CN103018382A - 一种指纹图谱相似度的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种指纹图谱相似度的检测方法，其特征在于：在标准样品中加入适量标准样品不含有的内标成分；测定标准样品中n个成分和内标成分的峰面积，分别以n个成分的峰面积与内标成分峰面积的比值为坐标，确定一个n维空间的坐标点；在待测样品中加入等含量的同一内标成分，同法得到待测样品所确定的n维空间的坐标点；以标准样品的坐标点和待测样品的坐标点的在n维空间的距离作为相似度，距离越小，两者越相似，待测样品的质量越好。本发明可以准确高效的判别待测样品质量的优劣。

Description

一种指纹图谱相似度的检测方法

技术领域

本发明涉及指纹图谱相似度的检测方法，属于复杂成分体系的质量控制领域，具体涉及中药等天然产物以及以其为原料的制剂的质量控制方法，可以准确高效地确定待测样品的质量优劣。

背景技术

指纹图谱技术由于能整体上分析复杂化学物质组成的稳定性，已成为国内外广泛接受的含有复杂化学成分的质量评价模式，它可以比较全面的反映所含化学成分的种类和数量，从而更好地评价中药及其制剂、烟草、食品等的质量。近年来，许多国家均已接受指纹图谱用来评价中药质量。美国FDA在有关草药质量控制中提出可以建立并申报药材及其制剂的色谱指纹图谱，以考察草药产品批间质量的一致性。英国草药典、印度草药典、德国药用植物协会、加拿大药用及芳香植物学会等均把指纹图谱作为中药质量控制的标准之一。

要形成一实用的指纹图谱，首先要收集大量合格的样本，通过色谱法或者光谱法等建立指纹图谱，在此基础上选择合适的方法，形成标准样品，后续待检测的样本则是通过一定的检测方法检测出与标准样品的相似度，通过相似度程度指数来评价待测样品的真伪、品质好坏或质量稳定等情况。

常用的相似度检测方法，主要是在标准样品和待测样品中选取一个共同含有的成分作为参比峰，以所有共有峰与参比峰的比值确定多维空间的坐标点，然后利用相关系数法或夹角余弦法检测标准样品和待测样品的相似度。但现有方法检测出的相似度与样品中所含的各成分的比值有关，而与其含量无关，如待测样品含有标准样品中所有成分，且每个成分含量是标准样品中相应成分含量的二分之一，用传统方法检测两者相似情况，会得出两者100％相似。

因此，一个既与样品中所含的各成分的比值有关，且与各成分含量有关的简便易行的相似度检测方法，对提升指纹图谱的准确度和应用范围有极大帮助。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种新的指纹图谱相似度的检测方法，该方法检测出的相似度，不但与样品中各成分的比值有关，且与各成分的含量有关，从而提高指纹图谱的准确度和应用范围。

实现上述发明目的的技术方案是：

一种指纹图谱相似度的检测方法，其特征在于步骤如下：

一种指纹图谱相似度的检测方法，其特征在于步骤如下：

(1)在标准样品中加入标准样品不含有的成分，作为内标；

(2)测定标准样品中n个成分和内标成分的峰面积，分别以n个成分的峰面积(Y₁，Y₂，...Y_n)与内标成分峰面积(S₂)的比值(Y₁/S₂，Y₂/S₂，...Y_n/S₂)为坐标，确定标准样品在n维空间的坐标B_Y＝(Y₁/S₂，Y₂/S₂，...Y_n/S₂)^T；

(3)在待测样品中加入同样的内标成分，并使其含量与标准样品中相同，以待测样品中n个成分的峰面积(X₁，X₂，...X_n)与内标成分的峰面积(S₁)的比值(X₁/S₁，X₂/S₁，...X_n/S₁)，确定标准样品在n维空间的坐标B_X＝(X₁/S₁，X₂/S₁，...X_n/S₁)T；

(4)以标准样品的坐标点(B_Y)和待测样品的坐标点(B_X)的在n维空间的距离(d(_X，Y))作为相似度检测值，距离越小，两者越相似，待测样品的质量越好。所述的(d(_X，Y))具体函数如下：

$d_{\mathrm{ij}}=\sqrt{[\underset{k=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(\frac{X_k}{S_1}-\frac{Y_k}{S_2})}^2}]$

其中：n-共有峰的数目，X_k-待测样品的第k个峰的峰面积；Y_k-标准样品中的第k个峰的峰面积S₁-待测样品中的内标成分的峰面积S₂-标准样品内标成分的峰面积。

前述指纹图谱相似度的检测方法，其特征是内标成分在含量测定前任意时间加入。

前述指纹图谱相似度的检测方法，其特征是B_X与B_Y之间的距离采用的检测方法是欧式距离、马氏距离或巴氏距离。

前述指纹图谱相似度的检测方法，其特征是将B_X与B_Y之间的距离的e^-x或cos(atan(x))函数作为相似度，使其数值区间由(0，+∞)转变(1，0)。

与现有技术相比，本发明方法具有以下优点：

1、利用本方法检测出的指纹图谱相似度，可与样品中各成分的比例和含量均相关，从而扩大了指纹图谱的准确度和应用范围。

2、由于在标准样品和待测样品中加入的内标成分含量一致，可在一定程度上降低由于化学成分检测设备导致的误差。

3、由于利用样品中所含成分的峰面积与外源性内标成分的峰面积的比值形成多维空间的坐标点，可使标准样品和待测样品在不同品牌的检测仪器上分别检测成为可能，从而提高指纹图谱的适用性。

附图说明

图1为加了黄芩素的醋芫花标准样品的高效液相色谱图；

标注1-6，8-11为10个共有峰，其中6为木犀草素，7为黄芩素，8为芹菜素，9为羟基芫花素，10为芫花素，11为芫花酯甲；

图2为加了黄芩素的1号醋芫花待测样品高效液相色谱图。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明的技术手段，以下结合附图及实施例，对依据本发明提出的一种指纹图谱相似度检测方法应用于醋芫花指纹图谱的具体实施方式及工作原理进一步说明如下：

芫花为瑞香科植物的干燥花蕾，用于水肿胀满，胸腹积水，痰饮积聚，气逆咳喘，二便不利。由于芫花有毒，历来医家慎用，临床上常用用醋炙法制成的醋芫花，但传统的指纹图谱相似度检测方法无法区别生芫花和醋芫花。故选用本发明的的检测方法，具体操作步骤如下：

1.通过前期研究确定醋芫花的标准样品，将醋芫花标准样品粉碎后，过60目筛，置60℃烘箱中干燥1h，精密称定0.5g置具塞三角瓶中，精密加入25mL 50％乙醇，密塞，称定重量，超声30min，取出放冷，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，加入黄芩素对照品(内标成分)，使黄芩素浓度为0.013mg/ml，提取液过0.45μm滤膜。

2.滤液利用高效液相色谱仪进行分析，色谱条件为色谱柱：大连依利特SinoChrom ODS-BP C₁₈(250×4.6mm，5μm)；流动相：0.05％甲酸水(A)-0.05％甲酸乙腈(B)；流速：1.0mL/min；检测波长：332nm；柱温：30℃；进样量：20μL；梯度洗脱程序见表1。最终形成的液相色谱图见附图1，确定其中1-11号峰为检测相似度的共有峰，并从高效液相色谱仪中读取相应的峰面积。

表1梯度洗脱程序

时间	梯度(A)	梯度(B)
			0min	95％	5％
10min	85％	15％
			25min	80％	20％
35min	80％	20％
			50min	70％	30％
60min	70％	30％
			75min	25％	75％

80min	0％	100％
			90min	0％	100％

3.将待测的10批生芫花(以下表格中简称：“生品”)和10批醋芫花(以下表格中简称：“醋品”)，分别粉碎后，过60目筛，置60℃烘箱中干燥1h，精密称定0.5g置具塞三角瓶中，精密加入25mL 50％乙醇，密塞，称定重量，超声30min，取出放冷，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，加入黄芩素对照品，使黄芩素浓度也为0.013mg/ml，提取液过0.45μm滤膜，滤液利用高效液相色谱仪进行分析，色谱条件为色谱柱：大连依利特SinoChrom ODS-BP C₁₈(250×4.6mm，5μm)；流动相：0.05％甲酸水(A)-0.05％甲酸乙腈(B)；流速：1.0mL/min；检测波长：332nm；柱温：30℃；进样量：20μL；梯度洗脱程序见表1。最终形成的其中一幅液相色谱图见图2，从高效液相色谱仪中读取与标准样品相应共有峰的峰面积。

4.根据如下公式见下检测各批次生芫花和醋芫花与标准样品的相似度。具体结果见表2。同时比较传统的相关系数法、夹角余弦和以芫花本身含有的成分芹菜素为内标的距离法检测各批次生芫花和醋芫花与标准样品的相似程度，结果分别见表3、表4、表5。

$d_{\mathrm{ij}}=\sqrt{[\underset{k=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(\frac{X_k}{S_1}-\frac{Y_k}{S_2})}^2}]$

(n-共有峰的数目，本例中n＝10，X_k-待测样品的第k个峰的峰面积，Y_k-标准样品中的第k个峰的峰面积，S₁-待测样品中的黄芩素的峰面积，S₂-标准样品黄芩素的峰面积)。

表2生芫花和醋芫花与标准样品的相似度(本发明方法，以黄芩素为内标)

生品	相似度	醋品	相似度
				R1	1.0579	C1	0.4279
R2	0.7051	C2	0.4591
				R3	0.6605	C3	0.3079
R4	0.7538	C4	0.4722
				R5	1.0320	C5	0.2327
R6	0.6653	C6	0.3131
				R7	0.8760	C7	0.3271
R8	0.6583	C8	0.3352
				R9	0.5830	C9	0.1073
R10	0.5906	C10	0.2755

表3生芫花和醋芫花与标准样品的相似度(传统的相关系数法)

生品	相似度	醋品	相似度
				R1	0.7610	C1	0.9648
R2	0.9571	C2	0.9599
				R3	0.9862	C3	0.9845
R4	0.8819	C4	0.9781
				R5	0.9776	C5	0.9900
R6	0.9904	C6	0.9928
				R7	0.9532	C7	0.9855
R8	0.9218	C8	0.9863
				R9	0.9693	C9	0.9976
R10	0.9743	C10	0.9982

表4生芫花和醋芫花与标准样品的相似度(夹角余弦法)

生品	相似度	醋品	相似度
				R1	0.8904	C1	0.9837
R2	0.9802	C2	0.9815

R3	0.9931	C3	0.9927
				R4	0.9418	C4	0.9893
R5	0.9896	C5	0.9954
				R6	0.9955	C6	0.9966
R7	0.9782	C7	0.9930
				R8	0.9643	C8	0.9928
R9	0.9857	C9	0.9988
				R10	0.9881	C10	0.9992

表5生芫花和醋芫花与标准样品的相似度(以芹菜素为内标的距离法)

生品	相似度	醋品	相似度
				R1	1.3745	C1	0.5476
R2	0.5792	C2	0.4750
				R3	0.2710	C3	0.3563
R4	0.9124	C4	0.5753
				R5	0.3947	C5	0.2644
R6	0.1830	C6	0.1716
				R7	0.4883	C7	0.2651
R8	0.6401	C8	0.3001
				R9	0.5493	C9	0.1464
R10	0.5040	C10	0.1525

结果可看出用本发明检测的生芫花与标准样品的相似度均在0.5以上，醋芫花与标准样品的相似度均在0.5以下，能较好的区分生芫花和醋芫花。相关系数法，夹角余弦法检测出来的相似度值都在0.9以上(个别批次除外)，但没有一个确切的界限值能区分所有生芫花和醋芫花，以芫花本身含有的成分芹菜素为内标，以距离系数法检测出的相似度，生芫花和醋芫花也没有确切的界限值能区分。因此本发明为生芫花和醋芫花提供了一个有效的区分方法。

Claims (5)

1.一种指纹图谱相似度的检测方法，其特征在于步骤如下：

(1)在标准样品中加入标准样品不含有的成分，作为内标；

(2)测定标准样品中n个成分和内标成分的峰面积，分别以n个成分的峰面积(Y₁，Y₂，...Y_n)与内标成分峰面积(S₂)的比值(Y₁/S₂，Y₂/S₂，...Y_n/S₂)为坐标，确定标准样品在n维空间的坐标B_Y＝(Y₁/S₂，Y₂/S₂，...Y_n/S₂)^T；

(3)在待测样品中加入同样的内标成分，并使其含量与标准样品中相同，以待测样品中n个成分的峰面积(X₁，X₂...X_n)与内标成分的峰面积(S₁)的比值(X₁/S₁，X₂/S₁，...X_n/S₁)，确定标准样品在n维空间的坐标B_X＝(X₁/S₁，X₂/S₁，...X_n/S₁)^T；

(4)以标准样品的坐标点(B_Y)和待测样品的坐标点(B_X)的在n维空间的距离(d(_X，Y))作为相似度检测值，距离越小，两者越相似，待测样品的质量越好。

2.根据权利要求1所述指纹图谱相似度的检测方法，其特征是内标成分在含量测定前任意时间加入。

3.根据权利要求1所述指纹图谱相似度的检测方法，其特征是B_X与B_Y之间的距离采用的检测方法是欧式距离、马氏距离或巴氏距离。

4.根据权利要求1所述指纹图谱相似度的检测方法，其特征是将B_X与B_Y之间的距离的e^-x或cos(atan(x))函数作为相似度，使其数值区间由(0，+∞)转变(1，0)。

5.根据权利要求1所述指纹图谱相似度的检测方法，其特征在于所述的(d(_X，Y))具体函数如下：

$d_{\mathrm{ij}}=\sqrt{[\underset{k=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(\frac{X_k}{S_1}-\frac{Y_k}{S_2})}^2}]$

其中：n-共有峰的数目，X_k-待测样品的第k个峰的峰面积；Y_k-标准样品中的第k个峰的峰面积S₁-待测样品中的内标成分的峰面积S₂-标准样品内标成分的峰面积。

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