CN103014171A - 一种利用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构的方法 - Google Patents

Abstract

DGGE和TGGE这两项技术在微生物菌群结构研究中存在的主要不足是，无法通过用于电泳分离的DNA片段上携带的有限序列信息对其真正代表的微生物进行精准的分子鉴定。针对这一点，本发明提供了一种基于特定rDNA长片段的真菌菌群结构分析方法，所述特定rDNA长片段是指一段包含18SrDNA近全长序列和ITS序列的片段，它是由靶向18SrDNA序列的上游引物NS1和靶向ITS序列的下游引物扩增得到的，扩增产物长度大于2000bp。利用特定rDNA长片段的DGGE或TGGE分析方法，可以在保证电泳分离效果的情况下同时获得18SrDNA近全长序列和ITS序列，这样就可以在保证真菌菌群多样性得到良好解析的同时获取十分精准的菌群结构信息，因此本发明可以使DGGE和TGGE技术更加有效地用于真菌菌群结构的解析。

Description

一种利用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构的方法

技术领域

本发明涉及一种真菌菌群结构的解析方法，尤其是指利用特定rDNA长片段来进行解析。

背景技术

DGGE（变性梯度凝胶电泳）和TGGE（温度梯度凝胶电泳）是两种基于DNA片段序列差异的电泳技术，目前已经成为微生物分子生态学的重要手段，被广泛用于菌群多样性研究。这两种技术可以分离长度相同但序列不同的DNA片段，其分离原理基本一致——是依靠双链DNA在含有化学变性剂梯度（DGGE）或者温度梯度（TGGE）的凝胶当中泳动时具有不同的解链行为来实现的。各种类的微生物都拥有其特有的rDNA序列，这些序列可以作为它们的标识，并且均可以通过DGGE和TGGE进行分离。因此这两项技术通常和rDNA分子鉴定技术相结合用于将微生物菌群多样性信息转化为微生物菌群结构信息。而对于真菌菌群结构的解析而言，常采用18S rDNA序列或ITS序列上的某一段可变区做为目标片段。

上述两项技术虽然是微生物生态研究中解析菌群多样性的重要手段，但是它们也存在着难以分析长片段（>500bp）的不足，这对于菌群结构信息的准确获取是十分不利的。具体来说，DGGE和TGGE均对200-500bp的DNA片段具有较好的分离效果，超过500bp则分辨率都会显著下降——这样就会影响到菌群多样性的解析。虽然小于500bp的短片段有利于DGGE和TGGE的分离，但是这样的片段却无法满足之后分子鉴定的需要。因为这样的片段（200-500bp）携带的序列信息有限，即使是500bp也分别只占到作为常用的真菌分子鉴定标准——18S rDNA全长序列的1/4和ITS序列的2/3左右，因此往往无法获得精准的分子鉴定结果。

发明内容

为了克服上述DGGE和TGGE技术在真菌菌群结构解析中的不足，本发明提供了一种基于特定rDNA长片段的分析方法：可以在保证分离效果的情况下，同时获得18S rDNA近全长序列和ITS序列用于分子鉴定，因此将会得到十分精准的真菌菌群结构信息，这样DGGE和TGGE技术就可以更加有效地用于真菌菌群结构的解析。准确获知样品中微生物种属信息是微生物生态研究中最基本也是最重要的一环，因此本发明对真菌菌群结构研究领域具有较大的意义。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一种利用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构的方法，所述特定rDNA长片段是指一段包含18S rDNA近全长序列和ITS序列的片段（图1），它是由靶向18S rDNA序列的上游引物NS1和靶向ITS序列的下游引物扩增得到的；所述18S rDNA近全长序列是指一端起始于引物NS1对应区域直至另外一端的序列，长约1780bp，相当于Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列的20-1800位点；所述靶向ITS序列的下游引物必须与NS1构成引物对特异性地扩增两者结合位点之间的片段，并且扩增片段长度大于2000bp。

本发明用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构时采用的是DGGE或TGGE技术。

所述方法包括如下步骤：

a、提取样品中微生物总基因组DNA；

b、采用靶向18S rDNA序列的上游引物NS1和靶向ITS序列的下游引物扩增所述特定rDNA长片段；

c、将步骤b中扩增的特定rDNA长片段进行DGGE或TGGE分析；

d、割胶回收特定rDNA长片段条带，采用同样的引物扩增特定rDNA片段全长序列或者分别采用靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对扩增其包含的18S rDNA片段和ITS片段；所述同样的引物是指步骤b中用于扩增特定rDNA长片段的引物；

e、将步骤d中获得的特定rDNA长片段或者18S rDNA片段和ITS片段进行测序，再将测定的18S rDNA序列和ITS序列分别提交到NCBI上利用Blast在GeneBank数据库中进行相似性搜索，最终结合两者的结果综合判定对应菌株的种属。

其中，关于靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对的选取，是将扩增特定rDNA长片段所采用的靶向18S rDNA序列的上游引物NS1和靶向ITS序列的下游引物分别作为靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对之一。

其中，对特定rDNA片段进行直接测序，如前所述可以得到长约1780bp的18S rDNA序列和剩下的ITS序列。

本发明的显著效果：利用特定rDNA长片段的DGGE或TGGE分析方法，可以在保证电泳分离效果的情况下同时获得18S rDNA近全长序列和ITS序列，这样就可以在保证真菌菌群多样性得到良好解析的同时获取十分精准的菌群结构信息，因此本发明可以使DGGE和TGGE技术更加有效地用于真菌菌群结构的解析。

附图说明

图1是特定rDNA长片段示意图。图中展示出18S rDNA片段及与其相邻的ITS片段，其中黑色区带部分表示的是18S rDNA片段，白色区带部分表示的是ITS片段，双箭头区域表示的是18S rDNA远离ITS序列的末端区域。

图2是16种真菌的18S rDNA末端区域的序列比对图谱。图中1-16表示16种菌的编号，所代表的种属详见表1，图中NS1表示引物；图中ruler标识的1-160区域为低GC含量片段，而160-280区域含有三个高GC含量片段，分别用三个方框大致标出。引物NS1的靶向位点位于18S rDNA远离ITS序列的末端区域中。虽然收集到的各真菌的18S rDNA序列在远离ITS序列的末端起始情况不一，但至少起始于第20位点，为了分析方便，部分真菌的18S rDNA序列末端以引物NS1序列补齐，这样并不会影响到其低GC含量的序列特性。

图3为引物对NS1-ITS4扩增片段的琼脂糖凝胶电泳检测图谱。

图4为引物对NS1-ITS4扩增片段的DGGE分析图谱，图中四条可识别条带分别用a、b、c和d在所在位置处进行标识。

图5为由引物对FR1-NS1扩增得到的18S rDNA片段的琼脂糖凝胶电泳检测图谱，图中M表示DNA Marker，a、b、c和d分别对应于图4中DGGE的四条条带。此处a、b、c和d四条条带测序结果分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

图6为ITS片段的琼脂糖凝胶电泳检测图谱，图中M表示DNA Marker，a、b、c和d分别对应于图4中DGGE的四条条带。此处a、b、c和d四条条带测序结果分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。

图7为条带b片段的18S rDNA序列的分子鉴定结果截图。

图8是为条带b片段的ITS序列的分子鉴定结果截图。

 

具体实施方式

一、本发明基于特定rDNA长片段的DGGE或TGGE分析原理：

经过对目前已知的各主要真菌种属的18S rDNA序列进行分析发现，18S rDNA远离ITS序列的末端区域（参见图1）具有特殊的序列特性：其一端含有160bp左右的低GC区域，相当于Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列（Accession Number为Z75578）的20-183位点，其平均GC含量只有35%左右，并且具有极高的可变性；紧邻低GC区域的另一端含有三个排列紧凑的高GC区域，分别相当于Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列的184-202位点、223-244位点和268-291位点，平均GC含量在65%以上，并且具有良好的保守性。这样就导致18S rDNA远离ITS序列的末端区域拥有低熔解区和高熔解区，并且两者之间的熔解性质差异将十分悬殊。因此包含该末端区域的片段可以在低变性梯度的条件下利用低熔解区差异进行分离，剩下的部分相当于高熔解区则不会发生解链可以充当GC夹板。

在本实施例进行之前，以福建红曲黄酒酿造用曲中的真菌菌群的18S rDNA序列为例，对其远离ITS序列的末端区域的序列特性进行分析。实验室前期从四种典型福建红曲黄酒酿造用曲中分离出23株真菌纯菌株，经鉴定共有16种。在Silva数据库中收集这些真菌种属的18S rDNA序列，利用clustalx软件（clustalx 1.8）进行比对，截取引物NS1对应末端区域的比对结果如图2所示；对引物NS1对应末端区域的序列熔解特性进行统计分析，结果如表1所示。结合图2和表1可知，所收集到的18S rDNA序列一端含有160bp左右的低GC区域，相当于Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列（Accession Number为Z75578）的20-183位点，其平均GC含量只有35%左右，并且具有极高的可变性；紧邻低GC区域的另一端含有三个排列紧凑的高GC区域（图2方框部分），分别相当于Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列（Accession Number为Z75578）的184-202位点、223-244位点和268-291位点，平均GC含量在65%以上，并且具有良好的保守性。这样就导致18S rDNA远离ITS序列的末端区域拥有低熔解区和高熔解区，并且两者之间的熔解性质差异将十分悬殊。因此包含该末端区域的片段可以在低变性梯度的条件下利用低熔解区差异进行分离，剩下的部分相当于高熔解区则不会发生解链可以充当GC夹板。经过分析，目前已知的各主要真菌种属的18S rDNA序列也具有相同的特性。

 

表1 16种真菌的18S rDNA末端区域的序列特性信息

注：高GC区1、2、3分别对应于图2中从左到右的三个方框区域。其中8和12两种真菌其18S rDNA序列来自GeneBank数据库，其余14种真菌的18S rDNA序列均来源于Silva数据库。

 

如前所述，特定rDNA长片段是指一段包含18S rDNA近全长序列和ITS序列的片段（参见图1），它是由靶向18S rDNA序列的上游引物NS1和靶向ITS序列的下游引物扩增得到的；以Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列（Accession Number为Z75578）为参照，由于引物NS1的靶向区域位于其20-38位点，因此所述特定的rDNA长片段包含了上述18S rDNA远离ITS序列的末端区域。也就是说，特定rDNA长片段在进行DGGE或TGGE分析时，其分离主要取决于其末端约160bp的低GC区域，而剩下的部分由于三个紧邻低GC区域的高熔解区的存在则不会发生解链可以充当GC夹板，因此可以在保证分离效果的同时获得超过2000bp的序列信息。

 

二、本发明的真菌菌群结构解析方法包含如下步骤：

a、提取样品中微生物总基因组DNA；

b、采用靶向18S rDNA序列的上游引物NS1和靶向ITS序列的下游引物扩增所述特定rDNA长片段；

c、将步骤b中扩增的特定rDNA长片段进行DGGE或TGGE分析；

d、割胶回收特定rDNA长片段条带，采用同样的引物扩增特定rDNA片段全长序列或者分别采用靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对扩增其包含的18S rDNA片段和ITS片段；所述同样的引物是指步骤b中用于扩增特定rDNA长片段的引物；

e、将步骤d中获得的特定rDNA长片段或者18S rDNA片段和ITS片段进行测序，再将测定的18S rDNA序列和ITS序列分别提交到NCBI上利用Blast在GeneBank数据库中进行相似性搜索，最终结合两者的结果综合判定对应菌株的种属。

其中，靶向18S rDNA序列的上游引物限定为NS1；而靶向ITS序列的下游引物需要能与NS1构成引物对特异性地扩增两者结合位点之间的片段，例如ITS2或者ITS4。

其中，对于特定rDNA长片段包含的18S rDNA和ITS片段的序列信息的获取，采用直接对特定rDNA长片段进行测序的方式能够获取完整的序列信息；也可以先分别采用靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对扩增其包含的18S rDNA片段和ITS片段，再对扩增出的18S rDNA片段和ITS片段进行测序从而获取大部分的序列信息，这种方式相比对大于2000bp的特定rDNA长片段进行直接测序费用更低。在后一种方式中，关于靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对的选取，应视用于DGGE分析的特定rDNA长片段，分别取能扩增得到的尽可能长的18S rDNA片段（长度应不少于1600bp）和ITS片段的引物对，这样才能获得更多的序列信息用于后续的分子鉴定。如上所述，特定rDNA长片段是由靶向18S rDNA序列的上游引物NS1和靶向ITS序列的下游引物扩增得到的，因此这两个引物可以分别作为靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对之一。

其中，结合18S rDNA序列和ITS序列的分子鉴定结果综合综合判定对应菌株的种属是指，在18S rDNA序列和ITS序列分别判定的结果中寻找共同的种属，由此得到的对应菌株的种属情况将更加准确和全面。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于此。

实施例1：

本实施例用到的引物序列（5’到3’）如下：

FR1（SEQ ID NO.1）：AICCATTCAATCGGTAIT

NS1（SEQ ID NO.2）：GTAGTCATATGCTTGTCTC

ITS1（SEQ ID NO.3）：TCCGTAGGTGAACCTGCGG

ITS4（SEQ ID NO.4）：TCCTCCGCTTATTGATATGC

本实施例以一种来源于龙岩地区的福建红曲黄酒酿造用曲为研究对象，采用DGGE技术对引物对NS1-ITS4的扩增片段进行分析，用于解析酒曲中的真菌菌群结构。本实施例具体步骤及结果如下：

1、  酒曲中微生物总基因组DNA的提取

参照文献（Heng Zhu, Feng Qu and Li-Huang Zhu. Isolation of genomic DNAs from plants, fungi and bacteria using benzyl chloride. Nucleic Acids Research. 1993,21（2）:5279-5280.）采用氯化苄法提取酒曲中微生物的总基因组DNA。

2、  特定rDNA长片段的扩增

以步骤1中提取的微生物总基因组DNA为模板，采用引物对NS1-ITS4扩增真菌菌群rDNA上包含18S rDNA近全长序列和ITS序列的片段。PCR体系如表2所示，PCR条件为：95℃预变性7min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸4min，循环36次；72℃终延伸20min。扩增结束后，取4μL反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测，图谱如图3所示，由图3可看出扩增结果条带单一，扩增效果良好。参照DNA Marker可知，图中条带大于2000bp，符合NS1-ITS4扩增片段的长度范围，以Saccharomyces cerevisiae 菌株 YJM789的rDNA序列（Accession Number为JQ277730.1）为例，其NS1-ITS4扩增片段的长度为2590bp。

 

表2 PCR体系成份表

3、特定rDNA长片段的DGGE分析

    DGGE分析步骤参照文献（Muyzer G,Waal EC,Uitterlinden AG.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl.Environ.Microbiol,1993,59: 695-700.）进行。电泳条件：胶浓度为4%，变性剂梯度为20%-40%，控温为60℃，电压为120V，时间为16h。DGGE图谱（图4）显示出四条分明的可识别条带，就多样性而言这与采用其它常用的真菌PCR-DGGE引物探究的结果一致（如采用NS1-GCfung引物，其扩增片段长度约为300bp，结果未展示）。因此，这里采用所扩增的长片段并没有影响到DGGE对酒曲中真菌多样性的分析结果。

4、割胶回收特定rDNA长片段条带并分别扩增18S rDNA片段和ITS片段

对图4中的4条DGGE条带进行割胶回收，加50ul灭菌去离子水冻存过夜，取1uL回收液做为模板，分别采用引物对FR1-NS1引物和引物对ITS1-ITS4扩增18S rDNA近全长片段和ITS片段。引物对FR1-NS1的扩增体系参照表2，扩增条件为：95℃预变性7min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min30s，循环36次；72℃终延伸12min；引物对ITS1-ITS4,的扩增体系参照表2，扩增条件为：95℃预变性7min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环36次；72℃终延伸12min。扩增的18S rDNA片段和ITS片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，图谱分别如图5和图6所示。由图5和图6可以看出，扩增的片段条带单一，扩增效果良好。

5、进行序列测定和分子鉴定

对扩增得到的18S rDNA片段和ITS片段进行测序（测序结果详见序列表），测定的序列提交到NCBI上利用Blast在GeneBank数据库中进行相似性搜索。以图4中的b条带为例，其18S rDNA近全长序列和ITS序列分子鉴定结果截图分别如图7和图8所示。由18S rDNA近全长序列的相似性搜索结果根据得分判断，条带b对应的菌较有可能是Pichia guilliermondii或Debaryomyces hansenii（需要指出的是，虽然Marine yeast得分也很高，但它是指来源于海洋的酵母而非分类学上的种属名称）；在得分最高的几个菌中，Pichia guilliermondii出现的次数最多，而且得分最高的种属正是Pichia guilliermondii。由ITS序列的相似性搜索结果根据得分判断，条带b对应的菌较有可能是Pichia guilliermondii或Meyerozyma guilliermondii；在得分最高的几个菌中，Pichia guilliermondii出现的次数最多，而且得分最高的种属正是Pichia guilliermondii。综合ITS序列和18S rDNA近全长序列的比对结果，可知条带b对应的菌种最有可能是Pichia guilliermondii。对其它条带对应菌种的种属鉴定做相同的分析和处理，结果详见表3：

表3 综合18S rDNA近全长序列和ITS序列的种属鉴定结果

对于条带d对应的菌种，表3中18S rDNA近全长序列和ITS序列的分子鉴定结果为Penicillium paneum、Penicillium solitum和Penicillium expansum这三种，都属于Penicillium属。在NCBI上的Taxonomy数据库中查询发现Penicillium是一个种类庞大的属，所以其分子鉴定结果难以精确到某一种。条带a、条带c和条带d对应的菌种都能鉴定到种水平，由此可见综合18S rDNA近全长序列和ITS序列进行分子鉴定往往能够获取较为精准的分子鉴定结果。反之，如果只采用18S rDNA近全长片段或ITS片段的一部分序列，分子鉴定往往会出现出现多种（同属或不同属）得分一致的情况，难以进行精准的判断。针对这一点，以条带b片段的18S rDNA不同片段序列的分子鉴定情况为例进行说明，分析过程如下：

采用18S rDNA不同片段序列进行分子鉴定，结果如表4所示。其中FR1-FF390是常见的一对真菌PCR-DGGE引物，当采用其扩增片段序列（长度约为350bp，相当于Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列的1317-1665位点）进行分子鉴定时，结果出现了多种最有可能的真菌种属；当采用FR1-NS3引物的扩增片段（长度约为1100bp，相当于Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列的553-1665位点）时，则锁定在P.guilliermondii、D.hansenii以及Candida属的5种之中；而18S rDNA近全长序列即FR1-NS1扩增片段（长度约为1650bp，相当于Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列的20-1665位点）则进一步将其锁定在P.guilliermondii和D.hansenii这两种菌之间。最终结合ITS序列和18S rDNA近全长序列可以将其确定为P.guilliermondii。通过条带b片段的18S rDNA不同长度片段序列的分子鉴定结果可以看出，随着序列信息量的增加，分子鉴定结果越精准。条带a、条带c和条带d具有相似的情况（结果未展示），同样也证明了这一点。

表4 本实施例中得到的18S rDNA片段序列和ITS片段序列以及18S rDNA不同片段序列的分子鉴定结果

注：表4中的P.guilliermondii、D.hansenii、P.caribbica、D.mycophilus分别是指Pichia guilliermondii、Debaryomyceshansenii、Pichiacaribbica、 Debaryomycesmycophilus。

虽然本发明效果以实施例践证，但其并非用以限定本发明，本发明的保护范围以权力要求书部分所界定的为准。

<110>福州大学

<120>一种利用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构的方法

<160> 12

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

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<222> (2,17)

<223> n=i

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<210> 2

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<212> DNA

<213>人工序列

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<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

 

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<210> 5

<211> 1614

<212> DNA

<213>多枝横梗霉属（Lichtheimia ramose）

 

<400> 5

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<210> 6

<211> 1649

<212> DNA

<213>季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）

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aaatgctttc gcagtagtta gtcttcagta gatctaagaa tttcacctct gacaactgaa       780

tactgatgcc cccgaccgtc cctattaacc attacgatgg tcctagaaac caacaaaata       840

gaaccataac gtcctattct attattccat gctaatatat tcgagcaaag ggcctgcttt       900

gaacactcta attttttcaa agtaaaagtc ctggttcgcc aaacaccaca agggcgaatg       960

attagccaga aggaaaggct cggttgggtc cagtactcgc caaaaaggcg gaccggccaa      1020

ccaagcccaa agttcaacta cgagcttttt aactgcaaca actttaatat acgctattgg      1080

agctggaatt accgcggctg ctggcaccag acttgccctc caattgttcc tcgttaaggt      1140

atttacattg tactcattcc aattacaaga cccgaaaggg ccctgtatcg ttatgtattg      1200

tcaccgcctc cccgtgtcgg gattgggtaa tttgcgcgcc tgctgccttc cttggatgtg      1260

gtagccgttt ctcaggctcc ctctccggaa ccgaaccctt attccccgtt acccgttgaa      1320

accatggtag gccactatcc taccatcgaa agttgattgg gcagaaattt gaatgaacca      1380

tcgccagcac aaggccatgc gattcgaaaa gttattatga gtcatcaaag agctcaaaga      1440

gcattgattt tttatctaat aaatacatcc cttccaaaca gtcgggattt ttagcatgta      1500

ttagctctag aattaccacg gttatccaag tagtaaaggt actatcaaat aaacgataac      1560

tgatttaatg agccattcgc agtttcactg tataaattgc ttatacttag acatgcatgg      1620

cttaatcttt gagacaagca tatgactac                                        1649

 

<210> 7

<211> 1588

<212> DNA

<213>米曲霉（Aspergillus oryzae）

<400> 7

aggggggcag gggcacggta aatcgagcac gagctgatga ctcgtgccta ctaggcattc        60

ctcgttgaag agcaataatt gcaatgctct atccccagca cgacagggtt taacaagatt       120

acccggacct ctcggccaag gtgatgtact cgctggccct gtcagtgtag cgcgcgtgcg       180

gcccagaaca tctaagggca tcacagacct gttattgccg cgcacttcca tcggcttgag       240

ccgatagtcc ccctaagaag ccagcggccc gcaaacgcgg accgggctat ttaagggccg       300

aggtctcgtt cgttatcgca attaagcaga caaatcactc caccaactaa gaacggccat       360

gcaccaccat ccaaaagatc aagaaagagc tctcaatctg tcaatcctta ttttgtctgg       420

acctggtgag tttccccgtg ttgagtcaaa ttaagccgca ggctccacgc cttgtggtgc       480

ccttccgtca atttctttaa gtttcagcct tgcgaccata ctccccccag aacccaaaaa       540

ctttgatttc tcgtaaggtg ccgagcgggt catcatagaa acaccgcccg atccctagtc       600

ggcatagttt atggttaaga ctacgacggt atctgatcgt cttcgatccc ctaactttcg       660

ttccctgatt aatgaaaaca tccttggsra atgctttcgc agtagttagt cttcagcaaa       720

tccaagaatt tcacctctga cagctgaata ctgacgcccc cgactatccc tattaatcat       780

tacggcggtc ctagaaacca acaaaataga accgcacgtc ctattctatt attccatgct       840

aatgtattcg agcaaaggcc tgctttgaac actctaattt tttcacagta aaagtcctgg       900

ttccccccac agccagtgaa ggccatgagg ttccccagaa ggaaaggtcc agccggacca       960

gtactcgcgg tgaggcggac cggccagcca gacccaaggt tcaactacga gctttttaac      1020

tgcaacaact ttaatatacg ctattggagc tggaattacc gcggctgctg gcaccagact      1080

tgccctccaa ttgttcctcg ttaagggatt tagattgtac tcattccaat tacgagaccc      1140

aaaagagccc cgtatcagta tttattgtca ctacctcccc gtgtcgggat tgggtaattt      1200

gcgcgcctgc tgccttcctt ggatgtggta gccgtttctc aggctccctc tccggaatcg      1260

aaccctaatt ccccgttacc cgttgccacc atggtaggcc actatcctac catcgaaagt      1320

tgatagggca gaaatttgaa tgaaccatcg ccggcgcaag gccatgcgat tcgttaagtt      1380

attatgaatc accaaggagc cccgaagggc attggttttt tatctaataa atacacccct      1440

tccgaagtcg aggtttttag catgtattag ctctagaatt accacaggta tccatgtagt      1500

aaggtactat caaataaacg ataactgatt taatgagcca ttcgcagttt ccacagtata      1560

aaagtgccta acccttacaa ccccaacc                                         1588

 

<210>8

<211> 1645

<212> DNA

<213>青霉属（Penicillium sp.）

<400>8

agccattcaa tcggtagtag cgacgggcgg tgtgtacaaa gggcagggac gtaatcggca        60

cgagctgatg actcgtgcct actaggcatt cctcgttgaa gagcaataat tgcaatgctc       120

tatccccagc acgacagggt ttaacaagat tacccagacc tctcggttaa ggtgatgtac       180

tcgctggccc tgtcagtgta gcgcgcgtgc ggcccagaac atctaagggc atcacagacc       240

tgttattgcc gcgcacttcc atcggcttga gccgatagtc cccctaagaa gccagcggcc       300

cgcaaatgcg gaccgggcta tttaagggcc gaggtctcgt tcgttatcgc aattaagcag       360

acaaatcact ccaccaacta agaacggcca tgcaccacca tccaaaagat caagaaagag       420

ctctcaatct gtcaatcctt attttgcctg gacctggtga gtttccccgt gttgagtcaa       480

attaagccgc aggctccacg ccttgtggtg cccttccgtc aatttcttta agtttcagcc       540

ttgcgaccat actcccccca gaacccaaaa actttgattt ctcgtaaggt gccgaacggg       600

tcatcataga atcccgtccg atccctagtc ggcatagttt atggttaaga ctacgacggt       660

atctgatcgt cttcgatccc ctaactttcg ttccctgatt aatgaaaaca tccttggcga       720

atgctttcgc agtagttagt cttcagcaaa tccaagaatt tcacctctga cagctgaata       780

ctgacgcccc cgactatccc tattaatcat tacggcggtc ctagaaacca acaaaataga       840

accacacgtc ctattctatt attccatgct aatgtattcg agcaaaggcc tgctttgaac       900

actctaattt tttcacagta aaagtcctgg ttccccccac agccagtgaa ggccatggga       960

ttccccagaa ggaaaggtcc agccggacca gtactcgcgg tgaggcggac cggccagccg      1020

gacccaaggt tcaactacga gctttttaac tgcaacaact ttaatatacg ctattggagc      1080

tggaattacc gcggctgctg gcaccagact tgccctccaa ttgttcctcg ttaagggatt      1140

taaattattc tcattccaat tacgagaccc aaaagagccc cgtatcagta tttattgtca      1200

ctacctcccc gtatcgtgat tgggtaattt gcgcgcctgc tgccttcctt ggatgtggta      1260

gccgtttctc aggctccctc tccggaatcg aaccctaatt ccccgttacc cgttgccacc      1320

atggtaggcc actatcctac catcgaaagt tgatagggca gaaatttgaa tgaaccatcg      1380

ccggcgcaag gccatgcgat tcgttaagtt attatgattc accaaggagc cccgaagggc      1440

gttggttttt tatctaataa atacacccct tcctgaagtc ggggttttta gcatgtatta      1500

gctctagaat taccacaggt atccatgtag taaggtacta tcaaataaac gataactgat      1560

ttaatgagcc attcgcagtt tcacagtaca agttgcttat acttagacat gcatggctta      1620

atctttgaga caagcatatg actac                                            1645

 

<210>9

<211> 860

<212> DNA

<213>多枝横梗霉属（Lichtheimia ramose）

<400>9

tcctccgctt attgatatgc ttaagttcag cgggtgatct cagttgattt cagatctaga        60

atgtgagttt gttgaagaga agacccaaag ttagatcctc tcgctagtcc gtaaagatta       120

agacatagtt caaagaagag actgattgac ttggaattat gaactcacta accaagtcgt       180

tgctcctcag gcactctaga gtctacatcc ggcaaatgac taaagccaat tgcctaggac       240

taaatgtatt taaggccatg acagcaactg aatgccatca acacaagccc atttccagtt       300

cgatcaggtt caaagaacca agttgaactg attggtagtt gcagatactg aaacaactgt       360

gcctagtaga ttgactacta ggcgcaagat gcgttcgaga actcgatgat tcgctatgaa       420

tgcaagtcgc aataattatc gcactttgct acgctcttca tcgatgcgag aaccaagaga       480

tccattgcca agagttgttt ttaagttaac aactaacttt tttcgtacat catggtttac       540

acgagaagaa taaacaccct tggggatagt tagtactaga gccccaaagg cttgccttgc       600

ttgcttttga ctcgagacat aggtctcctg aaagaagggt ccatacgtct cgtttcaagc       660

agcctagatc ttagtagtgg cacaagtctc ctaaaaggag ggtctctatg ccaacaacca       720

gatctacagc acaaggcaga gccaaccaag ttgacccgac tttgcacaaa actgtgagga       780

actactagag gggaagagat ccccaactag tggtttttta aacctctcag taatgatcct       840

tccgcaggtt cacctacgga                                                   860

 

<210>10

<211> 579

<212> DNA

<213>季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）

<400>10

ttcctccgct tattgatatg cttaagttca gcgggtattc ctacctgatt tgaggtcaaa        60

cttgtttggt tgttgtaagg ccgggccaac aataccagaa atatcccgcc acaccattca       120

acgagttgga taaacctaat acattgagag gtcgacagca ctatctagta ctacccatgc       180

caatactttt caagcaaacg cctagtccga ctaagagtat cactcaatac caaacccggg       240

ggtttgagag agaaatgacg ctcaaacagg catgccctct ggaataccag agggcgcaat       300

gtgcgttcaa agattcgatg attcacgaaa atctgcaatt catattactt atcgcatttc       360

gctgcgttct tcatcgatgc gagaaccaag agatccgttg ttgaaagttt tgaagattaa       420

ttcaaaattt gactaactgt aaaaataatt aaattgtgtt ttgttaaacc tctggcccaa       480

cctatctcta ggccaaacca aagcaagagt tctgtatcaa aaagacactg tgtgtaaggt       540

tttcgccgcg cagtaagcgc tggcaaaaag aatacggta                              579

 

 

<210>11

<211>572

<212> DNA

<213>米曲霉（Aspergillus oryzae）

<400>11

tttcctccgc ttattgatat gcttaagttc agcgggtatc cctacctgat ccgaggtcaa        60

cctggaaaaa gattgatttg cgttcggcaa gcgccggccg ggcctacaga gcgggtgaca       120

aagccccata cgctcgagga tcggacgcgg tgccgccgct gcctttgggg cccgtccccc       180

ccggagaggg gacgacgacc caacacacaa gccgtgcttg atgggcagca atgacgctcg       240

gacaggcatg ccccccggaa taccaggggg cgcaatgtgc gttcaaagac tcgatgattc       300

acggaattct gcaattcaca ctagttatcg catttcgctg cgttcttcat cgatgccgga       360

accaagagat ccattgttga aagttttaac tgattgcgat acaatcaact cagacttcac       420

tagatcagac agagttcgtg gtgtctccgg cgggcgcggg cccggggctg agagcccccg       480

gcggccatga atggcgggcc cgccgaagca actaaggtac agtaaacacg ggtgggaggt       540

tgggctcgct agaaccccta cagctccgga tg                                     572

 

 

<210>12

<211> 583

<212> DNA

<213>青霉属（Penicillium sp.）

<400>12

tcctccgctt attgatatgc ttaagttcag cgggtatccc tacctgatcc gaggtcaacc           60

tggataaaaa tttgggttga tcggcaagcg ccggccgggc ctacagagcg ggtgacagag       120

ccccatacgc tcgaggaccg gacgcggtgc cgccgctgcc tttcgggccc gtcccccgga       180

atcggaggac gaggcccaac acacaagccg ggcttgaggg cagcaatgac gctcggacag      240

gcatgccccc cggaatacca gggggcgcaa tgtgcgttca aagactcgat gattcactga        300

atttgcaatt cacattacgt atcgcatttc gctgcgttct tcatcgatgc cggaaccaag            360

agatccgttg ttgaaagttt taaataattt atattttcac tcagacttca ttcttcagac               420

agagttcggg gtgtcttcgg cgggcgcggg cccgggggcg tgagcccccc ggcggccagt       480

gaaggcgggc ccgccgaagc aataaggtaa ataaacacgg gtgggaggtt ggacccagag       540

ggccctcact cggtaatgat ccttccgcag gttcacctac gga                         583

 

 

Claims (4)

1.一种利用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构的方法，其特征在于：所述特定rDNA长片段是指一段包含18S rDNA近全长序列和ITS序列的片段，它是由靶向18S rDNA序列的上游引物NS1和靶向ITS序列的下游引物扩增得到的；所述18S rDNA近全长序列是指一端起始于引物NS1对应区域直至另外一端的序列，长约1780bp，相当于Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列的20-1800位点；所述靶向ITS序列的下游引物必须与NS1构成引物对特异性地扩增两者结合位点之间的片段，并且扩增片段长度大于2000bp。

2.根据权利要求1所述的一种利用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构的方法，其特征在于：用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构时采用的是DGGE或TGGE技术。

3.根据权利要求1或2所述的一种利用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

a、提取样品中微生物总基因组DNA；

b、采用靶向18S rDNA序列的上游引物NS1和靶向ITS序列的下游引物扩增所述特定rDNA长片段；

c、将步骤b中扩增的特定rDNA长片段进行DGGE或TGGE分析；

d、割胶回收特定rDNA长片段条带，采用同样的引物扩增特定rDNA片段全长序列或者分别采用靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对扩增其包含的18S rDNA片段和ITS片段；所述同样的引物是指步骤b中用于扩增特定rDNA长片段的引物；

e、将步骤d中获得的特定rDNA长片段或者18S rDNA片段和ITS片段进行测序，再将测定的18S rDNA序列和ITS序列分别提交到NCBI上利用Blast在GeneBank数据库中进行相似性搜索，最终结合两者的结果综合判定对应菌株的种属。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种利用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构的方法，其特征在于：关于靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对的选取，是将扩增特定rDNA长片段所采用的靶向18S rDNA序列的上游引物NS1和靶向ITS序列的下游引物分别作为靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对之一。

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