CN103052707A - 人类多能细胞的皮层生成 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过在刺激视黄素信号化并且抑制TGFβ超家族信号化的条件下培养细胞，用于在人多能细胞如iPS细胞中体外诱导皮层生成的方法。这在产生皮层神经元，尤其是患者特异性皮层神经元；模型化青少年和成人发作的神经疾病；以及治疗的开发中可以是有用的。
Description
技术领域
本发明涉及多能人类细胞中皮层生成（皮质生成，corticogenesis）的体外诱导。
背景技术
大脑皮层（皮质，cortex）是哺乳动物中枢神经***的综合和执行中心，构成了超过四分之三的人类大脑（Mountcastle,V.B.The Cerebral Cortex,(Harvard University Press,Cambridge,Mass.1998）。大脑皮层的疾病是儿童和成人发病和死亡的主要原因，范围从发育病症如癫痫症和自闭症到生命晚期的神经变性病症，如阿尔茨海默病。已对啮齿动物模型的大脑皮层发育、功能、和疾病的基本特征进行了大量研究。然而，灵长类动物，尤其是人类大脑皮层在很多方面中与啮齿动物不同（Finlay,B.L.et al.Science268,1578-84(1995)）。除了大脑皮层的尺寸相对于神经***的其他部分显著增长之外，这些还包括其发育中的干细胞群的尺寸、复杂性、和性质（Rakic,P.Nat Rev Neurosci10,724-35(2009)），上层多样性、后生的（laterborn）神经细胞类型、和深层中灵长类动物特异性神经元类型的存在的增加（Hill,R.S.et al，Nature437,64-7(2005)）。以受控的、确定的方式由胚胎干细胞和诱导的多能干细胞（统称为多能干细胞，PSC）进行的模型化人类皮层发育的方法具有相当大的潜力，使得能够功能性研究人类皮层的发育、电路形成、和功能，以及构建皮层疾病体外模型。考虑到大脑皮层中的许多主要疾病都是突触功能的疾病，该领域的目标是产生极为类似于在体内发现的皮层网络的体外皮层网络。
大脑皮层含有两种主要类型的神经元：约80%为兴奋性的、谷氨酸能（glutamatergic）投射神经元，其由皮层干细胞和祖细胞产生，而其余20%为在皮层外部产生且在发育期间移行的GABA能（GABAergic）中间神经元（Wonders,C.P et al.Nat Rev Neurosci7,687-96(2006)）。形成成人皮层的六层的谷氨酸能投射神经元以固定的时间顺序形成，首先产生深层神经元而最后产生上层神经元。在小鼠中，该过程花费约6天，而在人类皮层神经形成中持续超过70天（Caviness,V.S.,Jr et al Trends inNeurosciences18,379-83(1995)）。产生后，不同类型的皮层投射神经元在皮层的各层之间形成标准局部微电路（microcircuit）（Douglas,R.J.et al.Annu Rev Neurosci27,419-51(2004)），以及形成较长程（longer-range）的内皮层连接和外皮层连接，包括皮层脊髓束投射、丘脑皮层和胼胝体投射（Fame,R.M.,et al Trends in neurosciences34,41-50(2011);Lopez-Bendito,G et al Nature reviews.Neuroscience4,276-89(2003)）。
尽管已显示小鼠ES细胞能够通过抑制音猬因子（sonic hedgehog）在神经诱导期间的信号化（信号发出，signalling）而在体外分化为大脑皮层神经元（Bibel,M.et al.Nat Neurosci7,1003-9(2004);Gaspard,N.et al.Nature455,351-7(2008);Eiraku,M.et al.Cell Stem Cell3,519-32(2008)），但是为模型化皮层发育做出的努力的共同问题是当深层产生时，已获得先生的（early-born）神经元，而皮层神经形成的完整程序尚未由在培养物中的多能干细胞进行。对于来自ES细胞的人类皮质生成尤其如此，迄今为止尚未以确定的、有力的、和有效的方式达到（Au,E.et al.Cell stem cell3472-4(2008)）。已经提出这种失败的一个原因是由ES细胞的定向分化没有再生成在体内皮层中发现的复杂干细胞/祖细胞群（Hansen,D.V.et al.Neuron70,645-60(2011)）。
尽管神经上皮室带区（室区，ventricular zone）细胞是大脑皮层的初级干细胞群/祖细胞群，但是在小鼠、貂、和人类中也识别了至少两种次级祖细胞群、底部祖细胞/室下区细胞、以及外室下区（oSVZ）细胞。所有这三组干细胞/祖细胞显示产生投射神经元（Hansen,D.V.,et al.Nature464,554-561(2010);Wang,X.,et al.Nature neuroscience14,555-61(2011);Fietz,S.A.et al.Nat Neurosci13,690-9(2010)），并且已经提出灵长类动物，尤其是人类大脑皮层中oSVZ细胞的数目增加，是人类皮层尺寸增加以及上层神经元类型多样化的关键贡献因素。
尽管之前已经示出了在人类ES细胞的团聚体培养物中产生一些类型的皮层神经元（US20100166720A1;Eiraku,M.,et al.Cell stem cell3,519-532(2008);Li,X.J.,et al.Development136,4055-4063(2009)），但是并没有显示音猬因子的抑制对在单层培养物中人多能干细胞的皮质生成的作用。神经干细胞和祖细胞尚未利用胚状体中间体（intermediate）从人ES细胞分化（WO2007142449）。
发明内容
本发明涉及开发一种诱导人多能细胞在体外以高效经受皮层生成的方法。该方法，例如，在皮层神经元，尤其是患者特异性的皮层神经元的产生；青少年和成人发作神经疾病的模型化；以及对这些疾病的治疗的开发中可以是有用的。
本发明的一个方面提供了一种用于体外诱导人多能细胞皮层生成的方法，包括：
（i）提供经分离的人多能干细胞群，
（ii）在刺激视黄素信号化以及抑制TGFβ和BMP信号化的培养条件下培养该群，
以便所述群分化为皮层干细胞和祖细胞。
例如，利用常规技术冷冻，可以将皮层干细胞和祖细胞保持在培养物中、储存，或将其用于本文所述的治疗或其他应用。
在一些实施方式中，皮层干细胞和祖细胞可以分化为皮层神经元。该方法可以进一步包括：
（iii）使得皮层干细胞和祖细胞的群能够分化为大脑皮层神经元。
人多能干细胞是非特异化的、未分化的细胞，其自身能够复制或自我更新并发育为全部三个原始胚层（即，外胚层、中胚层、和内胚层）的特异化细胞，但是不能够发育为全部的胚胎和胚胎外组织，包括滋养外胚层（即，非全能的）。人多能干细胞不定向为神经谱系（neural lineage）。
人多能细胞包括胚胎干细胞（ES）和非胚胎干细胞，非胚胎干细胞包括胎儿和成人成体干细胞和由非多能细胞来源的干细胞。
适合的ES细胞可以获自培养的hES细胞系，例如Edi2、H9、或hSF-6。在Thomson JA et al Science282:1145-1147(1998);Reubinoff et al.NatBiotechnol18:399-404(2000);Cowan,C.A.et al.N.Engl.J.Med.350,1353-1356(2004),Gage,F.H.,et al.Ann.Rev.Neurosci.18159-192(1995);and Gotlieb(2002)Annu.Rev.Neurosci25381-407);Carpenter et al.StemCells.5(1):79-88(2003)中描述了适合的人胚胎干细胞的其他实例；还参见：可在线获得的NIH干细胞登记表。
在Klimanskaya,I.et al.Lancet365,1636-1641(2005);和Ludwig,T.E.et al.Nat.Biotechnol.24,185-187(2006)中描述了潜在的临床级hESC。
在另一种实施方式中，人多能细胞可以是诱导的多能（iPS）细胞，其来源于非多能细胞。下文中详细描述了iPS细胞。
人多能干细胞可表达以下多能性相关标记物中的一种或多种：Oct4、Sox2、碱性磷酸酶、SSEA-3、Nanog、SSEA-4、和Tra-1-60。优选地，人多能干细胞表达Oct4。
人多能干细胞不表达神经细胞标记物，如Tuj1。
可以利用标准技术鉴定细胞表达的标记物（包括多能性相关的标记物），如PCR、蛋白质印记、免疫细胞化学、和原位杂交。
在本方法中使用的人多能细胞群可以通过利用常规技术由多能细胞系培养细胞来获得（Vallier,L.et al Dev.Biol.275,403-421(2004),Cowan,C.A.et al.N.Engl.J.Med.350,1353-1356(2004),Joannides,A.et al.StemCells24,230-235(2006)Klimanskaya,I.et al.Lancet365,1636-1641(2005),Ludwig,T.E.et al.Nat.Biotechnol.24,185-187(2006)）。例如，适合用于本方法的人多能细胞可以在培养皿中在饲养细胞层上常规培养，这样的饲养细胞如在适合的密度（例如105至106个细胞/60mm培养皿）下或在含有饲养物条件培养基或确定培养基（defined medium）的合适基板上的经照射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。本方法中使用的人多能细胞可以通过酶促或机械方法传代。适合用于人多能细胞的培养基包括SC培养基（Knockout杜尔贝科改良伊格尔培养基（KO-DMEM），其用以下各项补充：20%的血清替代物、1%的非必需氨基酸、1mM的L-谷氨酰胺、0.1mM的β-巯基乙醇和4ng/ml至10ng/ml的人bFGF）和ES培养基（DMEM/F12，其用以下各项补充：20%的knockout血清替代物（knockout serumreplacement，KSR）、6ng/ml的FGF2（PeproTech）、1mM的L-Gln、100μm的非必需氨基酸、100μM的2-巯基乙醇、50U/ml的青霉素和50mg/ml的链霉素）。
用于诱导体外皮层生成的人多能干细胞的群优选基本上不含一种或多种其他细胞类型。如上文所述，人多能细胞通常在MEF饲养细胞上培养和保持。人多能细胞可以通过任何适合的技术与饲养细胞分离。例如，可以在凝胶上简单培养该细胞（例如，1小时），然后将未粘附至凝胶的人多能细胞与粘附至凝胶的MEF分离。
如下文所述，这避免了胚状体的形成。
在分离之后，可以在适合的培养基上在单层中培养人多能细胞，例如用10ng/ml的FGF2补充的上述SC和ES培养基。优选地，该培养基含有Rho相关含卷曲螺旋的蛋白激酶（ROCK）抑制剂（例如，10μM），以减少人多能细胞解离至单细胞悬液中时的细胞死亡（Olson,M.F.(2008).Curr Opin Cell Biol20:242-8;Watanabe,K.et al.(2007)Nat Biotechnol25:681-6,US2010/0009442）。适合的ROCK抑制剂是本领域公知的，并且包括(+)-4-[1(R)-氨基乙基]-N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)苯甲酰胺二盐酸盐水合物；(1R,4r)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)环己烷甲酰胺二盐酸盐；和N-(2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-甲酰胺（均可获自Stemgent USA或Calbiochem USA）。
单层是在基板（如培养板的表面）上细胞的单层。人多能细胞的单层培养物使得能够进行受控的、确定的分化，并且防止形成胚状体。胚状体是由干细胞的不可控分化形成的团聚体，该干细胞由各种类型的分化细胞组成，并且该团聚体由必须被进一步纯化的神经细胞形成。单层还可以使得培养物长期成像。
优选地，如本文所述，人多能干细胞在单层培养物中培养和分化，而不形成胚状体。
在体外皮层生成开始前，可以扩增经分离的人多能干细胞的群。例如，可以在刺激FGF2信号化的条件下在单层中培养人多能干细胞。在一些实施方式中，可以在用FGF2（例如5至20ng/ml的FGF2，优选10ng/ml）补充的培养基中培养细胞。适合的培养基包括上述的SC和ES培养基，其可以是MEF条件培养基并且用FGF2补充的。
可以采用任何哺乳动物FGF2，优选人成纤维细胞生长因子2（FGF2）（NCBI GeneID:2247，核酸序列NM_002006.3GI:41352694，氨基酸序列NP_001997.4GI:41352695）。FGF2可以利用常规重组技术产生或从供应商处获得（例如R&D,Minneapolis,MN,USA）。
优选地，在单层培养物中提供用于开始体外皮层生成的人多能干细胞的群。用于人多能细胞单层培养的方法是本领域公知的。
优选地，当单层培养物中的人多能细胞为至少85%、至少90%、或至少95%汇合（即，至少85%的培养器皿表面被细胞覆盖）时，将诱导皮层生成。
如上文所述，皮层生成开始于在刺激视黄素信号化和抑制TGFβ超家族信号化的培养条件下培养人多能干细胞。
TGFβ超家族信号化是由SMAD蛋白（例如SMAD1-3、SMAD5、和SMAD9）介导的，并且可以通过抑制人多能细胞中的TGFβ和BMP信号化来抑制（Chambers,S.M.,et al Nat Biotechnol27,275-280(2009),Schmierer et al Nat Rev Mol Cell Biol.2007Dec;8(12):970-82）。TGFβ-SMAD信号化可以通过神经诱导培养基中的TGFβ和BMP信号化抑制剂来抑制。
优选地，在神经诱导开始后，持续保持视黄素信号化的刺激以及TGFβ和BMP信号化的抑制，直至人多能细胞群分化为皮层干细胞和干祖细胞。
例如，可以在包含一种或多种刺激或促进细胞中视黄素信号化且抑制TGFβ和BMP信号化的因子的神经诱导培养基中培养该细胞。
神经诱导培养基可以包含刺激人多能干细胞中的视黄素信号化的视黄素。适合的视黄素是本领域公知的并且包括视黄酸、维生素A（全反式视黄醇）、以及视黄醇乙酸酯。例如，该神经诱导培养基可以包含0.01μM至10μM的全反式视黄醇，典型地为0.5μM。
用于刺激多能细胞中视黄素信号化的技术是本领域公知的（参见，例如WO2008071960A2、US20070224650A、US7632679B2、WO2008060792A2、WO2009058451A2、US20060073587、和WO2005021720）。
TGFβ超家族信号化可以受到神经诱导培养基中的一种或多种TGFβ-SMAD信号化抑制剂的抑制。TGFβ-SMAD信号化抑制剂可以包括TGFβ信号化抑制剂和BMP信号化抑制剂。
神经诱导培养基可以包含TGFβ信号化抑制剂。TGFβ信号化通过SMAD2和SMAD3介导的途径发生并且可以由TGF-β1肌动蛋白受体样激酶（ALK）ALK-4、ALK-5、和ALK-7介导（Schmierer et al Nat Rev Mol CellBiol.2007Dec;8(12):970-82）。TGFβ信号化抑制剂可以抑制SMAD2和SMAD3介导的信号化。
适合的TGFβ信号化抑制剂包括ALK4、ALK5和ALK7受体的抑制剂，如2-(5-苯并[1,3]二氧杂戊环烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐（SB-505124）；4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺（SB431542;Tocris Bioscience USA;StemgentUSA）、和3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代酰胺（A83-01;Tocris Bioscience USA;Stemgent USA）。
SB431542是一种TGF-β1肌动蛋白受体样激酶（ALK）的抑制剂。其是选择性的并且是ALK-4、ALK-5和ALK-7的有效抑制剂，因而阻断BMP介导的SMAD2/3磷酸化（Laping,N.J.et al.,Mol.Pharmacol.,62:58-64(2002)）。
例如，神经诱导培养基可以包含5μM至20μM的SB431542，例如约10μM。
用于抑制人多能细胞中TGFβ信号化的方法是本领域公知的（参见，例如US7250294、US7560281、和WO20100638481；Chambers,S.M.,et alNat Biotechnol27,275-280(2009)）。
神经诱导培养基可以包含BMP信号化抑制剂。BMP信号化通过SMAD1、SMAD5、和SMAD8介导的途径发生并且可以由TGF-β1肌动蛋白受体样激酶（ALK）ALK-1、ALK-2、ALK-3和ALK-6介导（Schmiereret al Nat Rev Mol Cell Biol.2007Dec;8(12):970-82）。BMP信号化抑制剂可以抑制SMAD1、SMAD5、和SMAD8介导的信号化。
适合的信号化抑制剂可以通过人多能干细胞中的SMAD1、SMAD5、和SMAD8（也称为SMAD9）介导的途径抑制信号化。BMP信号化由BMPI型受体ALK1、ALK2、ALK3、和ALK6介导并且适合的BMP信号化抑制剂包括ALK1、ALK2、ALK3、和ALK6受体。
适合的BMP信号化抑制剂是本领域公知的（Cuny et al(2008)BioorgMed Chem Lett184388-4392;Yu et al(2008)Nat Med141363-9）并且包括头蛋白（noggin）、多索***（dorsomorphin）、卵泡抑素（follistatin）、抑制素、硬骨素（sclerostin）、脊索发生素（chordin）、CTGF、卵泡抑素、格姆林（gremlin）、和4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉（LDN-193189Stemgent USA）。
在一些实施方式中，BMP抑制剂可以是头蛋白。头蛋白是一种分泌的同型二聚体糖蛋白，其结合信号化蛋白的转化生长因子β（TGF-β）超家族成员并使其失活，这样的信号化蛋白如，骨形态发生蛋白4（BMP4）（Groppe et al Nature420,636-642）。
可以使用任何哺乳动物的头蛋白。例如，人类头蛋白（NOG）（NCBIGeneID:9241,核酸序列NM_005450.4GI:189339247,氨基酸序列NP_005441.1GI:4885523）或小鼠头蛋白（Nog）（NCBI18121,核酸序列NM_008711.2GI:158187522氨基酸序列NP_032737.1GI:7110675）可以利用常规重组技术生产或从供应商（例如R&D Systems,Minneapolis,MN,USA）获得。
例如，神经诱导培养基可以包含250ng/ml至1000ng/ml，例如约500ng/ml的头蛋白。
在一些实施方式中，头蛋白可以连接至其他部分，例如，可以采用嵌合的头蛋白分子，如小鼠头蛋白Fc嵌合体（R&D systems）。
在其他实施方式中，BMP抑制剂可以是多索***（6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶二盐酸盐）。多索***通过抑制BMP I型受体ALK2、ALK3、和ALK6发挥作用，从而阻断BMP介导的SMAD1/5/8磷酸化。多索***抑制胚胎发生所需的BMP信号和铁代谢（Yu et al Nat Chem Biol4:33-41）。多索***可以从供应商（例如TocrisBioscience USA;Stemgent USA）处获得。
用于抑制多能细胞中BMP信号化的方法是本领域公知的（参见，例如WO2008026198A2;Chambers,S.M.,et al Nat Biotechnol27,275-280(2009)）。
在一些优选的实施方式中，神经诱导培养基中的一种或多种TGFβ-SMAD信号化抑制剂抑制SMAD2/3介导的信号化和SMAD1/5/8介导的信号化。例如，如上文所述，该神经诱导培养基可以包含TGFβ信号化抑制剂（如SB431542）和BMP信号化抑制剂（例如头蛋白）。
该神经诱导培养基可以进一步包含胰岛素。这可以，例如，改善皮层干细胞和祖细胞以及神经元的存活率。例如，神经诱导培养基可以包含1μg/ml至10μg/ml的胰岛素，例如约5μg/ml。
如上文所述，优选地，在抑制TGFβ超家族（包括TGFβ和BMP）信号化的条件下培养人多能细胞。这可以通过抑制TGFβ和BMP信号化途径来实现，并且致使人多能细胞中的全部SMAD信号化的抑制，例如由SMAD1至SMAD3、SMAD5、和SMAD9介导的信号化。
因此，如上文所述，适合的神经诱导培养基可以包含视黄素、TGFβ信号化抑制剂、BMP抑制剂、和胰岛素。
神经诱导培养基还可以包含标准神经细胞培养试剂。例如，该培养基可以包含基础神经培养基，如用N2补充的DMEM/F12（GIBCO）（Bottenstein et al1979PNAS USA761514-517;GIBCO）或用B27补充的Neurobasal（Invitrogen）（GIBCO/Invitrogen）。
其他适合的基础神经培养基和补充物是本领域公知的和/或可从商业来源获得。例如，可以使用NS21补充物（Chen et al Journal of NeuroscienceMethods171(2008)239–247）代替B27。
在一些实施方式中，可提供视黄素、TGFβ信号化抑制剂、BMP抑制剂、和胰岛素中的一种或多种作为标准培养基的部分。例如，可以提供视黄酸作为B27培养基补充物的组分。
该基础神经培养基可以根据需要用抗生素如链霉素和青霉素、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、和还原剂如巯基乙醇补充。
适合的神经诱导培养基可以基于支持神经诱导、神经生成、和神经元分化的标准培养基。3N培养基可以包含含有N2和含有B27培养基的1:1混合物，其中，含N2的培养基包含用N2（GIBCO）、胰岛素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、青霉素、和链霉素补充的MEM/F12（GIBCO），而含B27的培养基包含用B27补充物（GIBCO）、L-谷氨酰胺、青霉素、和链霉素补充的neurobasal（Invitrogen）。
通常，N2培养基可以包含5μg/ml的胰岛素、1mM的L-谷氨酰胺、100μm的非必需氨基酸、100μM的2-巯基乙醇、50U/ml的青霉素、和50mg/ml的链霉素，而B27培养基可以包含200mM的谷氨酰胺、50U/ml的青霉素、和50mg/ml的链霉素。
上文描述的3N培养基可以用TGFβ和BMP信号化抑制剂补充，以产生神经诱导培养基。
哺乳动物细胞的培养是本领域公知的（参见，例如Basic Cell CultureProtocols,C.Helgason,Humana Press Inc.U.S.(15Oct2004)ISBN:1588295451；Human Cell Culture Protocols(Methods in Molecular MedicineS.)Humana Press Inc.,U.S.(9Dec2004)ISBN:1588292223；Culture ofAnimal Cells:A Manual of Basic Technique,R.Freshney,John Wiley&SonsInc(2Aug2005)ISBN:0471453293；Ho WY et al J Immunol Methods.(2006)310:40-52,Handbook of Stem Cells(ed.R.Lanza)ISBN:0124366430）。培养基和其成分可以从商业来源获得（例如Gibco,Roche,Sigma,Europabioproducts,R&D Systems）。
可以采用标准哺乳动物细胞培养条件，例如37°C，21%的氧、5%的二氧化碳。优选每两天更换培养基并通过重力使细胞沉降。方便地，在涂覆有细胞外基质组分（如MatrigelTM）的表面上培养细胞。
可以在神经诱导培养基中培养人多能干细胞5天以上、10天以上、或15天以上。例如，可培养细胞至多达15天、至多达20天、或至多达25天，通常为8至11天，以使得人多能细胞能够转化为皮层干细胞以及干细胞和祖细胞。
在如上文所述的神经诱导培养基中培养人多能细胞诱导该细胞分化为皮层干细胞和祖细胞。例如，在神经诱导培养基中培养之后，群中的85%以上、90%以上、95%以上、或98%以上的人多能干细胞可以已分化为皮层干细胞和祖细胞。
优选地，在分化开始的14天内，群中的95%以上的人多能干细胞可以已分化为皮层干细胞和祖细胞。
皮层干细胞和祖细胞是未分化的人多能干细胞的子代或后代，并且相比于原始干细胞具有定向的（committed）皮层表现型和降低的分化潜能。例如，皮层干细胞和祖细胞能够进一步分化为任意种类或层状命运（laminar fate）的大脑皮层神经元，例如，大脑皮层第1-6层中任一层的神经元。
如本文所述的，由人多能细胞的神经诱导产生的皮层干细胞和祖细胞的群包括可以繁殖并且保留多能性的皮层细胞（皮层干细胞）和具有较多限制潜能的不必能够自我更新的细胞（祖细胞）。
皮层干细胞和祖细胞可以来自培养物中的神经上皮莲座（玫瑰花形物，rosette）。这些神经上皮莲座在体内可以显示出皮层神经上皮的一种或多种特征，如顶-底极性（apico-basal polarity）；顶部有丝***（apicalmitoses）和大量的室下有丝***（abventricular mitose）。皮层干细胞和祖细胞的群可以包括顶部（apical）皮层干细胞和祖细胞以及底部皮层干细胞和祖细胞。
皮层干细胞和祖细胞可以表达Pax6。皮层干细胞和祖细胞也可以表达FoxG1、Emx1、Emx2、和COUP-TF1中的一种或多种。
皮层干细胞和祖细胞的群的子集（即，底部细胞）也可以表达Tbr2。
皮层干细胞和祖细胞不表达多能性相关的标记物，如Oct4、Sox2、碱性磷酸酶、SSEA-3、Nanog、SSEA-4、和Tra-1-60。
该方法可以包括监测或检测群中的细胞中的一种或多种皮层干细胞和祖细胞标记物和/或一种或多种多能细胞标记物的表达。这使得当群培养在神经诱导培养基中时，其分化或神经诱导程度能够确定。
通过本方法产生的皮层干细胞和祖细胞可以基本上不含其他细胞类型。例如，在神经诱导培养基中培养之后，细胞群可以含有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上的皮层干细胞和祖细胞。
优选地，皮层干细胞和祖细胞的群完全不含其他细胞类型，不需要纯化。
在如上文所述的神经诱导培养基中培养之后，可以将皮层干细胞和祖细胞的群从神经诱导培养基中分离和/或除去。适合的技术是本领域公知的。
在一些实施方式中，可以扩增皮层干细胞和祖细胞的群。用于扩增皮层干细胞和祖细胞的适合的培养条件包括刺激FGF2信号化的条件。例如，可以通过在用成纤维细胞生长因子2（FGF2）补充的扩增培养基中培养来扩增皮层干细胞和祖细胞的群。例如，该培养基包含10至40ng/ml的FGF2，优选20ng/ml。
适合的扩增培养基可以包括上述用FGF2补充的3N培养基。其他适合的培养基对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
在皮层干细胞和祖细胞的产生和可选的扩增之后，可以开始皮层干细胞和祖细胞的神经发生以产生大脑皮层神经元的群。
可以在促进神经发生的条件下培养皮层干细胞和祖细胞群。例如，可以在扩增培养基中培养该细胞，如不含FGF2的上述3N培养基。
皮层干细胞和祖细胞的群可以培养至少40天、至少60天、至少80天、至少100天、或超过100天，或直至神经发生完成或已发生足够量的神经发生。可以采用标准细胞培养技术。
大脑皮层神经元完全分化为功能化谷氨酸能投射神经元。大脑皮层神经元可以表达选自由Tbr1、CTIP2、Cux1、Satb2、Brn2、reelin、Fezf1、Fezf2、Sox5、Bhlhb5、Pou3f1、和Otx1组成的组中的一种或多种标记物（参见，例如Molyneaux et al.,Nat Rev Neurosci.2007Jun;8(6):427-37）。
该方法可以包括监测或检测群中细胞中的一种或多种大脑皮层神经元标记物和/或一种或多种皮层干细胞和祖细胞标记物的表达。
大脑皮层神经元可以是任何种类。例如，神经元可以是皮质层6、皮质层5、皮质层4、皮质层3、皮质层2、或皮质层1神经元。
可以通过神经元类型标记物的表达来鉴定不同种类的大脑皮层神经元。例如，层1神经元表达络丝蛋白；层2/层3神经元表达Brn2；层2-层4神经元表达Cux1和Satb2；层5神经元表达CTIP2、Pou3f1/SCIP或Otx1；层5皮质脊髓运动神经元表达CTIP2而不表达Tbr1；以及层6神经元表达Tbr1和Fezf2。
可以通过任何适合的技术来测定神经元类型标记物的表达，包括免疫细胞化学、免疫荧光、和RT-PCR。
在皮层干细胞和祖细胞的分化开始后，例如超过80天、90天、或100天，可以逐渐产生不同类型的大脑皮层神经元。在一些实施方式中，深层6神经元在层5皮质脊髓运动神经元之前分化，随后出现表面层（层2-层4）神经元的分化。可以产生大致相等量的深层和表面层神经元。
可以培养细胞直至产生所需种类的大脑皮层神经元。如上文所述，可以通过检测神经元种类标记物的表达来监测存在于细胞培养物中的该类神经元。
在一些实施方式中，可以通过，例如，向培养基中加入FGF2或从培养基中取出FGF2以减慢特定神经元细胞种类的出现来控制神经发生的速率。方法可以包括从细胞培养物中分离特定种类的神经元的群。例如，可以分离皮质层6、皮质层5、皮质层4、皮质层3、皮质层2、或皮质层1神经元的群。这些神经元在下述的治疗或其他应用的范围中可以是有用的。
在一些优选的实施方式中，可以分离皮质层5神经元的群。这些包括在治疗或模型化脊髓损伤和运动神经元疾病或筛选这些病症的治疗中特别有用的皮质脊髓运动神经元。
由本发明方法产生的皮层神经元，尤其是特定种类或子集的皮层神经元，如皮质脊髓运动神经元，可以基本上不含有其他细胞类型。在一些实施方式中，可以利用本领域技术人员公知的任何技术从细胞培养物中的其他细胞类型和种类中分离关注的皮层神经元，这样的技术包括基于通过抗体、或磁珠、或荧光活化细胞分选（FACS）来识别胞外表位如神经元种类标记物的技术。
如所述产生的大脑皮层神经元显示出功能化的电生理学性质，并形成神经元突触。例如，通过检测微兴奋性突触后电位（mEPSP）的存在或突触囊泡素（synaptophysin）免疫荧光的焦距的存在可以确定大脑皮层神经元的群的兴奋性突触性质。这可以利用标准技术来进行。
如上文所述，人多能干细胞可以是诱导的多能干（iPS）细胞。
iPS细胞是来源于非多能的、完全分化的祖细胞的多能细胞。适合的细胞包括成人成纤维细胞和外周血细胞。祖细胞通常通过引入多能基因或蛋白，例如向细胞中引入Oct4、Sox2、和Sox1而被重新编程。可以通过任何适合的技术向经分化的细胞中引入该基因或蛋白，这样的技术包括病毒或质粒转染或直接蛋白递送。也可以向细胞中引入其他基因，例如Kif基因，如Kif-1、Kif-2、Kif-4、和Kif-5；Myc基因，如C-myc、L-myc、和N-myc；nanog；以及Lin28，以增加诱导效率。在引入多能基因或蛋白之后，可以对该祖细胞进行培养。可以分离和/或纯化表达多能性标记物的细胞以产生iPS细胞的群。用于产生iPS细胞的技术是本领域公知的。（Yamanaka et al Nature2007;448:313-7;Yamanaka62007Jun7;1(1):39-49.Kim et al Nature.2008Jul31;454(7204):646-50;Takahashi Cell.2007Nov30;131(5):861-72.Park et al Nature.2008Jan10;451(7175):141-6;Kimet alCell Stem Cell.2009Jun5;4(6):472-6）。
在一些实施方式中，iPS细胞可以来源于获自个体的健康细胞，即，没有疾病相关的表现型或基因型的细胞。在一些实施方式中，细胞可以获自具有损伤的或功能障碍的皮层神经元的患者，例如患有神经疾病、头部外伤、多发性硬化症、中风、或脊髓损伤的个体。由这些细胞产生的皮层神经元在对该患者的治疗中可以是有用的。
在一些实施方式中，iPS细胞可以是疾病特异性iPS细胞。疾病特异性iPS细胞可以来源于来自个体的疾病相关的细胞，即，具有与疾病相关的表现型或基因型的细胞，例如神经疾病，如偶发性或家族性阿尔茨海默病、家族性或偶发性癫痫、自闭症、精神***症、和脑瘫。
用于产生iPS细胞的疾病相关的细胞可以获自患有神经疾病或易患神经疾病或处于患神经疾病风险中的个体。
神经疾病包括与损伤的或功能障碍的皮层神经元相关的疾病，如偶发性和家族性阿尔茨海默病、家族性和偶发性癫痫、自闭症、精神***症和脑瘫。
在一些优选的实施方式中，神经疾病为青少年或成人发作的神经退行性疾病。
如本文所述，疾病特异性iPS细胞可以分化以产生皮层神经元的群，其在神经疾病的模型中是有用的。尤其是，由如本文所述的疾病特异性iPS细胞产生的皮层神经元在短时间范围（即，数周或数月）内可以显示出疾病病状（病理，pathology）。这有利于筛选治疗分子。
在一些优选的实施方式中，人多能干细胞是唐氏综合症iPS细胞（DS-iPS细胞）。DS-iPS细胞是来源于获自患有唐氏综合症的个体的细胞的iPS细胞（Park,I.H.,et al Cell134,877-886(2008)）。
唐氏综合症/21三体综合症是人心智障碍的共有的基因原因（Wiseman,F.K et al Hum Mol Genet18,R75-83(2009)）。患有唐氏综合症的个体具有非常高的阿尔茨海默病发病率，这是由于在第21号染色体上存在淀粉样前体蛋白（APP）基因（Rumble,B.,et al.N Engl J Med320,1446-1452(1989);Selkoe,D.J.Biol Chem271,18295-18298(1996)）。
如本文所述在DS-iPS细胞中进行皮层生成的体外诱导将导致产生带有第21号染色体的额外复制的大脑皮层神经元。
这些大脑皮质神经元在细胞培养物中显示出AD病状。例如，源于DS-iPS的皮质神经元产生高水平的淀粉样前体蛋白（APP）的Aβ42片段，形成胞内和胞外淀粉样斑，并显示出程序化细胞死亡速率的增加。
产生具有AD病状的皮层神经元的方法可以包括：如上文所述体外诱导DS-iPS细胞群的皮层生成，从而产生具有AD病状的皮层神经元的群。
来源于DS-iPS的皮层神经元可以在从DS-iPS细胞或来源于其的储存皮层干细胞分化开始后的1、2、3、4个月以上之内显示出AD病状。
产生后，可以培养和保持具有AD病状的皮层神经元，例如用于筛选。保持具有AD病状的皮层神经元的方法可以包括：如上文所述，对来源于DS-iPS的皮层神经元的群进行培养。
培养神经元的方法是本领域公知的。
该方法可以进一步包括测量或检测所述细胞中的一种或多种AD病状。
AD病状包括增加的Aβ42的表达水平；增加的AB42与AB40（无毒形式）之比；增加的神经元中的AB42水平；增加的胞外培养基中的Ab42水平；增加的AB42低聚体形成；增加的超磷酸化Tau的水平；增加的胞内钙水平；增加的胞内或胞外淀粉样斑的形成；以及增加的程序化细胞死亡的速率。
例如，这在下文中更详细描述的筛选方法可以是有用的。
患有唐氏综合症的个体可以表现出提早老化。如本文所述，在DS-iPS细胞中皮层生成的体外诱导致使产生在研究衰老和年龄相关认知能力衰退中有用的大脑皮层神经元。
产生具有年龄相关病状的皮层神经元的方法可包括：如上所述，体外诱导DS-iPS群的皮层生成，从而产生具有年龄相关病状的皮层神经元的群。
来源于DS-iPS的皮层神经元可以在从DS-iPS细胞或来源于其的储存皮层干细胞分化开始后1、2、3、4个月以上之内表现出与年龄相关的病状。
产生后，可以培养和保持具有年龄相关病状的皮层神经元，例如用于筛选。保持具有年龄相关病状的皮层神经元的方法可以包括：如上文所述，对来源于DS-iPS的皮层神经元的群进行培养。
年龄相关病状可以包括减缓的生长、增加的程序化细胞死亡速率、降低的突触活性、和降低的兴奋活性。
本发明的其他方面提供了通过上述的体外皮层生成方法产生的经分离的大脑皮层神经元或经分离的皮层干细胞和祖细胞，以及通过上述的体外皮层生成方法产生的经分离的大脑皮层神经元或经分离的皮层干细胞和祖细胞的群。
经分离的大脑皮层神经元的群可以包含80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、或99%以上的具有功能性兴奋性质的谷氨酸能投射神经元。该群可以包含低于1%的中间神经元，优选无中间神经元，或通过免疫细胞学检测不到的中间神经元。
经分离的皮层干细胞和祖细胞的群可以包含80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、或99%以上的皮层干细胞和祖细胞。
通过本文所述的方法产生的皮层干细胞和祖细胞为背侧端脑细胞（dorsal telencephalic cell）（即，它们对皮层组织是特异性的）。
通过本文所述地方法产生的皮层干细胞和祖细胞的群不含有后脑或脊髓干细胞和祖细胞。
在一些优选的实施方式中，神经元或干细胞和祖细胞由来源于具有功能障碍（例如，损伤或患病）的大脑皮层的iPS细胞产生。这些皮层干细胞和祖细胞或神经元可以用于对患者进行治疗。例如，可以给予皮层细胞以替换具有功能障碍的大脑皮层的个体（即，具有患病的或功能障碍的皮层神经元的个体）中的损伤皮层神经元。
本发明的其他方面提供了由本文所述的方法产生的皮层干细胞和祖细胞或皮层神经元的群，用于对人体或动物体进行治疗的方法，例如用于对具有功能障碍的大脑皮层的患者进行治疗，以及通过本文所述方法产生的皮层干细胞和祖细胞或皮层神经元的群在制备用于治疗功能障碍的大脑皮层的药物中的应用。
具有功能障碍的大脑皮层的个体可以患有与损伤的或功能障碍的皮层神经元相关的疾病，如偶发性和家族性阿尔茨海默病、家族性和偶发性癫痫、自闭症、精神***症、运动神经元疾病、脑瘫、多发性硬化症、或中风，或可以患有大脑或脊髓经受的损伤或外伤。例如，如上文所述产生的皮质脊髓运动神经元（层5）可以用于治疗脊髓损伤。
优选地，用于对个体进行治疗的皮层干细胞和祖细胞或皮层神经元的的群由来源于获自该个体的细胞的iPS细胞产生。
优选地，用于治疗应用的本文所述的皮层干细胞和祖细胞或皮层神经元是临床级细胞。
可以基因操作给予个体的皮层干细胞和祖细胞或皮层神经元的群以产生治疗分子，例如，药物或生长因子（Behrstock S et al,Gene Ther2006年3月;13(5):379-88,Klein SM et al,Hum Gene Ther2005Apr;16(4):509-21）。
药物组合物、药物、药品、或其他组合物可以包含皮层干细胞和祖细胞或皮层神经元的群，以及药用赋形剂、载体、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抗氧剂、或本领域技术人员公知的其他物质。载体或其他物质的准确性质将取决于给予途径。药物组合物可以通过将皮层干细胞和祖细胞或皮层神经元的群与药用赋形剂、运载体、或载体，以及可选的一种或多种其他成分混合而产生。
该组合物可以给予患者，例如，用于治疗（可以包括预防性治疗）上述的功能障碍的皮层组织。
液体药物组合物通常包括液态载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、组织或细胞培养基、葡萄糖或其他糖类溶液或二醇类如乙二醇、丙二醇、或聚乙二醇。
该组合物可以是肠胃外用含水溶液的形式，其是无热原的并且具有适合的pH、等张性、和稳定性。相关技术领域的技术人员能够利用，例如，等张载体如氯化钠、林格氏注射液、或乳酸化林格氏注射液来制备适合的溶液。可以利用人造脑脊流体来制备组合物。
可以通过本领域公知的任何技术将细胞灌注到患者体内（例如，Lindvall,O.(1998)Mov.Disord.13,Suppl.1:83-7;Freed,C.R.,et al.,(1997)Cell Transplant,6,201-202;Kordower,et al.,(1995)New England Journal ofMedicine,332,1118-1124;Freed,C.R.,(1992)New England Journal ofMedicine,327,1549-1555,Le Blanc et al,Lancet2004May1;363(9419):1439-41）。
根据本发明的组合物的给予优选为“预防有效量”或“治疗有效量”（即使可以认为预防是治疗也是如此），这足以对该个体表现出益处。实际给予的量以及给予的速度和时程将取决于待治疗疾病的性质和严重程度。治疗的药方，例如，对剂量的确定等，在全科医生和其他医生的职责范围内。
可以单独地或与其他治疗结合同时或顺次地给予组合物，这取决于待治疗的病症。
在其他的优选实施方式中，神经元、皮层干细胞和祖细胞、或它们的群来源于疾病特异性iPS细胞，例如，DS-iPS细胞。
神经元或干细胞和祖细胞或它们的群可以显示出神经退行性疾病的病状，如胞内或胞外蛋白团聚或增加的凋亡。例如，来源于DS-iPS细胞的神经元或干细胞和祖细胞可以表现出AD病状。
表现出神经退行性疾病病状的细胞在筛选在治疗方法的开发中可以有用的活性化合物中可以是有用的。
本发明的其他方面涉及上文所述的产生的大脑皮层神经元在筛选具有治疗活性的化合物的方法中的应用，该化合物在治疗疾病，如神经退行性疾病中可以是有用的。
筛选在治疗神经疾病中有用的化合物的方法可以包括：使通过上文所述的方法产生的经分离的大脑皮层神经元与测试化合物接触，以及测定该测试化合物对所述神经元的影响。
例如，可以测定测试化合物对神经元细胞死亡/存活、生长、增殖、条件、团聚、电活性、突触活性、和/或基因表达的影响。
在一些实施方式中，筛选在神经退行性疾病的治疗中有用的化合物的方法可以包括，在存在和不存在测试化合物下，测定神经毒素对通过上述方法产生的经分离的大脑皮层神经元的影响。
减少或改善神经毒素对神经元的影响的测试化合物在治疗神经退行性疾病或开发治疗方法中可以是有用的。
神经毒素可以包括与神经退行性疾病相关的易团聚蛋白（aggregationprone protein），如AB42。
如本文所述产生的大脑皮层神经元，例如，在毒性测试中也可以是有用的。
在一些实施方式中，测定化合物的神经毒性的方法可以包括，使该化合物与通过上文所述的方法产生的经分离的大脑皮层神经元接触，以及测定该测试化合物对所述神经元的影响。
可以将改变，例如增加或减少神经元细胞死亡/存活、生长、增殖、条件、团聚、电活性、突触活性、和/或基因表达的化合物确定为神经毒素。
优选地，神经元或干细胞和祖细胞来源于疾病特异性iPS细胞，例如，来源于获自患有与损伤的或功能障碍的皮层神经神经元相关疾病的个体细胞的iPS细胞，这样的疾病，如偶发性和家族性阿尔茨海默病、家族性和偶发性癫痫、自闭症、精神***症、和脑瘫。
来源于疾病特异性iPS细胞的神经元或干细胞和祖细胞可以显示出神经疾病病状，如异常的突触活性或电活性、胞内或胞外蛋白团聚、异常的基因表达、或增加的细胞死亡。
可以测定该测试化合物对神经疾病病状的影响。减少或抑制该病状的化合物可以确定为在神经疾病的治疗或针对神经疾病的治疗方法的开发中是潜在有用的。
神经病状，如阿尔茨海默病病状可以在分化开始后的1、2、3、4、5、或6周以上之内进行测量。可以在超过1、2、3、4、5、或6周以上测量这些病状以确定测试化合物的影响。
在一些优选的实施方式中，筛选用于治疗阿尔茨海默病的化合物的方法可以包括，使通过上述方法由DS-iPS细胞产生的经分离的大脑皮层神经元与测试化合物接触，以及测定该测试化合物对所述神经元的影响。
例如，可以测定该测试化合物对一种或多种阿尔茨海默病病状的影响，如Aβ42的表达水平、AB42与AB40（无毒形式）之比；神经元中的AB42水平；胞外培养基中的Ab42水平；AB42低聚物的形成；超磷酸化Tau的水平；胞内钙水平；胞内和胞外淀粉样斑的形成；以及程序化细胞死亡的速率。
相对于没有用测试化合物处理的对照细胞，任何的这些病状的减少都可以指示该测试化合物显示出抗AD活性以及在治疗阿尔茨海默病和/或开发AD治疗方法中可以是有用的。
可以利用标准技术来测定阿尔茨海默病病状，如AB42与AB40（无毒形式）之比；神经元中的AB42水平；胞外培养基中的AB42水平；AB42低聚物形成；超磷酸化Tau的水平；胞内钙水平；Aβ42的表达水平；胞内和胞外淀粉样斑的形成；和/或程序化细胞死亡的速率。例如，可以通过用硫黄素T类似物BTA124进行活细胞染色来测定淀粉样斑的发展。
本文所述的方法可以包括确定减少或改善皮层神经元中的一种或多种神经疾病病状的步骤。减少神经疾病病状的化合物是用于治疗神经疾病或用于设计这样的化合物的候选化合物。
在确定减少或改善皮层神经元中的一种或多种神经疾病病状的化合物之后，该方法可以进一步包括改变该化合物以使其药学性质最优化。这可以通过上文所述的模型化技术进行。
可以利用一次或多次次级筛选来评价利用一次或多次初级筛选确定为能够减少或改善皮层神经元中的一种或多种神经疾病病状的测试化合物。
次级筛选可以包括，例如，在动物模型中的生物功能或活性的体外和/或体内测试。例如，可以测定测试化合物在疾病的动物模型中减少或改善与神经疾病相关的一种或多种症状或病状的能力。
在对减少或改善皮层神经元中的一种或多种神经疾病病状的测试化合物进行确定之后，可以分离和/或纯化该化合物或可替换地，其可以利用重组表达或化学合成的常规技术来合成。此外，可以制备其和/或其可以用于制备，即生产或配制诸如药物、药物组合物、或药品的组合物。可以将这些给予个体以治疗神经疾病。
根据本公开，本发明的各种进一步的方面和实施方式对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
本说明书中提到的所有文档和数据库都以其全部结合于本文作为参考。
本文中提到的细胞标记物都为本领域公知的，并且所有的细节可容易地从公共数据库获得，如在线NCBI数据库。用于检测这些标记物的表达的抗体可以通过常规技术来产生以及从可商业来源获得（例如Abcam Ltd,Cambridge UK）。
应认为本文中使用的“和/或”具体公开了两个具体特征或组分包括或不包括另一个中的每一个。例如，应认为“A和/或B”具体公开了（i）A、（ii）B、和（iii）A和B，就像它们中的每一个在本文中单独给出一样。
除非上下文中明确指出，否则对上述特征的描述和限定不应限于本发明的任何特定方面或实施方式，而是等同地适用于所描述的所有方面和实施方式。
附图说明
现在通过实例的方式并且参照以下附图和表格来说明本发明的某些方面和实施方式。
图1示出了室带区干细胞和祖细胞表达的转染因子Foxg1的定量RT-PCR，其证实了皮层干细胞的诱导在5天后开始，并在20天后出现峰值，而表达Tbr-2的细胞在差不多一周后出现。误差条，s.e.m.。
图2示出了表达Oct4的hES细胞在15天的神经诱导期内以高效分化为表达Pax6的神经干细胞。星号表示在第0天不存在可检测的表达Pax6的细胞，并且在第15天不存在表达Oct4的细胞。误差条，s.e.m.，n=3个在第15天表达Pax6的细胞的样品。
图3示出了定量的皮层诱导效率，如在存在或不存在视黄素下，在两个hESC细胞系和四个hiPSC细胞系中通过表达Pax6的细胞的百分比（利用DAPI检测的核的百分比）估算的。值是每一个细胞系的三种培养物的平均值。误差条，s.e.m.。
图4示出了在皮层莲座中发现的Tbr2+Ki67+细胞的定量比例分析—来源于不同的hESC和hiPSC系的莲座中15%至20%的细胞表达Tbr2+。Tbr2+群的约40%为Ki67+循环（cycling）祖细胞。
图5示出了在皮层莲座中发现的Tbr2+细胞的定量比例—来源于不同的hESC和hiPSC系的莲座中15%至20%的细胞表达Tbr2+。
图6示出了培养物中从hESC的神经元分化的时程：到第35天时，培养物中约70%的细胞为表达Tuj1的神经元。在每一时间点从n=3个培养物计数。误差条，s.e.m.。
图7示出了表达Oct4的hES细胞（A、C、E）在15天的间隔内分化为表达Pax6的皮层干细胞和祖细胞（B、D、F）。标尺，100μm。
图8示出了来源于hES的皮层干细胞和祖细胞形成增殖细胞（Ki67）的极化神经上皮莲座，在该增殖细胞（Ki67）中在中心腔（i中的星号；j中的白色箭头指示顶部有丝***）附近发生了许多有丝***（磷酸化组蛋白H3），该中心腔由神经上皮细胞的顶部表面形成（CD133，j）。通常也发现有脑室有丝***（j中的黄色箭头）。
图9示出了莲座中增殖的Ki67阳性细胞的子集表达SVZ特异性转录因子Tbr2（白色箭头，k）。然而，大多数表达Tbr2的细胞都是新生的表达双肾上腺皮质激素（Dcx）的神经元（白色箭头，l）。标尺j、m：100μm；k、l：50μm。
图10示出了从人ES细胞的皮层神经发生的顺序再现了正常的发育。深层和上层神经元以时间顺序由hESC产生，在第2/3层神经元（Brn2）之前产生第5层和第6层神经元（Tbr1和CTIP2）。N=3个培养物，对每一种标记物进行评分。误差条，s.e.m.。
图11a示出了基于小鼠的数据，成人皮层的各层中皮层投射神经元种类的图，具有在每一种所示的神经元中表达的转染因子。CPN，扣带（callosal）投射神经元。
图11b示出了由hESC先生和后生的皮质神经元的分化。第6层的皮质丘脑投射神经元（表达Tbr1/CTIP2的神经元，g、i）和第5层的皮质脊髓运动神经元（CTIP2阳性，Tbr1阴性神经元，h，i)中的白色箭头）都存在。j)至k)示出了来自hESC的上层后生皮质神经元的分化。这些神经元表达Cux1、Satb2、和Brn2。标尺g-l：50μm。
图12示出了由人ES细胞和iPS细胞系产生的不同种类的皮层投射神经元的相对比例。从所有的系产生大致相等比例的深层和上层神经元。
图13至图17示出了从hESC体外产生功能化人皮层兴奋性神经元，再现了体内发育。
图13示出了由hES细胞有效产生大量具有丰富神经突（b）的神经元（表达Tuj1，a）。几乎所有的神经元都是谷氨酸能的，如通过细胞体和神经突中存在囊泡膜谷氨酸转运体所证实的（白色箭头，c）。标尺：50μm（a）、25μm（b）、10μm（c）。
图14示出了人类来源于ES的皮质神经元体外成熟以发出自发性动作电位（d，n=3神经元）。成熟皮层神经元在电流注入后保持动作电位的运行，如对于来源于培养物中的hES的皮层神经元所观察到的（e，n=21神经元）。通过存在频繁的mEPSP证明了这些神经元也形成功能化突触（f，n=12神经元）。
图15示出了来源于多能干细胞的皮层神经元显示出分化以获得成熟电生理学性质。图15A和图15B示出了来源于PSC的皮层神经元中的电压门控性钠和钾通道。响应于从-80mV至+40的保持电位的一步去极化的家族的电流是叠加的。在图15A中，通过施加TTX完全阻断快速活化并使钠内向电流失活。在图15B中，4-AP阻断外向K电流的快速活化瞬时部分。
图15C示出了来源于PSC的皮层神经元随时间成熟的电生理学性质，如通过响应于一步电流注入发出改变动作电位例证的。
图15D和图15E示出了来源于hESC和hiPSC的皮层神经元响应于一步电流注入产生有效的规则峰形行为（regular-spiking behaviour）。
图16示出了在记录来源于hESC（D1）或hiPSC（D2）的皮层神经元的全细胞中的mEPSC检测。在每一种情况下，AMPA受体拮抗剂CNQX阻断mEPSC的出现。
图17示出了来自来源于hESC（n=20个事件；E1）和hiPSC（n=20个事件；E2）的皮层神经元的平均mEPSC。在每一种情况下，mEPSC具有AMPA介导的迅速发作（箭头）和缓慢衰减（箭头）的特征。
图18至图31示出了唐氏综合症iPS细胞向功能化皮层投射神经元的定向分化。
图18示出了在15天的间隔内，极化的神经上皮莲座（D-F）中的表达Oct4的DS-iPS细胞（A-C）向表达Pax6的皮层干细胞和祖细胞的分化。染色体组型证实了该DS-iPS细胞包含47条染色体（C）。标尺：50μm（a-e），100μm（f）。
图19示出了DS-iPS产生全部皮层的神经元：深层（Tbr1，g）和上层（Cux1，Brn2，Satb2，h，i）。
图20示出了产生了大致相等数量的深层和上层神经元（j）。对于每一种细胞特异性标记物，n=3个培养物；误差条，s.e.m。标尺：50μm。
图21示出了来源于DS-iPS的皮层神经元在体外功能性成熟，发出自发动作电位（A）并在电流注入后发放动作电位的序列（B）。
图22示出了通过来源于对照健康（Ctrl）和DS（DS）iPS细胞的皮层神经元分泌Aβ40肽（对于每一个细胞系，n=3个培养物）。每48小时收集细胞培养基以通过夹心ELISA来测量Aβ40肽浓度。每48小时全部更换细胞培养基，因此Aβ40的水平反映了48小时期间内的分泌和累积。绿色箭头指示在这些培养物中明显的神经元分化的开始。星号表示在某一时间点，对照和DS神经元之间Aβ40浓度的明显差异（p<0.025）。
图23示出了在培养90天后，在来源于hES和DS-iPS的皮层神经元中的淀粉样物质的利用硫黄素类似物BTA-1的活细胞染色。在DS-iPS神经元培养物中明确观察到BTA-1阳性团聚体（b中的箭头）。H9：来源于H9hES细胞的皮层神经元；DS，来源于DS1-iPS4的皮层神经元。标尺：100μm。
图24示出了在对照（H9）和唐氏综合症（DS）皮层神经元的60天培养物中在48小时内细胞培养悬液中Aβ42累积的斑点印迹（a）和定量（b）。
图25示出了在DS-iPS皮层神经元培养物中观察到的大量细胞死亡（活化的半胱天冬酶3），其中的大多数在具有胞内BTA1阳性淀粉样团聚体中发现（l中的箭头）。凋亡细胞的定量发现，来源于DS的皮层神经元中的发生率显著较高（每一种细胞类型n=3个培养物）。误差条，s.e.m。标尺：50μm。
图26示出了在来自于DS-iPS细胞的皮层干细胞培养物中没有发现APP的病原性Aβ42片段（e），在来自hESC的培养皮层神经元中极少，而培养60至90天时在来源于DS-iPS细胞的皮层神经元的培养物中发现了大量的Aβ42胞内和胞外沉积物。标尺：e-g，100μm；h，50μm。
图27示出了DS-iPS皮层神经元的90天培养物的Z-堆叠的3D效果图中在皮层神经突附近发现的胞外淀粉样斑（箭头）。标尺：25μm。
图28示出了来自H9和DS细胞的皮层神经元培养物中的淀粉样团聚体的定量。在每一种细胞类型的三个培养物中对大于神经元细胞体平均直径的聚集体进行计数。误差条，s.e.m.。
图29示出了分化70天时DS皮层神经元产生了大量的可溶性胞外Aβ40和Aβ42肽，相对于DS成纤维细胞和来源于hES的皮层神经元的年龄匹配的培养物。分泌的Aβ40:Aβ42之比为4.6:1。用DAPT抑制γ-分泌酶4天降低了Aβ40和Aβ42的产生，Aβ40:Aβ42之比变为7.5:1。更长期的21天γ-分泌酶的抑制使两种Aβ肽的产生降低到不可检测的水平。
图30示出了来自DS成纤维细胞培养物、来源于hES的皮层神经元和DS皮层神经元的全细胞提取物的不溶性和不溶性Aβ肽的定量，证明了在该不溶性部分中仅有可检测的Aβ并且主要是Aβ42。γ-分泌酶抑制没有显著改变培养物中存在的不溶性Aβ42的量。
图31示出了本文所述的分化过程的示意图：双SMAD抑制的组合，与视黄素的组合，使PSC分化为可以用FGF2扩增/保持的皮层干细胞和祖细胞。除去FGF2使得发生神经发生，在与体内发生的皮层细胞类型生成的相同发育过程后产生皮层干细胞。所有层的皮层投射由PSC产生并形成功能性兴奋的谷氨酸钠能突触的网络。
具体实施方式
实验
方法
人多能干细胞培养
人ES细胞研究得到了英国干细胞库（UK Stem Cell Bank）和干细胞应用（Use of Stem Cell Lines）指导委员会的批准，并且根据人类干细胞应用实践的UK代码（UK Code of Practice for the Use of Human Stem CellLines）来进行。hES（H9，WiCell Research Institute，和Edi2，来自JennyNichols的馈赠，Cambridge Centre for Stem Cell Research）和hiPS细胞系（DS1-iPS4，Harvard Stem Cell Institute22）的培养根据标准方法13在经丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）上进行。简言之，将细胞保持在hESC培养基中（除非另外指出，所有组分均来自Invitrogen）：含有20%的KSR的DMEM/F12、6ng/ml的FGF2（PeproTech）、1mM的L-Gln、100μm的非必需氨基酸、100μM的2-巯基乙醇、50U/ml的青霉素、和50mg/ml的链霉素。
定向分化为大脑皮层
在用胰酶（Accutase）（Innovative Cell Technologies）解离为单个细胞之后通过在涂覆有凝胶的盘上在用10ng/ml的FGF2和10μM的ROCK抑制剂（Calbiochem）补充的hESC培养基中进行1小时预铺板，将hESC或iPSC与MEF分离。收获未粘附的多能干细胞并铺板于在含有10ng/ml的FGF2的MEF条件hESC培养基中的涂覆有Matrigel（BD）的12孔板上。在细胞培养物达到95%汇合后，通过将培养基更换支持神经诱导、神经发生、和神经元分化的培养基（称为3N培养基）来引发神经诱导，该3N培养基为含有N2的培养基和含有B27的培养基的1:1的混合物。N2培养基：DMEM/F12、N2（GIBCO）、5μg/ml的胰岛素、1mM的L-谷氨酰胺、100μm的非必需氨基酸、100μM的2-巯基乙醇、50U/ml的青霉素、和50mg/ml的链霉素；B27培养基：Neurobasal（Invitrogen），含有维生素A的B27（GIBCO）、200mM的谷氨酰胺、50U/ml的青霉素和50mg/ml的链霉素。3N培养基用500ng/ml的小鼠头蛋白CF嵌合体（R&DSystems）、和10μm的SB431542（Tocris）补充以抑制神经诱导期间的TGFβ信号化。将细胞在该培养基中保持8-11天，在该时间段期间通过具有特征神经上皮细胞形态的细胞的外形来监测神经诱导的效率。通过用分散酶解离并在包含20ng/ml的FGF的3N培养基中在涂覆有聚鸟氨酸和层粘连蛋白的塑料板上再次铺板来收获神经上皮细胞。再过2天后，除去FGF2以促进分化。用胰酶将培养物再传代一次，以50,000个细胞/cm2在3N培养基中的涂覆有聚鸟氨酸和层粘连蛋白的塑料板上再次铺板并且保持至多达90天，每隔一天更换培养基。
免疫细胞化学和定量
在PBS中的4%的多聚甲醛中固定培养物并且进行免疫荧光染色和共焦显微法。本研究使用的抗体：Tbr1（Abcam）、Tbr2（Millipore）、CTIP2（Abcam）、普罗明/CD133（Abcam）、磷酸化组蛋白H3（Abcam）、Pax6（Chemicon）、Oct4（Abcam）、Ki67（BD）、双肾上腺皮质激素（Santa Cruz）、β-微管蛋白III（Chemicon）、β-微管蛋白III（Covance）、vGlut1（SynapticSystems）、Cux1（Santa Cruz）、Brn2（Santa Cruz）、Satb2（Abcam）、裂解的半胱天冬酶3（Cell Signaling）、Aβ42的C端（Chemicon）。
用于一抗检测的二抗为物种特异性的，Alexa染料复合物（Invitrogen）。
为了定量化表达特异性皮层神经元标记物的细胞的数目，用胰酶将细胞培养物解离为单个细胞并以100,000个细胞/ml的密度重悬浮。用Cytospin离心机（Thermo Scientific）将20,000个细胞铺板于涂覆有聚赖氨酸的玻璃载片上，并固定和染色以用于共焦显微法。为了神经元细胞培养物中淀粉样物质的活细胞染色，在清洗和成像前的20分钟加入DMSO中的BTA-1（Sigma）以使其终浓度为100nM。例用Student t检验来进行细胞计数的统计学比较。例用标准固定和染色技术来进行突触蛋白的超分辨率显微成像，用Deltavision OMX***（Applied Precision）可观察到。
利用来自DS和H9皮层神经元的65天培养物的10μl的细胞培养物上清液的斑点印记法来进行胞外Aβ42的定量分析。
在进行印记前过滤上清液以除去细胞碎片（0.22μm的过滤器）。用特异于Aβ42的C端（Chemicon）的多隆抗体来检测Aβ42。斑点印记在ImageJ（NIH）中定量化。
Aβ肽检测和定量化
通过来自DS、iPS对照、和H9hES皮层神经元培养物的50μl细胞培养物上清液的夹心ELISA（Invitrogen）来进行分泌的Aβ40和Aβ42的定量。为了可溶于水的和不溶于水的Aβ肽的定量，制备来自皮层培养物的全细胞提取物的可溶于水且可溶于甲酸的部分并通过ELISA（Invitrogen）测量每一种肽的水平。通过从分化进行的第50天，每48小时通过加入DAPT（Calbiochem）在DS皮层培养物中进行γ-分泌酶的抑制。
定量RT-PCR
在每个时间点（第5天、第10天、第15天、第20天、和第25天）在ES和DS-iPS培养物（Trizol,Sigma）的三个培养物中分离总RNA。将总RNA逆转录并用于定量RT-PCR，其中具有特异于Foxg1和Tbr2的引物的定量RT-PCR利用Applied Biosystems7000***进行。
电生理学
在室温下在含有125mM的NaCl、25mM的NaHCO3、1.25mM的NaH2PO4、3mM的KCl、2mM的CaCl2、1mM的MgCl2、25mM的葡萄糖、3mM的丙酮酸（以mM计）的人造脑脊流体中用95%的O2、5%的CO2鼓泡来进行全细胞电流钳记录。用含有135mM的葡萄糖酸钾、7mM的NaCl、10mM的Hepes、2mM的Na2ATP、0.3mM的Na2GTP、2mM的MgCl2（以mM计）的胞内溶液填充硼硅玻璃电极（电阻为6-10MΩ）。利用具有红外DIC光学镜片的BW50WI显微镜（Olympus）观察细胞。用Multiclamp700A放大器（Molecular Devices）进行记录。在4kHz下过滤信号，在20kHz下以16比特位的分辨率取样，并利用Matlab（MathWorks）分析。
人皮层神经元的切片培养
利用Leica VT1000S振动切片机将胚胎小鼠大脑（第16天的胚胎）的冠状切片制备为厚度为250μm的切片。在可渗透性膜上培养大脑切片，将其***到Costar Transwell板中，在膜的下方加入N2B27（3N）培养基。将早期（分化的第35天）的人ESC和iPSC来源的皮层神经元解离为单个细胞并铺板于小鼠大脑切片上，基本如所述的23。将培养物保持14天，然后固定并用Tbr1（识别小鼠和人）抗体和人特异性NCAM抗体进行免疫染色。
结果
我们研究了许多不同的方法，通过这些方法我们可以首先在单层培养物中利用限定的培养基和已知的信号途径将hES细胞定向分化为大脑皮层的神经干细胞和祖细胞。
通过它们对转录因子Foxg1、Pax6、Otx1/2、和Tbr2的表达来鉴定皮层干细胞/祖细胞，不表达通常在腹侧端脑（ventral telencephalon）或更尾部中表达的基因（Nkx2.1、Dlx1、和HoxB4）。如下文所述，皮层诱导的最终论证依赖于来自于由人ES细胞和iPS细胞分化的神经干/组细胞的神经元输出。
视黄素调节小鼠大脑皮层中从神经干细胞向神经发生扩增的转变，以及谷氨酸能神经元从小鼠ES细胞的衍化的增加。在缺少视黄素下，发现从hES细胞的神经诱导效率非常低。
我们发现将视黄素信号化与抑制TGFβ信号化的组合促进hESC向大脑皮层干细胞和祖细胞的神经诱导定向分化。利用这种方法，在神经诱导开始14天后，在培养物中的几乎所有的细胞（>95%）均为表达Pax6的神经干细胞。
通过这种方法获得的神经干细胞培养物表达高水平的Foxg1mRNA，随后表达Tbr2mRNA（图1）。我们测试了从人胚胎干细胞的皮层分化对视黄素的依赖是否推及其他多能干细胞系（ES和iPS）。
我们利用本文描述的方法，在存在或不存在视黄素下将两种人ESC细胞系和四种iPSC细胞系分化为神经干细胞。两种hESC系来源于两种不同的***（institution）（H9和Edi2），而四种iPSC系来源于两个不同的组。在不存在视黄素下，通过双SMAD抑制从hES和hiPS细胞的皮层神经诱导是无效的，如通过Pax6表达所估算的（图3）。观察到表达Pax6的细胞的斑，占每一种培养物中的细胞的约25%（图3），但大多数细胞是Pax6阴性的。相比之下，包含视黄素（视黄醇乙酸酯和全反式视黄醇）会引起所有的系强力的、有效的分化为皮层神经干细胞/祖细胞，几乎所有细胞都表达Pax6（图3）和Otx1/2。对于所有的hES和hiPS都是这样，与起源或衍生方法无关。
除了皮层干细胞和祖细胞特有的转染因子组合（Pax6、Foxg1、Otx1/2和波形蛋白）的表达之外，本文中报道的皮层神经莲座细胞（vrosette cell）显示出为体内皮层神经上皮特征的特征。来源于人ESC的神经干细胞在神经诱导之后形成莲座结构（Rovelet-Lecrux,A.,et al.Nat Genet38,24-26(2006);Quon,D.,et al.Nature352,239-241(1991)）。该皮层莲座具有显著的顶-底极性，将CD133/普罗明、铁传递蛋白受体、和aPKC定位于每一个细胞的最顶部（腔）（图8j）。此外，许多有丝***位于每一个莲座的顶部/腔面，如在体内发生的。最后，如在体内发生的，它们使中间体（通过ASPM和CEP135蛋白局域化观察到的）位于每一个细胞的最顶端，通常延伸到每一个莲座的中心腔内（图8j）。这与培养物中存在顶部和底部皮层干细胞和祖细胞是一致的。大多数从神经上皮莲座的腔转移的有丝***细胞表达Pax6。
神经上皮的标志特征是细胞间期的核迁移（IKNM），在这期间每一个干细胞/祖细胞的核在细胞周期的期间移动：在G2期间经受定向核迁移和在顶部表面的有丝***之前，G1细胞的核在顶部表面开始并朝向底部表面迁移，经受S期远离脑室/顶部表面。大多数M期的核的定位于每一个莲座的中心，位于顶部表面处，提供了IKNM在莲座中发生的指示。为了证实，我们利用皮层莲座中的细胞移动的延时成像观察核的移动和有丝***。
与磷酸化组蛋白H3染色一致，大多数有丝***发生在顶部/腔表面处，较少量朝向莲座的***发生。在所有的顶部有丝***之前都有G2期，在该G2期中核从脑室部位（abventricular position）移动，通常从莲座的腔移动几个核直径的距离。G2期顶部定向移动通常在几小时的期间内发生。IKNM和莲座的极化的存在以及顶部和底部有丝***的存在表明，皮层莲座通过形成圆形上皮盘（circular epithelial disc）来模拟线性体内皮层神经上皮。
在大脑皮层体内发育中，皮层干细胞的主要群形成极化的、假复层神经上皮，而祖细胞的次级群则在室下区内部和外部被发现，分别称为SVZ和oSVZ（Hansen,D.V et al.Nature464,554-561(2010);Fietz et al NatNeurosci13,690-9(2010)）。来源于本文报道的方法的神经干细胞含有至少两个并且有可能三个干细胞和祖细胞的群：莲座中的大多数细胞，其为Pax6+/Otx+/Ki67+，具有放射过程的顶-底极化细胞，并且其经受IKNM和顶部有丝***；第二细胞群，其经受脑室或底部有丝***；以及第三Tbr2+/Ki67+细胞群。Tbr2阳性增殖细胞的小细胞群（图8i）的存在与外部室下区（OSVZ）祖细胞是一致的。
尽管约一半的表达Tbr2的细胞是表达Ki67的循环祖细胞（图4），但另一半是新生的双皮质素阳性神经元，如在前文在人皮层体内发育中所描述的（Hansen et al(2010)supra）。Tbr2/Ki67+细胞群在第25天的每一个莲座中占平均15%的细胞（图5），并且很大程度上促进从干细胞/组细胞群的神经元输出。
受到从培养基除去FGF2的刺激的皮层神经发生，在来自hES和hiPS的神经元诱导之后持续发生两个月（图6）。这与在人类中约70天的神经发生是一致的，相比之下，小鼠中皮层神经发生期间为6天（Takahasi et alJ Neurosci16,6183-96(1996)）。
来源于PSC的皮层干细胞和祖细胞仅产生谷氨酸能投射神经元，而不产生可检测的GABA能中间神经元。神经发生的初始波包括深层、表达Tbr1的层的投射神经元，这证实了莲座的皮层同一性。在该过程中，莲座开始相对晚地产生星形胶质细胞，该星形胶质细胞在约70天时出现。尽管在皮层诱导条件下不产生GABA能中间神经元，但早期皮层莲座相对于区域同一性而言是可塑的：用刺猬（hedgehog）信号化激动剂泊朴***（purapomorphine）处理，腹侧化（ventralise）莲座致使产生GAD67+GABA能中间神经元。
为了进一步评价来源于PSC的皮层神经元的分化，我们使用皮层切片培养物分析（Polleux et al Sci STKE2002,PL9(2002)）来分析其在小鼠大脑皮层中的迁移、末期分化、和去向的能力。将解离的PSC来源神经元铺板于发育中的小鼠大脑的皮层切片（14.5天胚胎）上并培养14天。人PSC来源的皮层神经元在小鼠皮层中大量存活并且延伸了丰富的神经突。明显地，在发育中的小鼠皮层中的大部分放射状取向的人神经元，与脑室表面垂直，子集在边缘区中切向对齐。最后，当在小鼠皮层中培养时，人PSC来源的神经元保持其层同一性，具有许多例如，表达层6的转录因子Tbr1。
所有哺乳动物中皮层神经发生的关键特征是皮层干细胞和祖细胞的多能性以及其能够以固定的时间顺序产生不同层状命运的兴奋性谷氨酸能神经元（Mountcastle et al supra）。从hES细胞的人皮层生成再现了体内皮层生成：每一个皮层的人皮层投射神经元以正确的时间顺序和高效率由hES细胞产生。在该培养***在后期还产生了星形胶质细胞。
成人皮层的谷氨酸能投射神经元以固定的时间顺序产生，首先产生深层神经元而最后产生上层神经元。在啮齿动物中，不同层状命运和投射类型的皮层谷氨酸能神经元可以通过其表达不同的转录因子的组合来定义（图11a）：Tbr1+/CTIP2-（低量存在或不存在）层6/皮层丘脑投射神经元；CTIP2+/Tbr1-层5/皮层下投射神经元；Cux1+/Brn2+层2-层4神经元；以及Satb2+层2-层4胼胝体神经元。
我们使用了这些因子在神经元中的表达来研究在70天的间隔内皮层投射神经元亚型从PSC分化的时程，从除去FGF2开始。深层6神经元（Tbr1+）首先出现，接着是表达CTIP2的第5层和第6层神经元。上层Brn2/Cux1胼胝体投射（层2-层4）神经元随后分化，在第25-30天之间开始，表达Satb2出现较晚，在第65天至第80天出现（图10-图12）。从四种不同的hiPSC系观察到投射神经元产生的相同时间顺序。如上文所述的转录因子的组合用于定量化在培养物中70天后不同皮层投射神经元的比例。重要的是，该***中存在大致相等数量的深层和表层神经元（图10-图12），相比之下，之前报道的来自小鼠ES细胞的上层神经元的产生减少并且人ESC来源的团聚体培养中的上层神经元产生最少。而且，由hESC和四种不同hiPS系产生的不同投射神经元亚型的比例明显是相似的（图10-图12）。在该培养***中，如在体内发生的，在所有皮层形成之后，在后期产生星形胶质细胞。
因此，如本文所述的由hES的人皮层生成再现了体内皮层生成：每一皮层的人皮层投射神经元以正确的时间顺序和高效率由极化的神经上皮产生。
当在促进神经发生的条件下进行培养时，hES来源的皮层干细胞和祖细胞排他地产生谷氨酸能投射神经元，而不产生可检测的中间神经元（图13）。在培养大约90天后，如通过微小兴奋性突触后电流和突触素（synaptophysin）免疫荧光聚焦的存在表明的，在hES来源的皮层神经元培养物中可检测到功能性突触（图14）。因此，这些神经元在数周内在体外自发地发出活动电位并产生成熟放电的性质（firing property）。
我们证实了PSC来源的皮层投射神经元分化为功能性神经元（图15A、图15B）。来自单独一种细胞的全细胞膜片钳记录（总n=54神经元）表明存在电压门控性钠电流，其被河豚毒素（TTX）阻断，以及电压门控性钾电流，其为被4-氨基吡啶（4-AP）阻断的顺时部分。因此，来自hESC和hiPSC的PSC来源的皮层神经元最终适当地分化为易兴奋的细胞。
皮层投射神经元最终在新生啮齿动物皮层中在数天至数周内分化为发育成熟的放电性质。类似的过程在啮齿动物皮层神经元的原代培养物中发生。随着hESC和hiPSC来源的皮层神经元体外老化，其发出突发的活动电位的能力响应于随时间增加的电流注入（图15C）：年轻的（第28天）神经元通常发出单个活动电位，而年老的（第49天）神经元在电流注入后多发出至多达5个活动电位。到第65天时，当用电流注入步骤刺激时，许多神经元（n=32）强有力地发出一系列动作电位。在hES和hiPS来源的皮层神经元中均观察到该成熟过程（图15D、图15E），并且类似于在体内发生的成熟过程。
突触发生是神经网络形成中的关键步骤。利用超级分辨率（结构照明）显微镜以使得突触前和突触后蛋白定位可见来检测PSC来源的皮层投射神经元中的物理突触的形成。将突触定义为在树突上发现的直径为100纳米的区域（通过MAP2染色来检测），其中特异于突触前和突触后对应物的蛋白是平行的。两种不同的突触前和突触后蛋白对用于鉴定突触：PSD95，与一种主要的突触囊泡蛋白突触素一起富含于兴奋性谷氨酸能突触后密度，其为；以及与突触前蛋白Munc13-1一起的Homer1，其是一种广泛描述的突触后密度蛋白。PSD95在100nm尺寸范围内的焦距在由hESC和hiPSC产生的神经元的树突表面上是丰富的。并列但不重叠的是，在早至第28天时，突触前蛋白（突触素，Munc13-1）和突触后蛋白（PSD95，Homer1）的约100nm的焦距在hESC和hiPSC来源的皮层神经元培养物中也是丰富的。最后，为了测试所观察到的物理突触是否是功能性的，我们使用了全细胞膜片钳记录来检测第45天至第100天的培养物（总n=48神经元）中的微小兴奋性突触后电流（mEPSC）。在由所有hESC和hiPSC系产生的培养物中，经常检测到振幅为5-10pA的mEPSC（图16）。mEPSC被AMPA受体阻滞剂CNQX所阻断（图16），并且具有AMPA受体介导的突触电流的特征动力学，其快速产生并且之后缓慢地衰减（图17）。我们得出以下结论，人PSC来源的皮层神经元在培养物中形成了功能性谷氨酸能突触的网络。
为了描述该方法用于产生患者特异性皮层神经元并模型化神经疾病（如阿尔茨海默病）的潜力，我们使用该方法使疾病特异性人诱导的多能干细胞（iPS）定向分化为皮层神经元。唐氏综合症/三体综合征21是心智障碍的共同遗传原因，其中新生儿中的发病率为约1/700-800（Wiseman,F.K et al Hum Mol Genet18,R75-83(2009)）。患有唐氏综合症的个体具有非常高的阿尔茨海默病的发病率，这是由于在第21号染色体上存在淀粉样前体蛋白（APP）基因（Selkoe,D.J.Biol Chem271,18295-18298(1996)）。APP基因在人体中的复制导致常染色体显性早期发作性痴呆，并且带有增加的APP基因剂量的小鼠发展淀粉样斑和阿尔茨海默型痴呆的神经病状性特点。我们采用本文描述的方法使人健康对照细胞和人唐氏综合症iPS细胞（DS1-iPS422）分化为皮层神经元（图18至图21）。对照细胞和唐氏综合症hiPS（在本文中被称为DS-iPS）细胞以高效率产生皮层干细胞和祖细胞，再次发育为极化的神经上皮莲座（图18）。每一层的皮层神经元以正确的时间顺序并在相同的时间标度上从DS-iPS和从hES细胞分化（图19和图20）。对于hES来源的皮层神经元，这些神经元为谷氨酸能的和电活性的（图21）。
阿尔茨海默病体内发展的关键步骤是通过大脑皮层中的谷氨酸能神经元，由APP的产生的短的38-42个氨基酸的Aβ肽增加（Mountcastle1998supra），该过程可以在患有唐氏综合症的人群中在其十几岁和二十几岁时发生（Rovelet-Lecrux,A.,et al.Nat Genet38,24-26(2006)）。
我们监测了来源于对照细胞和DS iPS细胞的皮层神经元分泌Aβ40和Aβ42肽（图22）。神经元产生的Aβ40通常比Aβ42要多得多。然而，认为Aβ42是阿尔茨海默病中的主要致病Aβ肽，因为其自我团聚以形成可溶性和不可溶性低聚体以及不可溶性原纤维和斑，其也可以含有Aβ40。对于神经元分化发生数天内的对照神经元和DS皮层神经元，Aβ40肽的分泌最初成为在低水平下可检测（图22）。然而，DS皮层神经元的Aβ40的产生在随后10天内以指数增加至高水平，而对照神经元的Aβ40的产生保持一贯的低水平（图22）。在神经元分化的早期没有检测到对照神经元或DS皮层神经元的致病性Aβ42肽的分泌。
在DS皮层神经元随时间产生的Aβ40增加的情况下，我们通过用硫磺素T类似物BTA124使淀粉样物质的胞内和胞外团聚体活染色分析了培养物中DS-iPS来源的皮层神经元的淀粉样斑的发展（图23）。在皮层分化开始后的三个月的期间内，DS-iPS皮层神经元产生BTA1标记的淀粉样物质的胞内和胞外团聚体。相比之下，在相同的时期内，在hES来源的皮层神经元培养物中很少观察到BTA1阳性神经元或胞外团聚体。
Aβ42肽形成抑制阿尔茨海默病早期阶段中突触功能的可溶性和不可溶性低聚物。DS-iPS皮层神经元以非常高的水平产生Aβ42肽并且累积在细胞培养基中（图24）。
我们发现，许多具有可检测的胞内淀粉样团聚体的DS-iPS神经元经受了程序性细胞死亡，正如通过活化的半胱天冬酶3染色所检测的（图25）。
免疫荧光和共焦显微镜证明，大量含Aβ42的团聚体存在于DS-iPS皮层神经元内侧和外侧，并且在神经突附近常有胞外Aβ42阳性团聚体（图26和图27），这表明由DS皮层神经元产生的Aβ42随时间增加。相比之下，Aβ42以低得多的水平产生（约低10倍）并且在hES来源的皮层神经元中少得多地发现含Aβ42的团聚体（图28）。阿尔茨海默病中Aβ42产生的增加和斑的形成与大脑皮层中神经元细胞死亡有关。从年老的70天DS和对照hES皮层神经元培养物分泌的可溶性胞内和不溶性蛋白部分的提取和分析证实了老年DS神经元在48小时期间内分泌相当大量的Aβ40和Aβ42，而hES皮层神经元产生少量的Aβ40而没有可检测到的Aβ42（图29）。显然，DS皮层神经元培养物中的Aβ40与Aβ42之比为4.6:1，这反映了DS皮层神经元不仅产生较多的Aβ肽，而且还改变所产生的Aβ40与Aβ42的相对量，如在偶发性阿尔茨海默病体内发生的。Aβ肽的高水平分泌特异于DS神经元，如由DS成纤维细胞产生Aβ肽是几乎不可检测的（图29）。在体内，Aβ42肽形成可溶性和不溶性低聚物，其抑制阿尔茨海默病早期中的突触功能（Palop et al Nat Neurosci13812-818(2010)）。除了对分泌的可溶性Aβ40和Aβ42肽进行ELISA检测之外，DS皮层神经元的细胞培养基中也存在可溶性Aβ低聚物。
相比于分泌的可溶性Aβ肽，可溶性胞内Aβ肽水平低于在DS和对照hES来源的皮层神经元中检测的水平（图30）。然而，在DS皮层神经元培养物中发现了不溶性Aβ40和Aβ42，而在健康皮层神经元培养物中却未发现（图30）。DS培养物中的大多数不溶性Aβ为Aβ42，而Aβ40的丰度仅为Aβ42的四分之一（图30），观察到的分泌的Aβ比率。最后，我们讨论了DS-iPS皮层神经元产生和分泌的Aβ40和Aβ42肽是否会由于γ-分泌酶复合物的抑制而减少，γ-分泌酶为处理APP以产生Aβ肽的两种必需蛋白酶复合物之一。4天的短期γ-分泌酶抑制使Aβ40和Aβ42产生减少了几乎一半，而长期处理（21天）使两种Aβ肽的分泌降低至低于可检测水平（图29）。然而，γ-分泌酶的抑制并没有使DS皮层神经元培养物中的不可溶性Aβ42的量减少（图30），这很可能是因为缺少去除皮层神经元培养物中的淀粉样物质的清除机制。
总之，我们已开发了一种方法，通过该方法可以使人多能干细胞定向分化为大脑皮层神经元，再现体内发育过程。该方法由多个独特的步骤组成：使人PSC定向分化以形成皮层干细胞和祖细胞的复合群；皮层神经发生的延伸期；晚期的星形胶质细胞形成；神经元最终分化以获得成熟电生理学性质；以及突触发生和网络形成。相比于之前报道的小鼠ESC的定向分化，在本***中重现了皮层投射的多样性，具有大致相等的在培养的数月内产生的深层（先产生）和上层（后产生）神经元比例。
本方法的关键步骤是人PSC高效分化为皮层神经干细胞/祖细胞莲座，以及在该***中顶部和底部祖细胞的产生。我们已发现，抑制音猬因子不能促进皮层诱导，并且视黄素是在本文使用的神经诱导条件下进行从人PSC的有效皮层诱导所需的。这一发现与小鼠大脑皮层中从神经干细胞扩增转化为神经发生的视黄素调控以及从小鼠ES细胞衍生谷氨酸能神经元的视黄素依赖性是一致的。
当在体外以克隆密度生长时，原代小鼠皮层干细胞/祖细胞产生投射神经元，虽然相比于体内它们产生较少的上层/后产生的神经元。除去可以用于扩增莲座细胞的促有丝***FGF2，促进该***中神经发生的开始。***中每一层的投射神经元产生的时间顺序都是固定的：深层6神经元首先出现，而层2/3神经元是最后产生的神经元，随后产生星形胶质细胞。在小鼠中，皮层神经发生在6天的间隔内发生，相比之下，人类皮层神经发生在体内持续约100天。我们发现，在本***中投射神经元产生的期间接近于在人胚胎中所观察到的：深层6神经元在神经发生开始的数天内发生，而上层表达Satb2的离皮质神经元直到约60天后才开始出现。
通过PSC的定向分化产生全部类型的皮层投射神经元的能力很可能是由于在皮层莲座中存在顶部和底部祖细胞类型。我们在皮层诱导之后观察到至少两种并且有可能是三种不同的细胞群：莲座中的大多数细胞是Pax6+/Otx+/Ki67+，具有放射过程的顶-底极化细胞，其经受IKNM和顶部有丝***；第二干细胞/祖细胞的群，其经受底部有丝***；以及Tbr2+/Ki67+细胞群。这些群近似于发育中的人皮层中的干细胞/祖细胞的三个群：VZ神经上皮细胞、SVZ细胞、和oSVZ细胞。在该***产生的干细胞/祖细胞的群能够容易地产生在体内在人皮层中发现的投射神经元类型的多样性，提供了通过该***捕获的人皮层祖细胞类型的复杂性的指示。
从皮层诱导到兴奋性突触和网络形成来模型化皮层发育的能力将使得人皮层发育的未来功能性研究成为可能，并且可以用于产生特异性皮层细胞类型，如皮质脊髓运动神经元。由于这一方法与人ESC和iPCS等效，因此可以产生患者特异性皮层神经元以用于疾病模型化，并可潜在地用于治疗目的。
我们已经通过研究唐氏综合症iPS细胞来源的皮层神经元中早期发作的阿尔茨海默病的发展证实了该***用于模型化大脑皮层疾病和成人发作的神经疾病的潜力。Aβ42的产生和淀粉样斑的形成在该***中在数月的期间内发生，相比之下，在体内通常为数十年。本文所述的DS-iPS来源的神经元用于模型化早期发作的阿尔茨海默病的病状的应用提供了在体外***中用于分析APP和其肽产物在皮层突触功能和神经退化中的正常功能和病理学功能的潜在能力。
Claims (26)
1.一种用于体外诱导人多能细胞皮层生成的方法，包括：
（i）提供经分离的人多能干细胞的群，
（ii）在刺激视黄素信号化和抑制TGFβ超家族信号化的培养条件下培养所述群，
以便所述群分化为皮层干细胞和祖细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养条件抑制TGFβ和BMP信号化。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在包含视黄素和一种或多种TGFβ-SMAD信号化抑制剂的神经诱导培养基中培养所述群。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述视黄素为视黄酸、全反式视黄醇、或视黄醇乙酸酯。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述一种或多种TGFβ-SMAD信号化抑制剂选自4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺、头蛋白、和多索***。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述神经诱导培养基包含4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺和头蛋白。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中，所述神经诱导培养基包含胰岛素。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，培养所述人多能干细胞的群至少15天。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，至少95%的所述群分化为皮层干细胞和祖细胞。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括扩增所述皮层干细胞和祖细胞的群。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括储存所述皮层干细胞和祖细胞的群。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括使得所述皮层干细胞和祖细胞的群分化为大脑皮层神经元。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述人多能干细胞为iPS细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述iPS细胞来源于获自具有损伤的或功能障碍的大脑皮层的个体的健康细胞样品。
15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述iPS细胞来源于具有与疾病相关的表现型或基因型的细胞样品。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述iPS细胞是来源于唐氏综合症细胞样品的唐氏综合症iPS细胞（DS-iPS）。
17.根据权利要求16所述的方法，包括检测或测定由所述DS-iPS产生的大脑皮层神经元中的一种或多种阿尔茨海默病的病状或年龄相关的病状。
18.一种经分离的皮层干细胞以及干细胞和祖细胞或经分离的大脑皮层神经元的群，所述群通过权利要求1至17中任一项所述的方法产生。
19.根据权利要求18所述的群，在治疗人体或动物体的方法中应用。
20.根据权利要求18所述的群，在治疗具有损伤的或功能障碍的大脑皮层的患者的方法中应用。
21.一种用于治疗具有损伤的或功能障碍的大脑皮层的患者的方法，包括：
向对其有需要的个体给予权利要求18所述的群。
22.一种权利要求18所述的群在制备用于治疗具有损伤的或功能障碍的大脑皮层的患者的药物中的应用。
23.根据权利要求18所述的群，其中，所述细胞由DS-iPS细胞产生并且显示出一种或多种阿尔茨海默病或年龄相关的病状。
24.一种用于筛选在治疗神经退行性疾病中有用的化合物的方法，包括：
使通过权利要求1至17中任一项所述的方法产生的经分离的大脑皮层神经元与测试化合物接触，以及
测定所述测试化合物对所述神经元的影响。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述大脑皮层神经元由DS-iPS细胞产生，并且测定所述测试化合物对一种或多种年龄相关病状或阿尔茨海默病病状的影响。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，测定所述测试化合物对Aβ42表达水平，AB42与AB40之比；神经元中的AB42水平；胞外培养基中的Ab42水平；AB42低聚物的形成；超磷酸化Tau的水平；胞内钙水平；胞内和胞外淀粉样斑的形成；以及所述经分离的大脑皮层神经元的群的程序性细胞死亡的速率的影响。
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