CN103040755A - Aparpar多肽修饰的隐形脂质体及递药*** - Google Patents

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杨一祎
闫志强
魏岱旭
钟建
金彩虹
余震
何丹农
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本发明公开了一种APARPAR多肽修饰的隐形脂质体及递药***；所述APARPAR多肽修饰在隐形脂质体的表面上，所述隐形脂质体的膜包含氢化大豆磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-APARPAR，本发明还涉及一种脂质体递药***，所述递药***由APARPAR多肽修饰的隐形脂质体包裹抗肿瘤药物而组成。本发明提供的脂质体递药***可用于神经胶质瘤的靶向治疗，其可以在APARPAR多肽的介导作用下穿透肿瘤血管壁，渗透进入整个肿瘤组织内部，大大提高对肿瘤的杀伤作用。

Description

APARPAR多肽修饰的隐形脂质体及递药***
技术领域
本发明属药物制剂领域，具体涉及一种APARPAR多肽修饰的隐形脂质体及递药***。
背景技术
原发性脑瘤已成为癌症的十大死因之一，每100000人中就有5到10人患恶性脑胶质瘤。根据WHO对胶质瘤的分级***，4级胶质瘤的诊断最困难，患者的平均存活时间仅为12个月。从总体看，几乎没有病人存活能超过3年。侵入性脑胶质瘤细胞能够快速地浸润和破坏正常脑组织结构，因而难以通过手术完全切除肿瘤。即使使用手术切除、放疗和化疗联合治疗，恶性脑胶质瘤病人的平均生存时间也不超过一年。化疗方法失败的主要原因是抗癌药通过静脉给药后对肿瘤组织无选择性，导致严重的毒副作用。即使是目前研究广泛的主动靶向纳米递药***，也存在对肿瘤组织渗透能力差的缺点，使其对神经胶质瘤的治疗效果不佳。
神经毡蛋自-1(NRP-1)是细胞表面的一种I型跨膜糖蛋白，通常表达在一些肿瘤细胞和血管内皮细胞表面，是血管内皮生长因子165(VEGF165)的受体，在肿瘤转移、血管新生、调节血管通透性等方面发挥重要功能。研究表明，NRP-1在神经胶质瘤细胞表面高表达，但在相应的正常组织上皮细胞中没有表达。APARPAR多肽是通过噬菌体展示技术筛选得到的一个直链七肽，是NRP-1的配体，它对NRP-1高表达的肿瘤细胞和肿瘤血管表现出特异亲和性。APARPAR多肽属于“肿瘤穿透肽”，具有肿瘤血管穿透性和肿瘤组织穿透性，这类多肽可以介导与其共价连接的药物分子或纳米递药***穿透肿瘤血管壁并渗透进入肿瘤内部，分布到整个肿瘤组织中，与目前常见的主动靶向分子相比具有明显的优越性。目前尚未见利用APARPAR多肽介导纳米递药***用于肿瘤靶向治疗的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种APARPAR多肽修饰的隐形脂质体及递药***。本发明的递药***可通过静脉注射给药，通过肿瘤EPR效应和APARPAR介导作用将其靶向至肿瘤部位，并可穿透肿瘤血管壁，渗透进入整个肿瘤组织内部，提高药物的抗肿瘤作用；本发明的递药***可用作神经胶质瘤治疗药物的靶向递送。
本发明是通过以下的技术方案实现的，
第一方面，本发明涉及一种APARPAR多肽修饰的隐形脂质体，所述APARPAR多肽修饰在隐形脂质体的表面上。
优选地，所述隐形脂质体的膜包含氢化大豆磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-APARPAR；各组分的质量比依次为(14～16)∶(6～8)∶(2～4)∶(1～3)。
第二方面，本发明涉及一种脂质体递药***，所述递药***由前述APARPAR多肽修饰的隐形脂质体包裹抗肿瘤药物而组成。
优选地，所述脂质体递药***中，所述隐形脂质体的重量百分比为70～98％，余量为抗肿瘤药物。
优选地，所述抗肿瘤药物为阿霉素或表阿霉素。
第三方面，本发明还涉及一种脂质体递药***的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，将各组分用氯仿或甲醇溶解，旋转蒸发去除溶剂，加(NH4)2SO4溶液放入40～70℃水浴并同时旋转震荡的条件下进行超声分散，得空白脂质体混悬液；之后通过50nm孔径的碳酸脂膜，得空白脂质体；
步骤二，将空白脂质体以生理盐水为流动相过葡聚糖凝胶柱，收集脂质体，将其与抗肿瘤药物溶液混合后，在40～70℃静置5～40分钟，然后以生理盐水为流动相过葡聚糖凝胶柱，收集脂质体部分，即得所述脂质体递药***。
优选地，所述(NH4)2SO4溶液的浓度为0.1～0.5M。
优选地，步骤一中，所述各组分为隐形脂质体的膜包含氢化大豆磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-APARPAR；各组分的质量比依次为(14～16)∶(6～8)∶(2～4)∶(1～3)。
第四方面，本发明还涉及前述APARPAR多肽修饰的隐形脂质体在制备治疗神经胶质瘤靶向治疗药物中的用途。
本发明具有如下的有益效果：本发明提供的脂质体递药***可用于神经胶质瘤的靶向治疗，其可以在APARPAR多肽的介导作用下穿透肿瘤血管壁，渗透进入整个肿瘤组织内部，大大提高对肿瘤的杀伤作用。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为APARPAR修饰的阿霉素脂质体和未修饰的阿霉素脂质体粒径分布图；
图2为药效学实验中裸鼠生存时间对比结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，例如萨姆布鲁克等分子克隆：实验手册第三版(科学出版社，2002)中所述的条件，或者按照各制造商所建议的条件。
实施例1、APARPAR-脂质体/DOX的制备和表征
脂质体膜材料处方组成为HSPC(氢化大豆磷脂)/Chol(胆固醇)/PEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物)(14∶6∶2，mol/mol)，APARPAR修饰的PEG脂质体膜材料处方为HSPC/Chol/mPEG-DSPE/APARPAR-PEG-DSPE(14∶6∶2∶1，mol/mol)。
将各组分用氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，加浓度为0.1M的(NH4)2SO4溶液至脂膜中，超声分散并在水浴40℃时旋转震荡，得空白脂质体混悬液；再挤压过50nm孔径大小的碳酸脂膜，得空白脂质体；将空白脂质体以生理盐水为流动相过葡聚糖凝胶柱，收集脂质体部分，将其与适量的阿霉素溶液混合后，在40℃静置5分钟，然后以生理盐水为流动相过葡聚糖凝胶柱，收集脂质体部分，即得，其中隐形脂质体的重量百分比为70％，抗肿瘤药物的重量百分比为30％。脂质体用动态光散射法测定粒径，结果显示，平均粒径均为90nm左右，APARPAR修饰对其粒径无明显影响。图1为APARPAR修饰的阿霉素脂质体和未修饰的阿霉素脂质体粒径分布图；由图1可知，两者粒径大小及分布无显著差异，说明APARPAR的修饰对脂质体粒径无显著影响。
实施例2、APARPAR-脂质体/DOX的制备和表征
脂质体膜材料处方组成为HSPC(氢化大豆磷脂)/Chol(胆固醇)/PEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物)(16∶6∶4，mol/mol)，APARPAR修饰的PEG脂质体膜材料处方为HSPC/Chol/mPEG-DSPE/APARPAR-PEG-DSPE(16∶6∶4∶1，mol/mol)。
将各组分用甲醇溶解，旋转蒸发去除溶剂，加浓度为0.5M的(NH4)2SO4溶液至脂膜中，超声分散并在水浴70℃时旋转震荡，得空白脂质体混悬液；再挤压过50nm孔径大小的碳酸脂膜，得空白脂质体；将空白脂质体以生理盐水为流动相过葡聚糖凝胶柱，收集脂质体部分，将其与适量的阿霉素溶液混合后，在70℃静置40分钟，然后以生理盐水为流动相过葡聚糖凝胶柱，收集脂质体部分，即得，其中隐形脂质体的重量百分比为98％，抗肿瘤药物的重量百分比为2％。脂质体用动态光散射法测定粒径，结果显示，平均粒径均为90nm左右，APARPAR修饰对其粒径无明显影响。
实施例3、APARPAR-脂质体/DOX的制备和表征
脂质体膜材料处方组成为HSPC(氢化大豆磷脂)/Chol(胆固醇)/PEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物)(14∶6∶2，mol/mol)，APARPAR修饰的PEG脂质体膜材料处方为HSPC/Chol/mPEG-DSPE/APARPAR-PEG-DSPE(14∶6∶2∶1，mol/mol)。
将各组分用氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，加浓度为0.3M的(NH4)2SO4溶液至脂膜中，超声分散并在水浴50℃时旋转震荡，得空白脂质体混悬液；再挤压过50nm孔径大小的碳酸脂膜，得空白脂质体；将空白脂质体以生理盐水为流动相过葡聚糖凝胶柱，收集脂质体部分，将其与适量的阿霉素溶液混合后，在50℃静置30分钟，然后以生理盐水为流动相过葡聚糖凝胶柱，收集脂质体部分，即得，其中隐形脂质体的重量百分比为80％，抗肿瘤药物的重量百分比为20％。脂质体用动态光散射法测定粒径，结果显示，平均粒径均为90nm左右，APARPAR修饰对其粒径无明显影响。
实施例4、APARPAR-脂质体/DOX的制备和表征
脂质体膜材料处方组成为HSPC(氢化大豆磷脂)/Chol(胆固醇)/PEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物)(14∶7∶3，mol/mol)，APARPAR修饰的PEG脂质体膜材料处方为HSPC/Chol/mPEG-DSPE/APARPAR-PEG-DSPE(14∶7∶3∶2，mol/mol)。
将各组分用甲醇溶解，旋转蒸发去除溶剂，加浓度为0.4M的(NH4)2SO4溶液至脂膜中，超声分散并在水浴50℃时旋转震荡，得空白脂质体混悬液；再挤压过50nm孔径大小的碳酸脂膜，得空白脂质体；将空白脂质体以生理盐水为流动相过葡聚糖凝胶柱，收集脂质体部分，将其与适量的阿霉素溶液混合后，在50℃静置30分钟，然后以生理盐水为流动相过葡聚糖凝胶柱，收集脂质体部分，即得，其中隐形脂质体的重量百分比为80％，抗肿瘤药物的重量百分比为20％。脂质体用动态光散射法测定粒径，结果显示，平均粒径均为90nm左右，APARPAR修饰对其粒径无明显影响。
实施例5、APARPAR-脂质体/DOX的制备和表征
脂质体膜材料处方组成为HSPC(氢化大豆磷脂)/Chol(胆固醇)/PEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物)(15∶8∶4，mol/mol)，APARPAR修饰的PEG脂质体膜材料处方为HSPC/Chol/mPEG-DSPE/APARPAR-PEG-DSPE(15∶8∶4∶3，mol/mol)。
将各组分用氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，加浓度为0.2M的(NH4)2SO4溶液至脂膜中，超声分散并在水浴50℃时旋转震荡，得空白脂质体混悬液；再挤压过50nm孔径大小的碳酸脂膜，得空白脂质体；将空白脂质体以生理盐水为流动相过葡聚糖凝胶柱，收集脂质体部分，将其与适量的阿霉素溶液混合后，在50℃静置30分钟，然后以生理盐水为流动相过葡聚糖凝胶柱，收集脂质体部分，即得，其中隐形脂质体的重量百分比为80％，抗肿瘤药物的重量百分比为20％。脂质体用动态光散射法测定粒径，结果显示，平均粒径均为90nm左右，APARPAR修饰对其粒径无明显影响。
实施例6、APARPAR修饰的阿霉素脂质体的抗神经胶质瘤效果研究
14只原位圣经胶质瘤模型裸鼠随机分成2组(n＝7)，分别在第7、12、17和22天注射100μl APARPAR-脂质体/DOX和脂质体/DOX，累积DOX的注射剂量为20mg/Kg，记录模型裸鼠的生存时间。结果显示，APARPAR-脂质体/DOX组和脂质体/DOX组裸鼠的平均生存期分别为43和37天。与生理盐水相比，APARPAR修饰的胶束可与肿瘤细胞以及肿瘤血管内皮细胞上的神经毡蛋白-1受体结合，提高了递药***对肿瘤组织的靶向效率和在肿瘤组织内部的传递效率，从而提高达到了增强药效的目的。图2为药效学实验中裸鼠生存时间对比结果图，由图2所示，APARPAR-脂质体/DOX组荷瘤裸鼠的生存时间远长于脂质体/DOX组，说明APARPAR的修饰可显著增强阿霉素脂质体的抗肿瘤作用。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (9)

1.一种APARPAR多肽修饰的隐形脂质体，其特征在于，所述APARPAR多肽修饰在隐形脂质体的表面上。
2.如权利要求1所述的APARPAR多肽修饰的隐形脂质体，其特征在于，所述隐形脂质体的膜包含氢化大豆磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-APARPAR；各组分的质量比依次为(14～16)∶(6～8)∶(2～4)∶(1～3)。
3.一种脂质体递药***，其特征在于，所述递药***由如权利要求1所述的APARPAR多肽修饰的隐形脂质体包裹抗肿瘤药物而组成。
4.如权利要求3所述的脂质体递药***，其特征在于，所述脂质体递药***中，所述隐形脂质体的重量百分比为70～98％，余量为抗肿瘤药物。
5.如权利要求3所述的脂质体递药***，其特征在于，所述抗肿瘤药物为阿霉素或表阿霉素。
6.一种如权利要求3所述的脂质体递药***的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，将各组分用氯仿或甲醇溶解，旋转蒸发去除溶剂，加(NH4)2SO4溶液放入40～70℃水浴并同时旋转震荡的条件下进行超声分散，得空白脂质体混悬液；之后通过50nm孔径的碳酸脂膜，得空白脂质体；
步骤二，将空白脂质体以生理盐水为流动相过葡聚糖凝胶柱，收集脂质体，将其与抗肿瘤药物溶液混合后，在40～70℃静置5～40分钟，然后以生理盐水为流动相过葡聚糖凝胶柱，收集脂质体部分，即得所述脂质体递药***。
7.如权利要求6所述的脂质体递药***的制备方法，其特征在于，所述(NH4)2SO4溶液的浓度为0.1～0.5M。
8.如权利要求6所述的脂质体递药***的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述各组分为隐形脂质体的膜包含氢化大豆磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-APARPAR；各组分的质量比依次为(14～16)∶(6～8)∶(2～4)∶(1～3)。
9.一种如权利要求1所述的APARPAR多肽修饰的隐形脂质体在制备治疗神经胶质瘤靶向治疗药物中的用途。
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