够用于后续噬菌体随机肽库的筛选。

2、利用噬菌体肽库筛选与HCV E2-661蛋白特异结合的多肽

具体采用Ph.D.-7噬菌体随机展示7肽库，购自New England Biolabs公司（货号E8100S），肽库库容量为2.8×10⁹，氨基酸分布无明显偏移，以20⁷（1.28×10⁹）计算，几乎涵盖了绝大多数7肽的氨基酸组合。

利用噬菌体肽库的筛选具体包括以下步骤：

1）淘筛噬菌体7肽库

以纯化的HCV E2-661包被35mm塑料培养皿，孵育后加入噬菌体，筛选方法按试剂盒提供的操作手册进行下一轮筛选，共进行3轮。HCV E2的浓度及与噬菌体的结合时间依次递减，蛋白浓度由第一轮的100μg降至第2、3轮的50μg及20μg，与噬菌体的结合时间依次为60min、30min和20min。经3轮筛选后，能够与HCV E2-661结合的噬菌体得到了有效的富集。每轮筛选时噬菌体的投入与产出量及富集效果如表1所示：

表1 每轮筛选时噬菌体的投入与产出量及富集效果

Round	Input	Output	Output/Input
				1	2.8×1011	5.2×104	1.9×10-7
2	1.9×1011	3.2×105	1.7×10-6
				3	2.1×1011	5.8×106	2.8×10-5

2）噬菌体与HCV E2-661蛋白结合的特异性鉴定

以HCV E2包被ELISA板，同时还包被BSA、HCV非结构蛋白NS3与NS5B作为阴性对照，4℃过夜，分别加原始库及第3轮淘筛后的噬菌体结合1h，再加入HRP-anti-M13mAb结合后以OPD显色，测定A490值。NS3与NS5B都是经原核表达后纯化的蛋白，都带有6×His标签，可以同时检测所筛选到的噬菌体是否和His标签有结合。

检测结果如图2所示，以原始库噬菌体的结合作为对照，原始库噬菌体与4种蛋白的结合基本相当，但是第三轮筛选的噬菌体与4种蛋白的结合出现了明显的差异：与HCV E2发生结合的的第三轮筛选的噬菌体要远远高于与其他蛋白的结合，这表明所筛选到的第三轮噬菌体仅与HCV E2发生特异性结合。

3）阳性克隆的挑选与序列分析

从第三轮筛选的噬菌体中随机挑取28个噬斑，ELISA法检测他们与HCVE2-661的结合特异性，检测结果如图3所示，可以看出有5个克隆（NO.7、11、17、18和26）与HCV E2-661的结合力明显高于其他克隆，从而将此5个噬菌体克隆分别接种1.5mL LB液体培养基，于37℃振摇7h，用M13噬菌体单链DNA抽提试剂盒提取单链DNA。

对提取的DNA测序后做序列分析，并推导其氨基酸序列。氨基酸序列的结果如图4所示，其中NO.11、17和18三个克隆所对应的多肽C11、C17和C18的氨基酸序列相似度最高，具有WPW×××R的基序（其中×代表随机氨基酸，但以H居多），NO.7克隆所对应的多肽C7的氨基酸序列与该基序也较为相似，NO.26克隆所对应的多肽C26的氨基酸序列与以上克隆无相似性序列。将这些多肽序列在线通过BLAST分析，没有找到与已知蛋白的同源性序列。

3、筛选的多肽抑制效果的评价

1）多肽合成

因C11、C17和C18的氨基酸序列相似度最高，C7与上述序列也部分相似，都呈现了WPW×××R的基本基序，同时考虑到噬菌体克隆与HCVE2-661蛋白的结合力鉴定的结果，NO.18在该4个克隆中结合力最高，因此将以图4中C18与C26所显示的序列进行人工合成，分别命名为TD1(WPWHNHR)和TD2(AHPSMRA)，并同时合成一条无关多肽（Con）作为阴性对照。

2）应用假病毒颗粒评价多肽的抑制效果

a.包装有HCV包膜糖蛋白的假病毒颗粒的获得

将带有荧光素酶报告基因的pNL4-3.Luc.R-E载体，与重组质粒pcDNA3.1-E1-E2共转染人胚肾HEK-293T细胞，获得了可表达HCV E1-E2蛋白和荧光酶报告蛋白的假型病毒（HCVpp）。

HCVpp进入细胞的机制与天然HCV相似，虽然感染力比天然HCV低，但是因为带有荧光素酶基因，所以，若HCVpp进入细胞，受感染的细胞数量就可通过高敏感的荧光分析而被测定，因而在HCV受体研究中被广泛使用。

b.通过检测荧光素酶活性反映多肽阻断效果

假病毒颗粒HCVpp分别与TD1、TD2、Con多肽（各60μM）于室温下孵育1h后，感染人肝癌细胞Huh7.5细胞，48h后通过检测Huh7.5细胞内荧光素酶活性的检测假病毒颗粒HCVpp的转染效果，进而鉴定TD1与TD2多肽的阻断效应。

荧光素酶活性检测合成多肽对HCVpp侵染细胞的抑制效果的结果如图5所示，其荧光酶水平直接反应其假病毒颗粒HCVpp的感染水平，可以看出作为对照的假病毒颗粒HCVpp感染组（N）与con孵育HCVpp感染组（con），两者感染细胞的效果相当，而与TD1多肽、TD2多肽孵育后的HCVpp感染效果明显降低，这表明TD1多肽、TD2多肽进行孵育之后，可阻断E2所介导的细胞转染，从而降低HCVpp的转染效率，在一定程度上阻断HCVpp进入Huh7.5细胞。

3）应用感染性病毒颗粒评价多肽的抑制效果

利用感染性RNA技术，将含有HCV全长cDNA的质粒pFL-J6/JFH作体外转录，用病毒RNA转染肝癌细胞系Huh7.5，病毒RNA发生复制，蛋白稳定表达，并获得了病毒颗粒（HCVcc）。

HCVcc分别预先与TD1、TD2、Con多肽（各60μM）于室温下孵育1h，再感染Huh7.5细胞，48h后通过western blot方法检测细胞内HCV相关蛋白（HCV Core和HCV NS5A）的表达情况，通过RT-PCR法检测细胞内的HCVRNA的表达情况。

western blot检测结果如图6所示：其中TD1表示多肽TD1与HCVcc孵育后感染细胞；TD2表示多肽TD2与HCVcc孵育后感染细胞；Con表示无关多肽与HCVcc孵育后感染细胞；N表示HCVcc感染细胞。可以看出经TD1、TD2孵育后的HCVcc所感染的细胞的HCV Core和HCV NS5A的表达量与Con和N对照相比，均有所下降。

RT-PCR检测结果如图7所示：其中TD1表示多肽TD1与HCVcc孵育后感染细胞；TD2表示多肽TD2与HCVcc孵育后感染细胞；Con表示无关多肽与HCVcc孵育后感染细胞；N表示HCVcc感染细胞。可以看出经TD1、TD2孵育后的HCVcc所感染的细胞的HCV RNA的表达量与Con和N对照相比，均有所下降。

目标条带的颜色深浅代表了蛋白或核酸的表达量的多少，Western blot检测结果与RT-PCR检测结果一致，均表明TD1多肽、TD2多肽进行孵育之后，可有效降低HCVcc的感染效率，在一定程度上阻断HCVcc进入Huh7.5细胞。

Claims (2)

1.抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽，其特征在于，该多肽的序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽在制备丙型肝炎病毒侵染细胞的吸附抑制剂或阻断剂中的应用。

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