CN103028119A - 一种miR-132在制备治疗帕金森病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种miR-132在制备治疗帕金森病药物中的应用，所述的miR-132具有SEQIDNO.16所述的核苷酸序列。本发明还提供一种miR-132作为诊断分子标志物在制备诊断帕金森病产品中的应用。本发明优点在于：本发明首次验证了miR-132在DA神经元发育中的作用，鉴定了miR-132的靶基因是DA神经元发育和PD发病中的重要转录因子Nurr1；对于进一步研究Nurr1以及miRNA在帕金森病发病以及临床诊断和治疗中的功能具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种微小RNA的应用，具体地说，是一种miR-132在制备治疗帕金森病药物中的应用。
背景技术
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是发病率居第二位的常见的神经***变性疾病，其病理特征主要表现为黑质多巴胺（Dopamine, DA）神经元的丢失和路易小体（Lewy body, LB）的形成。国际上关于PD的发病机制和治疗方面的研究不少，但没有一个***全面的认识，也缺乏针对疾病的有效治疗手段。常用的治疗策略仅仅局限于对症治疗，尽量减轻患者的临床症状，这类治疗手段并不能够从根本上逆转PD的发生和发展。胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ES细胞）是具有多种分化潜能的细胞，能够诱导分化成为特定的细胞类型，这种特性使其在细胞替代治疗方面具有广阔的前景。近几年国外许多实验室开始研究ES细胞向DA神经元的定向诱导分化，期望能用于PD患者DA神经元缺失的替代治疗。但目前ES细胞分化过程中的分子机制还不清楚，诱导ES细胞精确定向分化的技术还不成熟，且分化成为DA神经元的比例仍然偏低。
miRNA是一类～22nt的内源RNA小分子。它来自于基因组编码的初始转录本上剪切出来的发夹前体。成熟的miRNA通过识别并结合到靶基因上的互补序列而特异性地沉默靶基因的表达，并由此参与了生物体各种功能。miRNA在DA神经元分化和保护以及PD中的作用已经有初步研究，目前已经发现miR-133b能够通过调节Pitx3基因的表达调节DA神经元的发育和成熟，进而对PD发病产生作用；MiR-7则通过调节alpha-synuclein的表达保护DA神经元抵御氧化应激等损伤。而miR-433则通过直接调节FGF20的表达，进而抑制FGF20的过度表达而保护DA神经元因alpha-synuclein的过度聚集而引起的损伤。Cuellar等制备了DA能神经元Dicer基因敲除小鼠，虽然该系小鼠可发育至成年，但具有典型的帕金森样行为表现，利用基因印迹技术( southern blot)研究10-12周的该系小鼠新纹状体神经元中miRNA表达情况，发现miR-124a、miR-132和miR-134表达明显受到抑制，特别是miR-124a在新纹状体中的表达抑制接近90%，认为新纹状体中Dicer酶的缺失导致特定miRNA的表达减少，促进了PD的发展。这些新发现的miRNA通过调节不同的靶基因，影响DA神经元发育与分化、直接或者间接保护神经毒素对DA神经元的损伤。目前已经发现并确认的在PD中发挥作用的miRNA只有少数几个，而许多实验表明在DA神经元发育和分化过程中仍然有更多的miRNA有待发现和验证。
中国专利文献CN102031261A公开了一种与妊娠期糖尿病相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用，该标志物为miR-132、miR-29a和miR-222的组合，该标志物及其引物可用于制备诊断试剂盒，用于妊娠期糖尿病的辅助早期诊断。但是关于miR-132在制备治疗帕金森病药物中的应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种miR-132在制备治疗帕金森病药物中的应用。
本发明的再一个目的是，提供一种miR-132作为诊断分子标志物在制备诊断帕金森病产品中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种miR-132在制备治疗帕金森病药物中的应用，所述的miR-132具有SEQ ID NO.16所述的核苷酸序列。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种miR-132作为诊断分子标志物在制备诊断帕金森病产品中的应用，所述的miR-132具有SEQ ID NO.16所述的核苷酸序列。
所述的miR-132的靶基因是转录因子Nurr1。
本发明优点在于：
本发明首次验证了miR-132在DA神经元发育中的作用，鉴定了miR-132的靶基因是DA神经元发育和PD发病中的重要转录因子Nurr1；对于进一步研究Nurr1以及miRNA在帕金森病发病以及临床诊断和治疗中的功能具有重要的意义。
附图说明
附图1是TH-GFP载体示意图。通过将10kb大小的TH基因启动子片段克隆入pEGFP-1获得。
附图2是稳定转染CGR8细胞株的鉴定。加入G418筛选2周后，本发明挑选了48个单克隆进行TH启动子表达，经过基因组DNA抽提和针对GFP的PCR鉴定，选择了12个表达较高的单克隆进行后续分化和染色的鉴定。
附图3是TH-GFP稳定转染的细胞分化为GFP表达的细胞。12个单克隆扩增以后通过与PA6细胞共培养进行分化，分化10-14天后进行TH染色。12个克隆中No.12, 24, 30, 42 and 48有较多的GFP和TH共定位的细胞出现，其中TH-GFP48 具有比例最高的GFP和TH共定位细胞（60-70%）。
附图4是流式细胞仪分选的GFP阳性细胞。TH-GFP48分化为GFP表达的多巴胺神经元，并通过流式细胞仪进行分选。分选以后大约 90%的细胞为GFP表达的 多巴胺神经元。图中所示为GFP细胞和明场细胞的共定位。
附图5是RT-PCR分析GFP分选的细胞。对Nurr1，TH，等多巴胺神经元标记基因进行RT-PCR分析。通过抽提神经前体细胞(NP)，GFP阳性细胞 (GFP+)和GFP阴性细胞进行RT-PCR实验。
附图6是miR-132反义核酸能够促进多巴胺神经元分化。通过转染合成的miR-132的抑制剂观察其对多巴胺神经元分化的影响。TH染色 (红色)结果说明与对照组相比，miR-132表达下调后促进了多巴胺神经元的分化。
附图7是生物信息学分析miR-132和Nurr1的潜在调节关系。通过生物信息学分析，红线代表了Nurr1中与miRNA调节的种子序列配对的区域及其在不同物种中的保守性。突变的Nurr1（Mutant-Nurr1）中将C和T两个碱基突变为G和A 进行后续的功能验证实验。
附图8是在293T和SK-N-SH细胞中进行荧光素酶报告基因分析验证miR-132对Nurr1的调节。在荧光素酶报告基因分析中，将pGL-Mir-Nurr1/ pGL-Mir-Mutant-Nurr1和miRNA转染入293T and SK-N-SH细胞中转染24小时后通过化学发光检测仪Berthold multimode reader进行荧光素酶分析。 结果显示miR-132能够显著下调野生型Nurr1的荧光素酶表达，而针对突变型的Nurr1，则不能有效下调荧光素酶表达(** p<0.01)。
附图9是miR-132转染后对Nurr1蛋白表达水平的调节作用。通过将pcDNA3.1-Nurr1和miR-132共转染入293T细胞，48小时后进行蛋白抽提，通过western blot 方法检测Nurr1表达，结果证明miR-132能够显著下调Nurr1的蛋白表达。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一、材料与方法
1.主要的试剂和材料
| 兔抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体 | 美国Chemicon公司 |
| 鼠抗TH抗体 | 美国Sigma公司 |
| Ex Taq DNA聚合酶 | 日本TAKARA公司 |
| 鼠 抗 β-actin 抗体 | 美国Sigma公司 |
| 脂质体2000转染试剂盒 | 美国Invitrogen公司 |
| Superscript III cDNA反转录试剂盒 | 美国Invitrogen公司 |
| Hotstar PCR试剂盒 | 德国Qiagen公司 |
| SuperSignal West detection试剂盒 | 美国PIERCE公司 |
| Hoechst 33258试剂盒 | 美国Millipore公司 |
| Bradford蛋白浓度测定试剂盒 | 美国Millipore公司 |
| RNA抽提试剂盒 | 上海华舜公司 |
| Trizol RNA抽提剂 | 美国Invitrogen公司 |
| GMEM | 美国Invitrogen公司 |
| L-Glutamine | 美国Invitrogen公司 |
| 丙酮酸钠 | 美国Invitrogen公司 |
| 非必需氨基酸 | 美国Invitrogen公司 |
| Knockout Serum Replacement | 美国Invitrogen公司 |
| 鼠抗微管相关蛋白II（MAP2）抗体 | 美国Sigma公司 |
| Alpha-MEM培养液 | 美国Invitrogen公司 |
| 2-巯基乙醇（细胞培养用） | 美国Invitrogen公司 |
| ES细胞专用FBS | 美国Invitrogen公司 |
| 5×蛋白上样缓冲液 | 上海生工生物工程公司 |
| PA6细胞系 | 日本Riken细胞库 |
| 激光共聚焦显微镜（LCM510) | 德国Zeiss公司 |
| Immobilon PVDF膜 | 美国Millipore公司 |
| 细胞培养板（Corning） | 上海博蕴公司 |
| 细胞培养箱 | 德国HERA公司 |
| 酶标仪 | 美国Phenix Research 公司 |
| 体视解剖显微镜 | 日本Olympus公司 |
| 倒置荧光显微镜(IX 81) | 日本Olympus公司 |
| 激光共聚焦显微镜（LCM510) | 德国Zeiss公司 |
| PCR仪 | 美国Bio-Rad公司 |
| 水平电泳仪 | 美国Bio-Rad公司 |
| 凝胶成像仪 | 美国Bio-Rad公司 |
| Realtime PCR仪 | 美国Bio-Rad公司 |
| Western垂直电泳槽 | 美国Bio-Rad公司 |
| 医用X光胶片 | 日本Kodaka公司 |
| 流式细胞分选仪 | 美国BD公司 |
| 荧光素酶报告基因分析试剂盒 | 美国Progema公司 |
| 内切酶EcoR I | 日本TAKARA公司 |
| 内切酶Pst I | 日本TAKARA公司 |
| SK-N-SH细胞系， | 中国科学院上海生命科学院细胞库 |
| microRNA表达谱分析试剂盒 | 美国ABI公司 |
| Accutase消化液 | 奥地利PAA公司 |
2. TH-GFP载体稳定转染细胞株的筛选和鉴定
TH-GFP载体(K. Sawamoto, N. Nakao, K. Kobayashi, N. Matsushita, H. Takahashi, K. Kakishita, A. Yamamoto, T. Yoshizaki, T. Terashima, F. Murakami, T. Itakura, H. Okano, Visualization, direct isolation, and transplantation of midbrain dopaminergic neurons, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001,98, 6423–6428.)，由于其载体本身无筛选抗性基因，所以与带筛选抗性基因的载体pCDNA3.1以19:1的比例共转染进CGR8细胞中，转染两天后加入750 ug/ml浓度的G418筛选两周，挑取单克隆后扩增后抽取基因组DNA，以EGFP的引物进行PCR扩增鉴定，对鉴定的阳性克隆进行分化验证，选取分化后GFP荧光细胞比例较多的克隆进行TH的免疫荧光染色，最终选取GFP荧光与TH染色共定位比例最高的细胞克隆作为TH-GFP的稳定转染细胞株进行后续研究。
3. 流式细胞仪分选GFP阳性的细胞
复苏冻存的TH-GFP稳定转染细胞株，按照第一部分所述的DA神经元分化方法将细胞分化为GFP阳性的DA神经元。在分化的第14天，将8个10 cm培养皿中的TH-GFP与PA6共培养的细胞以Accutase消化10 min，反复吹打后以40um的滤网将细胞悬液过滤为单细胞，然后将细胞接种于10cm培养皿中培养30min，此时PA6细胞大部分已经贴壁，吸取未贴壁的悬浮细胞1500rpm离心10min后，以含2%FBS的PBS进行重悬，至流式细胞分选仪进行GFP阳性细胞的筛选。
4. 细胞培养
4.1 293T细胞培养
液氮中取出293T细胞冻存管，置于37℃水浴中快速复温，转入含等体积完全培养液的离心管[DMEM，10％FBS，青霉素50U/ml+链霉素50 U /ml]，1200 rpm离心5 min，去除上清，沉淀重悬于完全培养液，移液器吹散，以3×104 /cm2接种于直径6cm细胞培养皿。置于5%CO2，37℃恒温细胞培养箱内培养2-3 天，期间换液一次，待细胞贴壁长致约70％丰度时将293细胞接种于24孔培养板中。将miRNA、荧光素酶报告基因质粒以lipofectamine 2000共转染入293细胞中并进行后续培养和分析。
4.2 SK-N-SH细胞培养
液氮中取出SK-N-SH细胞冻存管，置于37℃水浴中快速复温，转入含等体积完全培养液的离心管[DMEM，10％FBS，青霉素50U/ml+链霉素50 U /ml]，1200 rpm离心5 min，去除上清，沉淀重悬于完全培养液，移液器吹散，以5×104 /cm2接种于直径6 cm细胞培养皿。置于5%CO2，37℃恒温细胞培养箱内培养3-5天，期间换液一次，待细胞贴壁长致约80-90％丰度时将SK-N-SH细胞接种于24孔培养板中。将miRNA、荧光素酶报告基因质粒以lipofectamine 2000共转染入SK-N-SH细胞中并进行后续培养和分析。
4.3 骨髓基质细胞PA6细胞培养：
液氮中取出PA6细胞冻存管，置于37℃水浴中快速复温，转入含等体积完全培养液的离心管[alpha-MEM，10％FBS，青霉素/链霉素50 U/ml]，1200 rpm离心5 min，去除上清，沉淀重悬于完全培养液，移液器吹散，以5×104 /cm2接种于直径9 cm细胞培养皿。置于5%CO2，37℃恒温细胞培养箱内培养3-5天，期间换液一次，待细胞贴壁长致80-90％丰度时将小鼠ES细胞CGR8接种于PA6上进行诱导分化。细胞消化传代时先以PBS洗两次，再以0.05%胰酶消化5 min进行传代。
4.4 小鼠ES细胞CGR8的培养、分化和稳定转染细胞株的筛选
小鼠ES细胞(Smith, A. G., Heath, J. K., Donalson, D. D., Wong, G. G., Moreau, J., Stahl, M., and Rogers, D. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purifi ed polypeptides. Natur 1998 336, 688–690.)，培养液成分为GMEM，含10％ ES细胞专用FBS，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%青霉素链霉素，1%谷氨酰胺和1‰ 2-巯基乙醇，以新鲜加入的1/10000的LIF（107U/ml）保持CGR8的未分化状态。细胞培养皿以0.2%明胶包被30 min，细胞传代用0.05％胰酶消化3-5 min。
CGR8向DA神经元分化的步骤如下：将CGR8以1.5×105/ml的浓度接种于6 cm细菌培养皿中培养4天形成类胚体（Embryoid Body, EB），期间于第二天更换培养液，培养液成分不含LIF。将EB吸入15 ml离心管沉淀5 min后，吸掉上清并以PBS清洗EB，最后以分化培养液重悬后接种于已经更换为分化培养液的PA6细胞上，分化培养液成分为GMEM，含10％ 血清替代品（Knockout Serum Replacement， KSR），1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%青霉素链霉素，1%谷氨酰胺和1‰ 2-巯基乙醇。
稳定转染细胞株的筛选步骤为：将CGR8接种于明胶包被的3.5 cm培养皿中，细胞生长至30％浓度的时候，将所需质粒以lipofectamine 2000转染入细胞，培养48 hr后加入相应的抗生素进行筛选，筛选两周后将细胞消化至单细胞，将100-500个细胞接种入10 cm培养皿中，待单个细胞培养一周后挑单克隆并进行扩增，最后以RT-PCR或者western blot的方法进行鉴定。
5.质粒构建
本发明涉及到的质粒构建有三个：pGL3-Mir-Nurr1、pGL3-Mir-Nurr1-Mutant和pCDNA3.1-Nurr1。
5.1 pGL3-Mir-Nurr1的构建
pGL3-Mir-reporter载体由（Promega，pGL3-basic，经过改造在luciferase序列后Xba I 1934位点后引入了Pst I，Nde I，EcoR I，Xba I酶切位点用于将3’-UTR克隆），以正义链：5’GCGGAATTCCGACATTTCTGCCTTCTCC3’（SEQ ID NO.1）；反义链：5’ GGACTGCAGAGT TTGTCAATTATTGCTGGTG 3’ ’（SEQ ID NO.2）为引物，以小鼠中脑总RNA反转录得到的cDNA为模版，将小鼠Nurr-1基因的3’-UTR扩增（NM_001139509.1，SEQ ID NO.3），通过EcoR I和Pst I双酶切将片段克隆入pGL3-Mir-reporter载体中，并测序验证。
5.2 pGL3-Mir-Nurr1-Mutant的构建
为了将生物信息学预测到的Nurr1与miR-132结合位点的关键碱基突变，本发明设计了以下引物，正义链：5’ CTACCTGTCTAAAGTGTAGGGGAAGCTGCCA3’（SEQ ID NO.4）； 反义链： 5’ TGGCAGCTTCCCCTACACTTTAGACAGGTAG 3’（SEQ ID NO.5），其中斜体加重字体的碱基（SEQ ID NO.4第14和18位）为突变的碱基。以pGL3-Mir-Nurr1为模版，进行PCR扩增，扩增产物以Dpn I酶切过夜，胶回收以后转化入大肠杆菌，测序鉴定。
5.3 pcDNA3.1-Nurr1的构建
因Nurr1基因的cDNA相对较长，加上需克隆的3’UTR区域共为3252bp。因此次质粒采用两段克隆的方法。分别以引物：片段1：1219bp， 正义链5’ GGC aagcttTTTGTCCTTCGCTGAATTACGA 3’（SEQ ID NO.6）；反义链：5’ AGAACTG CTGGATATGTTGGGT 3’（SEQ ID NO.7）； 片段2： 2033bp，正义链：5’ GTTGGGATGG TTAAAGAAGTGG 3’（SEQ ID NO.8）；反义链：GGCtctagaAAAGGCAGTGACTCATCTCATG 3’（SEQ ID NO.9），以小鼠中脑cDNA为模版（NM_001139509.1，SEQ ID NO.3）进行两个片段的PCR扩增，最终连接入pcDNA3.1载体中，测序鉴定。
6.荧光素酶报告基因分析
将pGL3-Mir-Nurr1，Renilla载体或者pGL3-Mir-Nurr1-mutant，renilla载体，以及miR-132或者对照miRNA NC共同转染入293T细胞和SK-N-SH细胞中，转染试剂为lipofectamine 2000，转染48 hr后以双荧光素酶报告基因分析试剂盒中的裂解液将细胞裂解，以Luminometer荧光酶标仪对renilla和firefly荧光强度进行测定。
7.RNA抽提、反转录和PCR分析
7.1 RNA的提取
细胞经处理后，PBS洗1次，24孔细胞培养板每孔加入200 μl TRIzol试剂，置室温5 min，吸取裂解液入1.5 ml EP管，每管加氯仿（200 μl /ml），摇振，室温放置2-3 min。4℃离心，12000 g，5 min，小心吸取上层水相，移至另1 EP管。加入异丙醇（500 μl/ml），室温静置10 min。4℃离心，12000 g，10 min，弃去异丙醇；加入75%乙醇1 ml，摇振，洗涤沉淀，4℃离心，10000 g，5 min，弃去乙醇，晾干。每管加入适量去RNase的水，取1 μl用分光光度计测OD260/280比值，计算RNA纯度和浓度，用于反转录。
7.2 反转录
取上述提取的RNA各2 μg，行两步法进行逆转录，加入Oligo dT 1 μl，再加入无RNase水至终体积为13.5 μl，65℃反应5 min；之后分别加入5×RT缓冲液4μl，dNTP 0.5μl，RNasin 1μl，M-MLV逆转录酶1μl，37℃反应60 min，cDNA于-80 ℃冰箱保存。将逆转录产物稀释3倍后进行PCR或者Realtime PCR。
7.3 PCR
反应体系为20 ul，参照TAKARA公司的Ex Taq说明书进行，所用引物为：GFP，正义链: 5′CGAGGTACCATGGTGAGCAAGGGCGAG3′（SEQ ID NO.10），反义链: 5′CAGGGGCCCGTC GACTGCAGAATTCGAA 3′（SEQ ID NO.11）； Wnt5a，正义链：5′TGTCTTTGGCAGGGTGAT3′（SEQ ID NO.12），反义链：5′CCTTAGCGTGGATTCGTT 3′（SEQ ID NO.13）；TH，正义链：5′TCTACTGTCCGCCCGTGATT3′（SEQ ID NO.14），反义链：5′AGGCTGGTAGGTTTGATCTTGGTA 3′（SEQ ID NO.15）。
8.Western免疫印迹分析
8.1 蛋白样品的准备
细胞经处理后，PBS洗1次，加入冰RIPA裂解液裂解。使用细胞刮刮下细胞并收集到离心管，移液器吹打30次/ml，冰上静置30 min。经4℃， 20, 000 g/min离心30 min，取上清根据Bradford法检测蛋白浓度。步骤如下：完全溶解蛋白标准品（BSA），取10 μl稀释至100 μl，使终浓度为0.5 mg/ml。蛋白样品用0.9 % NaCl稀释标准品。将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20 μl分别加到96孔板中，加标准品稀释液补足到20 μl。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20 μl。各孔加入200 μl G250染色液，室温放置3-5 min。用酶标仪测定A570的的吸光度。根据标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。
8.2 SDS-PAGE电泳、转膜及封闭
配置12％分离胶和5％浓缩胶，配置跑胶缓冲液，配制方法见8.3。取20 μg蛋白样品与上样缓冲液混和，100℃水浴煮沸5min，离心，上样。先80V电泳20 min，再120V下电泳1 hr左右（以溴酚蓝条带电泳至分离胶近底边即可）。
准备PVDF膜，用甲醇浸泡1 min使膜活化，后与SDS-PAGE电泳胶一起浸泡在转膜缓冲液中10 min使其平衡。制作转膜“三明治”，顺序依次为：负极面（黑色面）-纤维垫-3层滤纸-分离胶-PVDF膜-3层滤纸-纤维垫-正极面（红色面）。250 mA转膜转膜40-120 min（根据蛋白质分子量大小决定）。结束后取出膜，做标记，丽春红染色1 min观察蛋白转膜情况。洗膜缓冲液洗后，配置5％脱脂奶粉，室温封闭PVDF膜1 hr。
8.3抗体孵育
封闭后，用5% 脱脂奶粉封闭液配置一抗孵育液，加于膜上，4℃孵育过夜。一抗包括：鼠抗Nurr1抗体(1:1000)、鼠抗β-actin 抗体(1:6000)。洗膜缓冲液漂洗3×15min，用辣根过氧化酶二抗室温孵育2 hr（山羊抗兔IgG，或山羊抗小鼠IgG，1:2000）。洗膜缓冲液漂洗 3×15 min，挂角晾干，加入SuperSignal ECL荧光显示剂，暗室曝光，曝光时间视荧光强度而定。显影、定影后冲片，晾干。图形用扫描仪（BIORAD GS-800）读取，以Quantity one软件分析荧光强度。
部分液体的配制：
跑胶缓冲液：25mmol/l Tris-base, 0.2mol/l 甘氨酸, 0.1%SDS；
转膜缓冲液：25mmol/l Tris-base, 0.2mol/l 甘氨酸,20％甲醇；
洗膜缓冲液：0.242% Tris base,0.8% NaCl;用1N HCl调pH为 7.6，用前加
0.1％的Tween-20；
封闭液：为5％脱脂奶粉，用洗膜缓冲液配制。
9.免疫荧光染色：
接种在玻片上的细胞经4％多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定30 min， PBS洗3×5 min，以0.2% Triton-X-100 4℃孵育12 min，PBS洗3×5min，用1%山羊血清封闭液孵育30 min，之后加一抗4℃孵育过夜，一抗包括：鼠抗（1:3000）和兔抗TH抗体（1:1000）、鼠抗Nestin抗体（1:600），PBS洗3×5min，加入异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate，FITC)标记（1:500）和四甲基异硫氰酸罗丹明（Tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC）标记（1:1000）的二抗混和，室温下避光孵育2 hr，去二抗孵育液，加入Hoechst染核液20 min，PBS洗3×5min，之后加入抗荧光淬灭剂，用激光共聚焦显微镜显像，荧光强度利用Image-Pro Plus 软件 (Media Cybernetics, MD)分析。
10.microRNA表达谱分析
miRNA表达谱分析采用的是ABI公司的TaqMan miRNA分析试剂盒，对已知的581个小鼠miRNA进行了分析，按照试剂盒说明的步骤进行。
11.统计分析和数据处理
所有数据以均数±标准误差表示（Means ± SEM）。用SPSS 10.0 软件包(SPSS Inc., Chicago, IL) 对所有数据行独立样本t-检验， p < 0.05视为有统计学差异。
二、实验结果
1. TH-GFP表达载体的稳定转染细胞株筛选和基于TH启动子GFP报告细胞的建立
TH-GFP载体信息如图1所示，约10 kb大小的启动子片段克隆入pEGFP-1载体中，因载体中没有供稳定转染筛选的抗性基因，故将此载体与携带Neo基因的pCDNA3.1共转染入CGR8细胞中，以G418筛选两周后，将存活细胞挑取单克隆，并提取基因组DNA进行鉴定，如图2所示，在48个克隆中，有大约12个克隆高表达GFP。将高表达GFP的克隆继续扩增，并接种到PA6细胞上共培养，通过分化为DA神经元以后的GFP荧光表达来鉴定转染的TH-GFP的表达。其中本发明鉴定了5个克隆可以在分化后相对较高的表达GFP荧光（图3，绿色）。同时本发明也对分化的DA神经元进行了TH染色（图3，红色）。由于稳定转染细胞TH-GFP***位点的差异，不同的克隆分化后表达GFP荧光的能力以及GFP荧光与TH阳性染色的细胞共定位也有较大差异，选择了表达GFP荧光最强且与TH染色共定位比例最高（60-70%）的48号克隆（TH-GFP48）进行后续研究。
2. 对流式细胞仪筛选得到的DA神经元进行基因变达分析
将筛选得到的TH-GFP48扩增后形成EB，将EB接种于PA6细胞上进行DA神经元的分化。在分化的第14天，以Accutase消化细胞并过滤为单细胞，通过将PA6与分化的细胞在未包被的培养皿上培养30min使PA6细胞贴壁，以去除基质细胞PA6的影响。将未贴壁的分化细胞以流式细胞仪分选得到GFP阳性的DA神经元细胞。
将分选的细胞一部分接种到具玻片的24孔培养板上继续培养，通过荧光观察以及与明视野的比较，如图4所示，分选的细胞90%以上为GFP阳性的细胞。本发明对分选的GFP阳性细胞，GFP阴性细胞以及分化到第8天的神经前体细胞进行RT-PCR分析。如图所示，本发明检测了Nurr1、Pitx3、、Lmx1a、Wnt5a、AHD2、GDNF、BDNF以及TH等基因的相对表达，发现在GFP阳性的细胞中这几个基因的表达均高于GFP阴性的细胞（图 5）。
3. DA神经元的microRNA表达谱分析
本发明选取了分化至第8天的神经前体细胞、流式细胞仪分选的GFP阳性细胞以及GFP阴性细胞进行了miRNA表达谱分析。miRNA表达谱采用的是ABI公司的qPCR miRNA表达谱分析试剂盒方法。通过miRNA表达谱的相对分析，本发明发现580个小鼠miRNA中有70个miRNA变化在2倍以上，20个变化在5倍以上。如表 1所示为部分变化比较明显以及未有明显变化的miRNA相对表达量(本发明将GFP阳性的细胞miRNA表达量调整为1)及其分析图。其中miR-132的表达变化非常明显，本发明针对miR-132进行了后续研究（SEQ ID NO.16）。发现在分化过程中转染miR-132的抑制剂后，DA神经元的比例比转染对照miRNA抑制剂的有明显提高（图 6），这说明miR-132在DA神经元分化过程中具有重要作用。
表1 不同细胞中miRNA的相对表达水平
| microRNAs | GFP-positive | GFP-negtive | Neural progenitor |
| mmu-miR-101a | 1.00 | 1.25 | 1.33 |
| mmu-miR-106b | 1.00 | 1.22 | 1.06 |
| mmu-miR-126 | 1.00 | 0.85 | 0.89 |
| mmu-miR-132 | 1.00 | 0.09 | 0.21 |
| mmu-miR-133b | 1.00 | 0.04 | 0.07 |
| mmu-miR-16 | 1.00 | 0.68 | 1.43 |
| mmu-miR-17 | 1.00 | 1.03 | 1.58 |
| mmu-miR-17* | 1.00 | 1.33 | 1.33 |
| mmu-miR-182 | 1.00 | 2.42 | 0.97 |
| mmu-miR-186 | 1.00 | 0.56 | 0.93 |
| mmu-miR-204 | 1.00 | 0.74 | 1.52 |
| mmu-miR-205 | 1.00 | 0.96 | 1.04 |
| mmu-miR-20a | 1.00 | 1.12 | 1.24 |
| mmu-miR-467a | 1.00 | 1.98 | 1.4 |
| mmu-miR-720 | 1.00 | 0.77 | 1.14 |
| mmu-miR-7a | 1.00 | 1.62 | 9.85 |
| mmu-miR-7b | 1.00 | 0.1 | 0.07 |
| mmu-miR-9 | 1.00 | 0.29 | 0.13 |
| mmu-miR-9* | 1.00 | 0.88 | 0.25 |
| mmu-miR-92a | 1.00 | 1.08 | 1.26 |
| mmu-miR-92a | 1.00 | 1.08 | 1.26 |
| mmu-miR-93* | 1.00 | 0.73 | 1.04 |
| snoRNA135 | 1.00 | 1.19 | 1.21 |
4. 针对miR-132靶基因的生物信息学分析
MiR-132是脑中表达较高的miRNA，本发明针对miR-132对其可能的靶基因进行了生物信息学分析，发现Nurr1基因是miR-132的一个潜在靶基因，通过对Nurr1基因的miR-132结合位点进行分析，发现在不同种属的Nurr1基因中，其miR-132结合位点具有很高的同源性（图 7所示）。
5. miR-132对Nurr1基因调节的验证
基于以上针对miR-132的生物信息学分析，本发明通过构建Nurr1基因 3’UTR的荧光素酶报告基因，分别在293 T细胞和DA神经元细胞系SK-N-SH上转染进行了荧光素酶报告基因分析，结果显示与转染对照miRNA相比，转染miR-132的293T细胞和SK-N-SH细胞的荧光素酶相对活性明显降低(图 8)。本发明进一步构建了包含3’UTR区域的Nurr1基因的全长cDNA克隆，并将此载体与miR-132共转染入293 T细胞中，通过western blot检测Nurr1的蛋白表达水平，本发明发现miR-132可以调节Nurr1基因的蛋白表达（图 9）。
三、结论
本发明通过建立ES细胞向DA神经元分化以及构建了酪氨酸羟化酶（Tyrosine dehydroxylase, TH）启动子启动的绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）报告***，并用流式细胞仪进行筛选得到了纯度非常高的DA神经元，分别检测了纯化的DA神经元、非DA神经元以及神经前体细胞的microRNA（miRNA）表达谱，并根据其在不同细胞中的相对表达水平发现了多个变化比较明显的miRNA，本发明对其中一个miRNA—miR-132进行了较深入的研究。本发明认为miR-132通过调节重要转录因子Nurr1的表达来调控DA神经元的发育和分化。
本发明的研究首次验证了miR-132在DA神经元发育中的作用，并且本发明鉴定了miR-132的靶基因是DA神经元发育和PD发病中的重要转录因子Nurr1。
转录因子Nurr1是DA神经元分化成熟及功能维持的关键基因，其表达产物为类固醇激素和甲状腺激素核受体大家族中的一种寡核受体。Nurr1基因控制了许多DA神经元相关基因（TH, DAT, AADC, VMAT2, BDNF和GDNF Ret）的表达，是中脑DA神经元发育、分化、成熟和功能维持必不可少的基因，其功能的下降或缺失与DA神经元功能障碍即退变相关。本发明实验室的前期研究表明Nurr1基因能够调控多个影响DA神经元发育和功能维持的关键基因。Nurr1基因对维持中脑高水平Pitx3及维持Lmx1b-Pitx3通路活性而调控Lmx1b、Pitx3时间表达及空间分布定位有着至关重要的作用。Nurr1与这些关键基因共同促使DA前体细胞转变为成熟的DA神经元。在Nurr1敲除的小鼠模型中，中脑DA神经元显示了时间－年龄依赖的进行性功能障碍和细胞数量减少，伴随动物运动功能障碍的出现以及对环境毒素敏感性的增加，提示早年Nurr1的缺失与进行性DA神经元功能障碍及其衰老相关。 本发明首次发现了可以调节Nurr1基因表达miRNA—miR-132。这对于进一步研究Nurr1以及miRNA在帕金森病发病以及临床诊断和治疗中的功能具有重要的意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院
<120> 一种miR-132在制备治疗帕金森病药物中的应用
<130> /
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcggaattcc gacatttctg ccttctcc 28
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggactgcaga gtttgtcaat tattgctggt g 31
<210> 3
<211> 3026
<212> DNA
<213> 小鼠(House mouse)
<400> 3
ggccccgcgc cccccgcggg ggtggcgggc ctcagccacg gcctccgccc cggggctcag 60
ctcggcggtc cgctctccct gccgcgcgcc cggactgcag gacgagctgg agctgggctg 120
ctcgaccact ccgcgcccgg ggactcggcg acctggggcc gggagcgctg ggcagggaga 180
tctgacgggc tggattccca atagctcttt tttaaaatct tggaaacttt gtccttcgct 240
gaattacgac actgtccacc tttaatttcc tcgaaaactc caataactct gctgaagcca 300
tgccttgtgt tcaggcgcag tatgggtcct cgcctcaagg agccagcccc gcttctcaga 360
gctacagtta ccactcttcg ggagaataca gctccgattt cttaactcca gagtttgtca 420
agtttagcat ggacctcacc aacactgaaa ttactgccac cacttctctc cccagcttca 480
gtacctttat ggacaactac agcacaggct acgacgtcaa gccaccttgc ttgtaccaaa 540
tgcccctgtc cggacagcag tcctccatta aggtagaaga cattcagatg cacaactacc 600
agcaacacag ccacctgccc cctcagtccg aggagatgat gccacacagc gggtcggttt 660
actacaagcc ctcttcgccc ccgacaccca gcaccccgag cttccaggtg cagcatagcc 720
cgatgtggga cgatccgggc tcccttcaca acttccacca gaactacgtg gccactacgc 780
atatgatcga gcagaggaag acacctgtct cccgcctgtc actcttctcc tttaagcagt 840
cgcccccggg cactcctgtg tctagctgcc agatgcgctt cgacgggcct ctgcacgtcc 900
ccatgaaccc ggagcccgcg ggcagccacc acgtagtgga tgggcagacc ttcgccgtgc 960
ccaaccccat tcgcaagccg gcatccatgg gcttcccggg cctgcagatc ggccacgcat 1020
cgcagttgct tgacacgcag gtgccctcgc cgccgtcccg gggctctccc tccaatgagg 1080
gtctgtgcgc tgtttgcggt gacaacgcgg cctgtcagca ctacggtgtt cgcacttgtg 1140
agggctgcaa aggtttcttt aagcgcacgg tgcaaaaaaa cgcgaaatat gtgtgtttag 1200
caaataaaaa ctgcccagtg gacaagcgcc gccgaaatcg ttgtcagtac tgtcggtttc 1260
agaagtgcct agctgttggg atggttaaag aagtggttcg cacggacagt ttaaaaggcc 1320
ggagaggtcg tttaccctcg aagccgaaga gcccacagga tccctctccc ccctcacctc 1380
cggtgagtct gatcagtgcc ctcgtcagag cccacgtcga ttccaatccg gcaatgacca 1440
gcctggacta ttccaggttc caggcaaacc ctgactatca gatgagtgga gatgataccc 1500
aacatatcca gcagttctac gatctcctga ccggctctat ggagatcatc agagggtggg 1560
cagagaagat ccctggcttt gctgacctgc ccaaagccga ccaggacctg ctttttgaat 1620
cagctttctt agaattattt gttctgcgct tagcatacag gtccaaccca gtggagggta 1680
aactcatctt ttgcaatggg gtggtcttgc acaggttgca atgcgtgcgt ggctttgggg 1740
aatggattga ttccattgtt gaattctcct ccaacttgca gaatatgaac atcgacattt 1800
ctgccttctc ctgcattgct gccctggcta tggtcacaga gagacacggg ctcaaggaac 1860
ccaagagagt ggaagagcta caaaacaaaa ttgtaaattg tcttaaagac catgtgactt 1920
tcaataatgg gggtttgaac cgacccaact acctgtctaa actgttgggg aagctgccag 1980
aactccgcac cctttgcaca cagggcctcc agcgcatttt ctacctgaaa ttggaagact 2040
tggtaccacc accagcaata attgacaaac ttttcctgga caccttacct ttctaagacc 2100
ttctcccaag cacgtcaaag aactggaaag aaaaaaaaaa taacatccag agggggctgg 2160
tcacatgggc agagagctgg ttgaagtgtc cagttcacct tatctccctt ctgtagaccc 2220
ctagccctca ccccttaagt aaacaaacaa acaaacaaac cacaaataaa aactgtcgct 2280
atttcctaac ctgcaggcag aacctgaaag ggcattttgg ctccggggca tcctggattt 2340
agaaaacgga cagcacacag tacagtggta taaacttttt attatcagtt caaaatcagt 2400
ttgttgttca gaagaaagat tgctaatgta tgatgggaaa tgtttggcca tgcttgcttg 2460
ttgcagttaa gacaaatgta acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 2520
accttaatgg gaccctccta ttttgccctt taacaagact tcaaagtttt ctgctgtaaa 2580
gaaagctgta atatatagta aaactaaatg ttgcgtgggt ggcatgaatt gaaggcagag 2640
gcttgtaaat ttatccaatg cagtttggct ttttaaatta ttttgtgcct atttatgaat 2700
aaatattaca aattctaaaa agtaagtgtg tttgcaaaaa aaaaaaaaga aaataactac 2760
ataaaaaggg gacaagcatg tgattctagg ttgaagatgt tataggcact tgctacttca 2820
gtaatgtcta tattatataa atagtatttc agacactatg tagtctgtta gattttataa 2880
agattggtag ttatctgagc ttaaacattt ttctcaattg tataataggt gggcacaagt 2940
atcagtacat tggaaaatcc tgacaaaagg gacacatagt gtttgtaaca ccgcccaaca 3000
ttccttgttt gtaagtgttg tatgta 3026
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctacctgtct aaagtgtagg ggaagctgcc a 31
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tggcagcttc ccctacactt tagacaggta g 31
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggcaagcttt ttgtccttcg ctgaattacg a 31
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agaactgctg gatatgttgg gt 22
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<212> DNA
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<400> 8
agaactgctg gatatgttgg gt 22
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<211> 31
<212> DNA
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<400> 9
ggctctagaa aaggcagtga ctcatctcat g 31
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cgaggtacca tggtgagcaa gggcgag 27
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
caggggcccg tcgactgcag aattcgaa 28
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tgtctttggc agggtgat 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
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aggctggtag gtttgatctt ggta 24
<210> 16
<211> 22
<212> RNA
<213> miR-132
<400> 16
uaacagucua cagccauggu cg 22
Claims (3)
1.一种miR-132在制备治疗帕金森病药物中的应用，所述的miR-132具有SEQ ID NO.16所述的核苷酸序列。
2.一种miR-132作为诊断分子标志物在制备诊断帕金森病产品中的应用，所述的miR-132具有SEQ ID NO.16所述的核苷酸序列。
3.根据权利要求1和2任一所述的应用，其特征在于，所述的miR-132的靶基因是转录因子Nurr1。
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