CN103007344B - 一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料及其制备方法。通过控制细菌纤维素的培养条件制备出一种具有类似人体血管组织“内腔致密、内部弹性、外壁疏松”的生物结构的人造血管支架,生物相容性以及细胞活性良好。致密层与弹性层、弹性层与疏松层之间结合程度更深,不仅局限于材料表面。无明显物理分层,结构连续性良好,致密层、弹性层与疏松层内存在结构的梯度变化,最大程度模仿了人体血管组织内密外疏的渐变梯度结构,缩短体外细胞培养的时间,明显降低人体对外来移植物的排异现象,大大提高移植成功率,支架成型过程简单,培养周期短,制备过程绿色环保、简便快速、制备成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料及其制备方法,具体地说是一种通过调节透氧模具内部空气整体气压以及氧气分压来实现细菌纤维素材料的自内而外由致密渐变至疏松的梯度结构而制得中空异型细菌纤维素人造血管支架材料及其制备方法。
背景技术
人体血液循环***包括血液、血管和心脏三个部分,血管作为桥梁将各个器官和心脏串联起来,并为血液的流动提供通道,将血液中的营养物质和养分输送到身体的各个部分,因此往往又将称其为心血管***,在这些部位发生的病变被称为心血管疾病。心血管疾病是威胁人类健康的最常见疾病,其发病率在全世界各类疾病中居于首位,目前我国每年因心脑血管疾病死亡的人数约有260万人,平均每小时死亡约300人,并且随着我国人口进入老龄化,这类疾病的发生率、复发率和死亡率将不断上升,给社会和家庭造成了沉重的经济和精神负担。
目前人造血管移植是治疗心血管疾病的基本方法,因此人造血管被广泛地应用于外科领域。目前使用较广泛的人造血管主要有以下几种类型。
(1)纺织型人造血管,主要是利用涤纶单丝纤维或复丝纤维通过机织或针织的方式制备得到人造血管。CN201341972Y,CN201341971Y,CN102296415A,CN1142932A等专利均公开了利用涤纶纤维制备的单层纺织型人造血管的制备方法;CN101069757A,CN101069756,CN101066476A等专利则公开了利用涤纶纤维制备的双层纺织型人造血管的制备方法。涤纶材料表面光滑,内部分子排列紧密,耐磨性、耐光性好,耐酸碱腐蚀,并且强度高、弹性好、耐热性和热稳定性均优于其他合成纤维。大中口径的涤纶人造血管已经成功应用临床数十年,创造了非常可观的经济利益和良好的社会利益。但是纺织型人造血管的缺点也十分明显:利用机织的方式制备的涤纶人造血管孔隙率过小,虽然可以避免血管壁渗血,但是过于致密的管壁不利于细胞的粘附生长;针织制备的方式可以提高人造血管的孔隙率,制备出具有良好柔性的人造血管,但是针织方式难以保证人造血管结构的均匀性,空隙分布也不均匀,且较粗糙的血管内壁也会增加血管内壁出现内膜增生(Intimal hyperplasia)的几率,诱发血栓;此外,还有很多研究表明涤纶的低亲水性结构对人体体液具有高抗渗透性,容易引起凝血、血栓等不良反应,因此利用涤纶无法制备小口径(外径<6mm)的人造血管。纺织人造血管由于加工和后整理方面的原因还会造成临床上多种并发症,如渗血严重、抗脱散性能差、自我支持结构不良、易塌陷、纵向和径向的顺应性差等。
(2)合成高分子型人造血管,主要是以膨体聚四氟乙烯、聚氨酯、腈橡胶或它们的共聚物等合成高分子材料为基材制备人造血管。CN101785875A公开了一种纳米超细纤维人工血管的制备方法,是利用静电纺的方法将聚氨酯制备成人造血管;CN102702555A公开了一种聚四氟乙烯纳米化新型人造血管及其制备方法,通过自组装将多壁碳纳米管与聚四氟乙烯相结合制备了可以提高血液通畅率的人造血管。以合成高分子材料为基材的人造血管具有良好的机械强度以及柔性,受压后不易变形或扭转成角。但是合成高分子的降解性差,尤其是部分降解产物有致癌毒性一直受到普遍争议。这些缺陷使得合成高分子型人造血管的使用受到了限制。
(3)天然高分子型人造血管,主要是以细菌纤维素、***胶、纤维素、胶原蛋白等天然高分子材料为基材的人造血管。天然分子型人造血管具备良好的生物相容性,细胞黏附性能出色。与纺织型人造血管相比,其内壁更光滑,解决了纺织型人造血管工艺不适用于制备小口径血管的难题。因此开发出新型的天然高分子型人造血管以及成为今年来的研究热点。
细菌纤维素(Bacterial Cellulose,也称微生物纤维素)是一种纳米纤维材料。其以细菌细胞内部作为生物合成反应器,将葡萄糖小分子在酶催化作用下经过一系列复杂的变构过程最终通过β-1,4-糖苷键结合形成β-1,4-葡萄糖链由细菌系细胞侧面的催化位点挤出。β-1,4-葡萄糖链彼此之间通过分子内与分子间氢键作用,逐步、分层地形成脂多糖层、类晶团聚体、纤维素微纤并最终形成纤维素。这一系列的细胞外(Extracellular)成形过程被称为“纤维素的自组装”。
正是这个独特的微生物参与的过程赋予了细菌纤维素良好的理化性能:超细三维网状结构;良好的吸湿、保湿以及透气性能;超高的持水性与湿态强度;高抗张强度与弹性模量等等。大量研究表明细菌纤维素材料具有良好的体内、体外生物相容性,加上其优异的形状可调控性与形状维持性使其在构建体内、体外组织工程支架材料具有得天独厚的优势。
利用细菌纤维素材料作为组织工程管状支架的研究近年来成为研究的热点。关于中空异型细菌纤维素材料的制备也取得了一些成果。CN102657561A公开了一种复合结构人造血管的静态制备方法。采用针织,机织以及编织的方法将纤维材料,主要是指高分子聚合物类,包括棉,纱,聚乙烯纤维,聚丙烯纤维等制成中空管状支架。将支架浸没在接入菌液的发酵培养液中并向支架内部通入空气或氧气,使细菌消耗糖源代谢纤维素丝包覆支架外壁形成管状细菌纤维素材料。CN102641161A公开了一种复合结构人造血管及其动态制备方法。同样采用针织,机织和编织的方法制备中空管状支架材料。培养阶段,采用缓慢转动支架或缓慢上下移动支架的方式,使细菌消耗糖源代谢纤维素丝,在动态过程中包覆支架外壁形成管状细菌纤维素材料。CN101348813A公开了一种具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法。利用聚乙醇酸管、硅橡胶管以及胶片管作为透氧支架。静置培养阶段向支架内部通入空气或氧气使细菌消耗糖源代谢纤维素丝包覆支架外壁形成管状细菌纤维素材料。CN101914434A公开了一种制备中空异形细菌纤维素材料的装置以及方法。将硅胶,陶瓷,无纺布,尼龙,膨体聚乙烯等材料制成中空异型透氧支架并浸没在接入菌液的培养液中。培养阶段使电机带动的透氧支架进行缓慢转动,使使细菌消耗糖源代谢纤维素丝,在动态过程中包覆支架外壁形成中空异形细菌纤维素材料。
目前已经公开的中空异型细菌纤维素材料的制备技术主要通过向中空透氧支架中通入空气或氧气,利用菌种赖氧生存的这一生物特性,人为创造气/液两相界面,使细菌消耗糖源代谢纤维素丝,包覆支架外壁形成中空异型细菌纤维素材料。现有公开技术制备中空透氧支架的工艺主要为机械织造与一次成型两种。其中机械织造是指通过针织、机织或编织的方法将高分子聚合物纤维如棉、纱、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维、PET纤维等制成中空多孔材料;一次成型是指将硅橡胶、膨体聚四氟乙烯、乳胶、陶瓷等透氧材料通过模具一次成型制成中空透氧支架。但是,现有技术所得到的中空异型细菌纤维素材料由于制备工艺的局限性而普遍存在:材料壁厚不均一,内部结构疏密程度无规律,与所替换的人体组织内部结构相似度低,制备周期长等缺陷,大大限制了细菌纤维素这种新型生物质纳米纤维材料在组织工程支架上的应用。这其中有一部分原因是由于透氧支架材料的孔隙、壁厚不均匀而导致氧气渗透程度不均一造成的。CN101584882A公开了一种组织工程血管支架材料及其生产方法。专利中指出了透氧材料本身孔隙分布均一性对氧气通入模具内部,并在模具外壁表面形成有氧界面均匀性的影响,并最终影响包覆在透氧模具外壁的细菌纤维素管状材料的结构均一性。虽然这在一定程度上能够改善现有技术制备得到产品的个体间差异很大、规格不一、出品率低的缺陷,但是却忽略了制备中空细菌纤维素组织工程支架材料的核心应当围绕目标组织的结构。专利中指出在制备单独目标组织的细菌纤维素组织工程血管材料时,通入透氧模具内部的氧气浓度在整个培养过程中须精确控制,不能发生变化,而理想人造血管支架应在实验条件允许的前提下,最大程度上模仿目标血管组织的内部结构。人体内部血管、胆管、尿道、输精管、十二指肠等中空异型组织都具备内壁致密光滑、内部弹性、外壁疏松的梯度结构,而在培养过程中不同氧气分压以及氧气浓度对于得到细菌纤维素材料内部结构的疏密程度是有很大影响的。因此CN101584882A中所描述的实施方案并没有紧密围绕人造血管的要求来设计,所得到的基于细菌纤维素的组织工程支架材料理论上是无法达到合格人造血管材料的要求。
发明内容
本发明涉及一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素组织工程支架材料,选择透氧材料作为模具材料,根据血管、胆管、尿道管、输精管等人体中空异型组织的实际形状、直径及大小制作外周直径与目标内径相一致的中空异型模具。结合现有公开技术制备中空透氧支架的工艺,通过针织、机织或编织的方法将高分子聚合物纤维如棉、纱、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维、PET纤维等制成中空多孔材料;或将硅橡胶、膨体聚四氟乙烯、乳胶、陶瓷等透氧材料通过模具一次成型制成中空透氧支架。培养阶段通过精确控制培养条件,使所得到的中空异型细菌纤维素材料的内壁致密光滑,利于人体内皮细胞识别与黏附,能够在较短时间内大面积增殖形成抗凝血界面;内部区域纤维素微纤丝排列有序,基本沿支架轴向取向,利于平滑肌细胞识别与黏附,能够大面积增殖形成连续相使中空异型细菌纤维素材料壁具有良好的力学弹性,外部区域纤维素分布松散,由纤维素微纤丝通过分子内与分子间氢键作用而无序交错形成的多孔结构的平均孔径增大,利于成纤维细胞黏附,同时利于毛细血管、微血管生长,使营养物质能够顺利渗透至人造血管支架材料内部。除此之外,本发明涉及的一种具有梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料在培养阶段通过添加脉冲,使透氧支架内部气体压力呈周期性变化,透氧支架壁呈周期性收缩/舒张交替变化,从而确保材料在模拟人体血管组织周期性收缩/舒张的环境下形成,在结构上更接近人体组织。所述的梯度结构由三层结合紧密的中空细菌纤维素构成的中空管状支架材料;所述的三层结合紧密的中空细菌纤维素为沿径向由内而外分别为致密层,弹性层与疏松层:所述的结合紧密是指所述致密层的纤维素微纤丝与所述弹性层的纤维素微纤丝以及所述的弹性层纤维素微纤丝与所述的疏松层的纤维素微纤丝彼此之间通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键结合,形成脂多糖分子层,层与层之间也通过分子内与分子间氢键结合,无明显物理分层;组成细菌纤维素的基本单元并非单根β-1,4-葡萄糖链,而是预微纤丝(premicrofibril),其由β-1,4-葡萄糖链组成,每9根β-1,4-葡萄糖链相互平行,通过分子内与分子间氢键结合,呈左手三螺旋状,是组成微纤丝(microfibril)的基本单位,直径为1.5nm。微纤丝(microfibril)直径为3.5nm,微纤与微纤之间通过分子内与分子间氢键结合,β-1,4-葡萄糖链呈平行排布,形成纤维素I型结晶结构。
其中所述致密层中的纤维素含量0.7×10-2~1.0×10-2g/cm3,所述弹性层中的纤维素含量0.3×10-2~0.6×10-2g/cm3,所述疏松层中的纤维素含量0.1×10-2~0.2×10-2g/cm3。
作为优选的技术方案:
如上所述的一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料,所述的具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的壁厚为0.3~3mm,其中所述致密层的厚度为0.1~1mm,弹性层的厚度为0.1~1mm,疏松层的厚度为0.1~1mm。
所述的中空透氧模具是由透氧材料根据所替换人体组织的实际形状、直径以及大小制作得到的;所述的中空透氧模具在外形上与人体乳内动脉、隐静脉、尿道、十二指肠、胆管的形状一致。
所述的透氧材料是指在常温常压下的氧气透过速率为100~1000mL.m-2.s-1,孔隙均一度偏差<±0.3的材料。
所述的周期性的舒张/收缩交替性变化是指通过调节中空透氧模具内部气体压力,充气使中空透氧模具发生膨胀、放气使中空透氧模具恢复原状,以充/放气交替实施的方式,使中空透氧模具外径在每分钟60~165次的频率范围内,每次充气膨胀使中空透氧模具外径产生1~5%的变化。
本发明还提供了一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的制备方法,包括以下步骤:
1)发酵培养液的调配;
发酵培养液组分,以质量百分数计,单位为wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2~5,蛋白胨0.05~0.5,酵母膏0.05~0.5,柠檬酸0.01~0.1,磷酸氢二钠0.02~0.2,磷酸二氢钾0.01~0.1,余量为水;
发酵培养液的pH为4.0~6.0;
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温,通纯氧,即得发酵培养液;
2)菌种扩培;
将所述的发酵培养液接入菌液和扩培;扩培程度:菌种细胞数目在2×105~2×107个/ml。
3)培养阶段;
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中,放置于恒温培养箱中,28~32℃培养;
通过分步调节透氧模具内部空气整体气压以及氧气分压来实现中空异型细菌纤维素材料的由内向外逐渐由致密变疏松的梯度结构;
a.细菌纤维素生长诱导期1~2天:控制中空透氧模具内部空气压力为1.0~1.1个标准大气压,直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽后慢慢聚集在中空透氧模具外表面,透氧模具外壁包覆一层半透明的细菌纤维素;
b.细菌纤维素快速生长期2~3天,即疏松层形成阶段:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生1~5%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
控制中空透氧模具内部空气压力为1.1~1.2个标准大气压,同时保持氧气浓度在10~15%范围内;至透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到0.1~1mm;
c.细菌纤维素平稳生长期3~5天:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生1~5%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
平稳生长期分两个阶段:
弹性层形成阶段2~3天,维持中空透氧模具内部空气压力为1.1~1.2个标准大气压,同时提高氧气浓度,最高不超过40%,直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到0.1~2mm;
致密层形成阶段1~2天,加压使中空透氧模具内部空气压力在1.2~1.5个标准大气压范围内,同时提高氧气浓度,最高不超过100%;直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到0.1~3mm,将其取出,即得到具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料;
4)后处理;
静置培养结束后,将上述的具备具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料浸泡至浓度为1~10wt%的氢氧化钠溶液中,煮沸保持2~10小时,用纯净水清洗至pH为7.0,材料内毒素<0.5EU/ml,再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存,即为具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料。
如上所述的一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的制备方法,所述的高压蒸汽灭菌后紫外辐照是指将上述发酵培养液置于高压灭菌锅内121℃灭菌处理30分钟后取出置于紫外灯下辐照冷却至室温。
如上所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料,其特征在于,所述的菌种是指能够生物合成纤维素的微生物,包括:木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种。
如上所述的一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的制备方法,所述的通纯氧是指将医用氧以1L/min的速度通入上述的培养液中,并维持30分钟;所述的接种是指用灭菌后的接种环钩取适量保存于4℃下试管中的菌种,并转移至上述的发酵培养液中;所述的扩培是指将接入菌种后的发酵培养液于28~32℃下摇床培养8~24小时。
如上所述的一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的制备方法,所述的加压为连续增压或阶段性增压。
如上所述的一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的制备方法,所述的连续增压是指每分钟向透氧模具内充入压力百分数不超过2.083×10-2%的空气,基数是1.2个标准大气压,维持中空透氧模具内空气压力在1.2~1.5个标准大气压范围内,最大不超过1.5个标准大气压;所述的阶段性增压是指每小时向透氧模具内充入压力百分数不超过1.25%的空气,基数是1.2个标准大气压,维持中空透氧模具内空气压力在1.2~1.5个标准大气压范围内,最大不超过1.5个标准大气压。
如上所述的一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的制备方法,所述的提高氧气浓度为连续增加或阶段性增加;
弹性层形成阶段,所述的连续增加是指:氧气浓度每分钟增加0.00463~0.00694%,直至氧气浓度达到40%时不再增加;所述的阶段性增加是指:氧气浓度每小时增加0.278~0.417%,直至氧气浓度达到40%时不再增加;
致密层形成阶段,所述的连续增加是指:氧气浓度每分钟增加0.0174~0.0347%,直至氧气浓度达到100%时不再增加;所述的阶段性增加是指:氧气浓度每小时增加1.042~2.083%,直至氧气浓度达到100%时不再增加。
如上所述的一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的制备方法,其特征在于,所述的高压灭菌是指将所述后处理后的具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料浸泡在纯净水中置于高压灭菌锅内121℃灭菌处理30分钟后取出冷却至室温;所述的低温封存是指将高压灭菌后的具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料于4℃下保存。
细菌纤维素作为一种新型的天然水凝胶具有其独特的物理、化学和机械性质:超细网状结构;高抗张强度和弹性模量;高亲水性,良好的透气、吸水、透水性能,并有非凡的持水性和高湿强度。细菌纤维素的微纤丝束直径为3~4nm,而由微纤维束连接成的纤维丝带宽度为70~80nm,长度为1~9μm,是目前最细的天然纤维。
细菌纤维素水凝胶的纳米三维网状结构为细胞、组织的重建提供了必要的三维空间和力学支持,起到模拟细胞外基质(Extra cellular matrix,ECM)的作用。具有良好的组织相容性;适合的孔径和孔隙率,利于细胞的增殖和黏附,以及营养物质的渗入和细胞代谢产物的排出;生物可降解性和适合的降解率。其中生物材料对于结构和功能的仿生是组织工程支架最重要的性能要求。
大量研究表明细菌纤维素具有良好的体内、体外生物相容性。极好的形状维持性能和原位成型性。同时,人体体内中空管状组织或中空异型组织如血管、胆管、尿道、输精管、十二指肠等都由内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞以及一些细胞外基质、***组成。内皮细胞主要提供组织的抗凝血界面,而平滑肌细胞主要赋予组织良好的力学强度与力学弹性。这两点是组织工程重建人体体内中空管状组织或中空异型组织所必需满足的要求。研究表明,人体内皮细胞更倾向于在光滑的生物材料表面黏附并能够在相对较短的时间内形成连续细胞层;内部结构规整、存在缝隙的生物材料则更利于平滑肌细胞进入其内部并增殖形成连续细胞层。
本专利发明的一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料能够根据目标组织的实际结构,在最大程度上模仿自体组织的生物结构,可以在很大程度上缩短体外细胞培养的时间,明显降低人体对外来移植物的排异现象,大大提高移植成功率。
有益效果:
与现有技术先比,本发明的有益效果是:
(1)一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料成型过程连续,致密层与弹性层之间、弹性层与疏松层之间均由纳米微纤丝通过分子内与分子间氢键结合。使β-1,4-葡萄糖链构成的纤维素微纤丝在通过分子内与分子间氢键结合并结晶成型的过程中,自发、有序地形成疏松到致密渐变的结构。结合程度更深,不仅局限于材料表面。
(2)一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料无明显物理分层,结构连续性十分良好,由内向外的致密层、弹性层、疏松层呈梯度变化;其次,疏松层与致密层内也存在结构的梯度变化,使得材料在最大程度上模仿了人体组织自内向外由致密到疏松的渐变梯度结构,缩短体外细胞培养的时间,明显降低人体对外来移植物的排异现象,大大提高移植成功率。
(3)一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料在现有技术基础上,通过增加培养过程中透氧模具内的空气压力,使得包覆在透氧模具外壁的细菌纤维素内部有氧区面积增加;同时精确控制压力,不使细菌纤维素脱离模具产生明显物理分层。同时,通过在培养过程中改变透氧模具内的氧气分压来有目的地构造致密层、弹性层与疏松层结构,改善了现有技术中仅向透氧模具内通纯氧且模具内压力恒定不变的单一工艺,同时也解决了氧气分压过高所导致纤维素增长速度变缓的缺陷。
(4)一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料在现有技术基础上,在培养过程中加入脉冲,使中空透氧模具外径呈收缩/舒张交替变化,从而确保材料在模拟人体血管组织的收缩/舒张的交替变化环境下形成,在结构上更接近人体组织。
(5)一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料成型过程简单,支架材料制备周期短,制备过程绿色环保、简便快速、制备成本低廉,是一种理想的人造血管支架材料。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明涉及一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素组织工程支架材料,选择透氧材料作为模具材料,根据血管、胆管、尿道管、输精管等人体中空异型组织的实际形状、直径及大小制作外周直径与目标内径相一致的中空透氧模具。培养阶段通过精确控制培养条件,使所得到的中空异型细菌纤维素材料的内壁致密光滑,利于人体内皮细胞识别与黏附,能够在较短时间内大面积增殖形成抗凝血界面;内部区域纤维素微纤丝排列有序,基本沿支架轴向取向,利于平滑肌细胞识别与黏附,能够大面积增殖形成连续相使中空异型细菌纤维素材料壁具有良好的力学弹性,外部区域纤维素分布松散,由纤维素微纤丝通过分子内与分子间氢键作用而无序交错形成的多孔结构的平均孔径增大,利于成纤维细胞黏附,同时利于毛细血管、微血管生长,使营养物质能够顺利渗透至人造血管支架材料内部。除此之外,本发明涉及的一种具有梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料在培养阶段通过添加脉冲,使中空透氧模具呈收缩/舒张交替变化,从而确保材料在模拟人体血管组织收缩/舒张的交替变化环境下形成,在结构上更接近人体组织。所述的梯度结构由三层结合紧密的中空细菌纤维素构成的中空管状支架材料;所述的三层结合紧密的中空细菌纤维素为沿径向由内而外分别为致密层,弹性层与疏松层:所述的结合紧密是指所述致密层的纤维素微纤丝与所述弹性层的纤维素微纤丝以及所述的弹性层纤维素微纤丝与所述的疏松层的纤维素微纤丝彼此之间通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键结合,形成脂多糖分子层,层与层之间也通过分子内与分子间氢键结合,无明显物理分层;组成细菌纤维素的基本单元并非单根β-1,4-葡萄糖链,而是预微纤丝(premicrofibril),其由β-1,4-葡萄糖链组成,每9根β-1,4-葡萄糖链相互平行,通过分子内与分子间氢键结合,呈左手三螺旋状,是组成微纤丝(microfibril)的基本单位,直径为1.5nm。微纤丝(microfibril)直径为3.5nm,微纤与微纤之间通过分子内与分子间氢键结合,β-1,4-葡萄糖链呈平行排布,形成纤维素I型结晶结构。
其中所述致密层中的纤维素含量0.7×10-2~1.0×10-2g/cm3,所述弹性层中的纤维素含量0.3×10-2~0.6×10-2g/cm3,所述疏松层中的纤维素含量0.1×10-2~0.2×10-2g/cm3。
实施例1
1)发酵培养液的调配;
发酵培养液组分,以质量百分数计,单位为wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2,蛋白胨0.05,酵母膏0.05,柠檬酸0.01,磷酸氢二钠0.02,磷酸二氢钾0.01,余量为水;
发酵培养液的pH为4.0;
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温,通纯氧,即得发酵培养液;
2)菌种扩培;
将所述的发酵培养液接入菌液和扩培;扩培程度:菌种细胞数目在2×105个/ml。
3)培养阶段;
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中,放置于恒温培养箱中,28℃培养;
通过分步调节透氧模具内部空气整体气压以及氧气分压来实现中空异型细菌纤维素材料的由内向外逐渐由致密变疏松的梯度结构;
a.细菌纤维素生长诱导期2天:控制中空透氧模具内部空气压力为1个标准大气压,直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽后慢慢聚集在中空透氧模具外表面,透氧模具外壁包覆一层半透明的细菌纤维素;
b.细菌纤维素快速生长期3天,即疏松层形成阶段:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生1%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
控制中空透氧模具内部空气压力为1.1个标准大气压,同时保持氧气浓度在10%;至透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到0.1mm;
c.细菌纤维素平稳生长期5天:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生1%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
平稳生长期分两个阶段:
弹性层形成阶段3天,维持中空透氧模具内部空气压力为1.1个标准大气压,同时提高氧气浓度,最高不超过40%,直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到0.2mm;
致密层形成阶段2天,加压使中空透氧模具内部空气压力在1.2个标准大气压,同时提高氧气浓度,最高不超过100%;直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到0.3mm,将其取出,即得到具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料;
4)后处理;
静置培养结束后,将上述的具备具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料浸泡至浓度为1wt%的氢氧化钠溶液中,煮沸保持10小时,用纯净水清洗至pH为7.0,材料内毒素<0.5EU/ml,再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存,即为具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料。
实施例2
1)发酵培养液的调配;
发酵培养液组分,以质量百分数计,单位为wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5,蛋白胨0.5,酵母膏0.5,柠檬酸0.1,磷酸氢二钠0.2,磷酸二氢钾0.1,余量为水;
发酵培养液的pH为6.0;
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温,通纯氧,即得发酵培养液;
2)菌种扩培;
将所述的发酵培养液接入菌液和扩培;扩培程度:菌种细胞数目在2×107个/ml。
3)培养阶段;
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中,放置于恒温培养箱中,32℃培养;
通过分步调节透氧模具内部空气整体气压以及氧气分压来实现中空异型细菌纤维素材料的由内向外逐渐由致密变疏松的梯度结构;
a.细菌纤维素生长诱导期1天:控制中空透氧模具内部空气压力为1.1个标准大气压,直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽后慢慢聚集在中空透氧模具外表面,透氧模具外壁包覆一层半透明的细菌纤维素;
b.细菌纤维素快速生长期2天,即疏松层形成阶段:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生5%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
控制中空透氧模具内部空气压力为1.2个标准大气压,同时保持氧气浓度在15%;至透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到1mm;
c.细菌纤维素平稳生长期3天:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生5%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
平稳生长期分两个阶段:
弹性层形成阶段2天,维持中空透氧模具内部空气压力为1.2个标准大气压,同时提高氧气浓度,最高不超过40%范围,直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到2mm;
致密层形成阶段1天,加压使中空透氧模具内部空气压力在1.5个标准大气压范围内,同时提高氧气浓度,最高不超过100%范围;直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到3mm,将其取出,即得到具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料;
4)后处理;
静置培养结束后,将上述的具备具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中,煮沸保持2小时,用纯净水清洗至pH为7.0,材料内毒素<0.5EU/ml,再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存,即为具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料。
实施例3
1)发酵培养液的调配;
发酵培养液组分,以质量百分数计,单位为wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇3,蛋白胨0.3,酵母膏0.3,柠檬酸0.05,磷酸氢二钠0.1,磷酸二氢钾0.05,余量为水;
发酵培养液的pH为5.0;
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温,通纯氧,即得发酵培养液;
2)菌种扩培;
将所述的发酵培养液接入菌液和扩培;扩培程度:菌种细胞数目在2×107个/ml。
3)培养阶段;
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中,放置于恒温培养箱中,30℃培养;
通过分步调节透氧模具内部空气整体气压以及氧气分压来实现中空异型细菌纤维素材料的由内向外逐渐由致密变疏松的梯度结构;
a.细菌纤维素生长诱导期1天:控制中空透氧模具内部空气压力为1.1个标准大气压,直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽后慢慢聚集在中空透氧模具外表面,透氧模具外壁包覆一层半透明的细菌纤维素;
b.细菌纤维素快速生长期2天,即疏松层形成阶段:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生3%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
控制中空透氧模具内部空气压力为1.1个标准大气压,同时保持氧气浓度在12.5%;至透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到0.5mm;
c.细菌纤维素平稳生长期4天:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生3%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
平稳生长期分两个阶段:
弹性层形成阶段2天,维持中空透氧模具内部空气压力为1.1个标准大气压,同时提高氧气浓度,最高不超过40%,直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到1mm;
致密层形成阶段2天,加压使中空透氧模具内部空气压力在1.3个标准大气压范围内,同时提高氧气浓度,最高不超过100%;直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到1.5mm,将其取出,即得到具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料;
4)后处理;
静置培养结束后,将上述的具备具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料浸泡至浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中,煮沸保持4小时,用纯净水清洗至pH为7.0,材料内毒素<0.5EU/ml,再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存,即为具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料。
实施例4
1)发酵培养液的调配;
发酵培养液组分,以质量百分数计,单位为wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5,蛋白胨0.5,酵母膏0.5,柠檬酸0.1,磷酸氢二钠0.2,磷酸二氢钾0.1,余量为水;
发酵培养液的pH为5.0;
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温,通纯氧,即得发酵培养液;
2)菌种扩培;
将所述的发酵培养液接入菌液和扩培;扩培程度:菌种细胞数目在2×107个/ml。
3)培养阶段;
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中,放置于恒温培养箱中,30℃培养;
通过分步调节透氧模具内部空气整体气压以及氧气分压来实现中空异型细菌纤维素材料的由内向外逐渐由致密变疏松的梯度结构;
a.细菌纤维素生长诱导期1天:控制中空透氧模具内部空气压力为1.1个标准大气压,直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽后慢慢聚集在中空透氧模具外表面,透氧模具外壁包覆一层半透明的细菌纤维素;
b.细菌纤维素快速生长期2天,即疏松层形成阶段:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生2%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
控制中空透氧模具内部空气压力为1.2个标准大气压,同时保持氧气浓度在10%;至透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到1mm;
c.细菌纤维素平稳生长期5天:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生2%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
平稳生长期分两个阶段:
弹性层形成阶段3天,维持中空透氧模具内部空气压力为1.2个标准大气压,同时采用连续增加的方式,使氧气浓度每分钟增加0.00463%,直至氧气浓度达到40%时不再增加,直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到2mm;
致密层形成阶段2天,采用连续加压的方式,每分钟向透氧模具内充入压力百分数不超过2.083×10-2%的空气,直至中空透氧模具内部空气压力达到1.2个标准大气压不再加压,同时采用连续增加的方式,使氧气浓度每分钟增加0.0174%,直至氧气浓度达到100%时不再增加;直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到3mm,将其取出,即得到具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料;
4)后处理;
静置培养结束后,将上述的具备具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料浸泡至浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中,煮沸保持4小时,用纯净水清洗至pH为7.0,材料内毒素<0.5EU/ml,再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存,即为具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料。
实施例5
1)发酵培养液的调配;
发酵培养液组分,以质量百分数计,单位为wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5,蛋白胨0.5,酵母膏0.5,柠檬酸0.1,磷酸氢二钠0.2,磷酸二氢钾0.1,余量为水;
发酵培养液的pH为5.0;
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温,通纯氧,即得发酵培养液;
2)菌种扩培;
将所述的发酵培养液接入菌液和扩培;扩培程度:菌种细胞数目在2×107个/ml。
3)培养阶段;
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中,放置于恒温培养箱中,30℃培养;
通过分步调节透氧模具内部空气整体气压以及氧气分压来实现中空异型细菌纤维素材料的由内向外逐渐由致密变疏松的梯度结构;
a.细菌纤维素生长诱导期2天:控制中空透氧模具内部空气压力为1.1个标准大气压,直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽后慢慢聚集在中空透氧模具外表面,透氧模具外壁包覆一层半透明的细菌纤维素;
b.细菌纤维素快速生长期3天,即疏松层形成阶段:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生2%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
控制中空透氧模具内部空气压力为1.2个标准大气压,同时保持氧气浓度在10%;至透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到1mm;
c.细菌纤维素平稳生长期3天:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生2%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
平稳生长期分两个阶段:
弹性层形成阶段2天,维持中空透氧模具内部空气压力为1.2个标准大气压,同时采用连续增加的方式,使氧气浓度每分钟增加0.00694%,直至氧气浓度达到40%时不再增加,直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到2mm;
致密层形成阶段1天,采用连续加压的方式,每分钟向透氧模具内充入压力百分数不超过2.083×10-2%的空气,直至中空透氧模具内部空气压力达到1.5个标准大气压时不再加压,同时采用连续增加的方式,使氧气浓度每分钟增加0.0347%,直至氧气浓度达到100%时不再增加;直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到3mm,将其取出,即得到具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料;
4)后处理;
静置培养结束后,将上述的具备具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料浸泡至浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中,煮沸保持4小时,用纯净水清洗至pH为7.0,材料内毒素<0.5EU/ml,再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存,即为具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料。
实施例6
1)发酵培养液的调配;
发酵培养液组分,以质量百分数计,单位为wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5,蛋白胨0.5,酵母膏0.5,柠檬酸0.1,磷酸氢二钠0.2,磷酸二氢钾0.1,余量为水;
发酵培养液的pH为5.0;
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温,通纯氧,即得发酵培养液;
2)菌种扩培;
将所述的发酵培养液接入菌液和扩培;扩培程度:菌种细胞数目在2×107个/ml。
3)培养阶段;
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中,放置于恒温培养箱中,30℃培养;
通过分步调节透氧模具内部空气整体气压以及氧气分压来实现中空异型细菌纤维素材料的由内向外逐渐由致密变疏松的梯度结构;
a.细菌纤维素生长诱导期1天:控制中空透氧模具内部空气压力为1.1个标准大气压,直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽后慢慢聚集在中空透氧模具外表面,透氧模具外壁包覆一层半透明的细菌纤维素;
b.细菌纤维素快速生长期2天,即疏松层形成阶段:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生2%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
控制中空透氧模具内部空气压力为1.1个标准大气压,同时保持氧气浓度在10%;至透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到1mm;
c.细菌纤维素平稳生长期5天:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生2%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
平稳生长期分两个阶段:
弹性层形成阶段3天,维持中空透氧模具内部空气压力为1.2个标准大气压,同时采用阶段性增加的方式,使氧气浓度每小时增加0.278%,直至氧气浓度达到40%时不再增加,直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到2mm;
致密层形成阶段2天,采用阶段性加压的方式,每小时向透氧模具内充入压力百分数不超过1.25%的空气,直至中空透氧模具内部空气压力达到1.2个标准大气压时不再加压;同时采用阶段性增加的方式,使氧气浓度每小时增加1.042%,直至氧气浓度达到100%时不再增加;直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到3mm,将其取出,即得到具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料;
4)后处理;
静置培养结束后,将上述的具备具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料浸泡至浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中,煮沸保持4小时,用纯净水清洗至pH为7.0,材料内毒素<0.5EU/ml,再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存,即为具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料。
实施例7
1)发酵培养液的调配;
发酵培养液组分,以质量百分数计,单位为wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5,蛋白胨0.5,酵母膏0.5,柠檬酸0.1,磷酸氢二钠0.2,磷酸二氢钾0.1,余量为水;
发酵培养液的pH为5.0;
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温,通纯氧,即得发酵培养液;
2)菌种扩培;
将所述的发酵培养液接入菌液和扩培;扩培程度:菌种细胞数目在2×107个/ml。
3)培养阶段;
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中,放置于恒温培养箱中,30℃培养;
通过分步调节透氧模具内部空气整体气压以及氧气分压来实现中空异型细菌纤维素材料的由内向外逐渐由致密变疏松的梯度结构;
a.细菌纤维素生长诱导期1天:控制中空透氧模具内部空气压力为1.1个标准大气压,直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽后慢慢聚集在中空透氧模具外表面,透氧模具外壁包覆一层半透明的细菌纤维素;
b.细菌纤维素快速生长期2天,即疏松层形成阶段:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生2%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
控制中空透氧模具内部空气压力为1.2个标准大气压,同时保持氧气浓度在10%;至透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到1mm;
c.细菌纤维素平稳生长期3天:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生2%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
平稳生长期分两个阶段:
弹性层形成阶段2天,维持中空透氧模具内部空气压力为1.2个标准大气压,同时采用阶段性增加的方式,使氧气浓度每小时增加0.417%,直至氧气浓度达到40%时不再增加,直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到2mm;
致密层形成阶段1天,采用阶段性加压的方式,每小时向透氧模具内充入压力百分数不超过1.25%的空气,直至中空透氧模具内部空气压力达到1.5个标准大气压时不再加压,同时采用阶段性增加的方式,使氧气浓度每小时增加2.083%,直至氧气浓度达到100%时不再增加;直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到3mm,将其取出,即得到具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料;
4)后处理;
静置培养结束后,将上述的具备具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料浸泡至浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中,煮沸保持4小时,用纯净水清洗至pH为7.0,材料内毒素<0.5EU/ml,再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存,即为具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料。
实施例8
1)发酵培养液的调配;
发酵培养液组分,以质量百分数计,单位为wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5,蛋白胨0.5,酵母膏0.5,柠檬酸0.1,磷酸氢二钠0.2,磷酸二氢钾0.1,余量为水;
发酵培养液的pH为5.0;
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温,通纯氧,即得发酵培养液;
2)菌种扩培;
将所述的发酵培养液接入菌液和扩培;扩培程度:菌种细胞数目在2×10个/ml。
3)培养阶段;
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中,放置于恒温培养箱中,30℃培养;
通过分步调节透氧模具内部空气整体气压以及氧气分压来实现中空异型细菌纤维素材料的由内向外逐渐由致密变疏松的梯度结构;
a.细菌纤维素生长诱导期1天:控制中空透氧模具内部空气压力为1.1个标准大气压,直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽后慢慢聚集在中空透氧模具外表面,透氧模具外壁包覆一层半透明的细菌纤维素;
b.细菌纤维素快速生长期2天,即疏松层形成阶段:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生2%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
控制中空透氧模具内部空气压力为1.2个标准大气压,同时保持氧气浓度在10%;至透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到1mm;
c.细菌纤维素平稳生长期5天:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生2%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
平稳生长期分两个阶段:
弹性层形成阶段3天,维持中空透氧模具内部空气压力为1.2个标准大气压,同时采用连续增加的方式,使氧气浓度每分钟增加0.005%,直至氧气浓度达到40%时不再增加,直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到2mm;
致密层形成阶段2天,采用连续加压的方式,每分钟向透氧模具内充入压力百分数不超过2.083×10-2%的空气,直至中空透氧模具内部空气压力达到1.5个标准大气压时不再加压,同时采用连续增加的方式,使氧气浓度每分钟增加0.025%,直至氧气浓度达到100%时不再增加;直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到3mm,将其取出,即得到具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料;
4)后处理;
静置培养结束后,将上述的具备具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料浸泡至浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中,煮沸保持4小时,用纯净水清洗至pH为7.0,材料内毒素<0.5EU/ml,再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存,即为具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料。
实施例9
1)发酵培养液的调配;
发酵培养液组分,以质量百分数计,单位为wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5,蛋白胨0.5,酵母膏0.5,柠檬酸0.1,磷酸氢二钠0.2,磷酸二氢钾0.1,余量为水;
发酵培养液的pH为5.0;
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温,通纯氧,即得发酵培养液;
2)菌种扩培;
将所述的发酵培养液接入菌液和扩培;扩培程度:菌种细胞数目在2×107个/ml。
3)培养阶段;
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中,放置于恒温培养箱中,30℃培养;
通过分步调节透氧模具内部空气整体气压以及氧气分压来实现中空异型细菌纤维素材料的由内向外逐渐由致密变疏松的梯度结构;
a.细菌纤维素生长诱导期1天:控制中空透氧模具内部空气压力为1.1个标准大气压,直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽后慢慢聚集在中空透氧模具外表面,透氧模具外壁包覆一层半透明的细菌纤维素;
b.细菌纤维素快速生长期2天,即疏松层形成阶段:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生2%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
控制中空透氧模具内部空气压力为1.2个标准大气压,同时保持氧气浓度在10%;至透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到1mm;
c.细菌纤维素平稳生长期5天:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生2%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
平稳生长期分两个阶段:
弹性层形成阶段3天,维持中空透氧模具内部空气压力为1.2个标准大气压,同时采用阶段性增加的方式,使氧气浓度每小时增加0.3%,直至氧气浓度达到40%时不再增加,直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到2mm;
致密层形成阶段2天,采用阶段性加压的方式,每小时向透氧模具内充入压力百分数不超过1.25%的空气,直至中空透氧模具内部空气压力达到1.5个标准大气压时不再加压,同时采用阶段性增加的方式,使氧气浓度每小时增加1.5%,直至氧气浓度达到100%时不再增加;直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到3mm,将其取出,即得到具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料;
4)后处理;
静置培养结束后,将上述的具备具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料浸泡至浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中,煮沸保持4小时,用纯净水清洗至pH为7.0,材料内毒素<0.5EU/ml,再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存,即为具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料。
Claims (9)
1.一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的制备方法,其特征是包括以下步骤:
1)发酵培养液的调配;
发酵培养液组分,以质量百分数计,单位为wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2~5,蛋白胨0.05~0.5,酵母膏0.05~0.5,柠檬酸0.01~0.1,磷酸氢二钠0.02~0.2,磷酸二氢钾0.01~0.1,余量为水;
发酵培养液的pH为4.0~6.0;
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温,通纯氧,即得发酵培养液;
2)菌种扩培;
将所述的发酵培养液接种和扩培;
扩培程度:菌种细胞数目在2×105~2×107个/ml;
3)静置培养;
将扩培后的菌液转移至灌满发酵培养液,内部有中空透氧模具的培养容器中,放置于恒温培养箱中,28~32℃静置培养,所述的中空透氧模具内部通入空气;
所述的中空透氧模具是由透氧材料根据所需修复的人体组织的实际形状、直径以及大小制作得到的;所述的中空透氧模具在外形上与人体乳内动脉、隐静脉、尿道、十二指肠、胆管的形状一致;
通过分步调节透氧模具内部空气整体气压以及氧气分压来实现细菌纤维素材料的内腔致密、内部弹性和外壁疏松的由内向外逐渐由致密变疏松的梯度结构;
a.细菌纤维素生长诱导期1~2天:控制中空透氧模具内部空气压力为1.0~1.1个标准大气压,直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽后慢慢聚集在中空透氧模具外表面,透氧模具外壁包覆一层半透明的细菌纤维素;
b.细菌纤维素快速生长期2~3天,即疏松层形成阶段:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生1~5%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
控制中空透氧模具内部空气压力为1.1~1.2个标准大气压,同时保持氧气浓度在10~15%范围内;至透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到0.1~1mm;
c.细菌纤维素平稳生长期3~5天:
所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒张/收缩交替性变化;所述的舒张是指中空透氧模具外径产生1~5%的变化,所述的收缩是指恢复原状;
平稳生长期分两个阶段:
弹性层形成阶段2~3天,维持中空透氧模具内部空气压力为1.1~1.2个标准大气压,同时提高氧气浓度,在不超过40%范围内,直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到0.2~2mm;
致密层形成阶段1~2天,加压使中空透氧模具内部空气压力在1.2~1.5个标准大气压范围内,同时提高氧气浓度,在不超过100%范围内;直至中空透氧模具外壁包覆的细菌纤维素壁厚达到0.3~3mm,将其取出,即得到具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料;
4)后处理;
静置培养结束后,将上述的具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料浸泡至浓度为1~10wt%的氢氧化钠溶液中,煮沸保持2~10小时,用纯净水清洗至pH为7.0,材料内毒素<0.5EU/ml,再将处理后的具备梯度结构的中空异型细菌纤维素材料高压灭菌并包装低温封存,即为具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料;所述的具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料是由三层结合紧密的细菌纤维素构成的中空管状支架材料,所述的三层结合紧密的细菌纤维素膜由内向外依次为致密层、弹性层与疏松层;所述的结合紧密是指所述致密层纤维素微纤丝与所述疏松层纤维素微纤丝、所述弹性层纤维素微纤丝与所述疏松层纤维素微纤丝通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键结合,形成分子层,层与层之间也通过分子内与分子间氢键结合,无明显物理分层;
其中所述致密层中的纤维素含量0.7×10-2~1.0×10-2g/cm3,所述弹性层中的纤维素含量0.3×10-2~0.6×10-2g/cm3,所述疏松层中的纤维素含量0.1×10-2~0.2×10-2g/cm3。
2.根据权利要求1所述的一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的制备方法,其特征在于,所述的高压蒸汽灭菌后紫外辐照是指将所述发酵培养液置于高压灭菌锅内121℃灭菌处理30分钟后取出置于紫外灯下辐照冷却至室温。
3.根据权利要求1所述的一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的制备方法,其特征在于,所述的通纯氧是指将医用氧以1L/min的速度通入上述的培养液中,并维持30分钟;所述的接种是指用灭菌后的接种环钩取适量保存于4℃下试管中的菌种,并转移至上述的发酵培养液中;所述的扩培是指将接入菌种后的发酵培养液于28~32℃下摇床培养8~24小时;
所述的加压为连续增压或阶段性增压;所述的提高氧气浓度为连续增加或阶段性增加。
4.根据权利要求3所述的一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的制备方法,其特征在于,所述的连续增压是指每分钟向透氧模具内充入压力百分数不超过2.083×10-2%的空气,基数是1.2个标准大气压,维持中空透氧模具内空气压力在1.2~1.5个标准大气压范围内,最大不超过1.5个标准大气压;所述的阶段性增压是指每小时向透氧模具内充入压力百分数不超过1.25%的空气,基数是1.2个标准大气压,维持中空透氧模具内空气压力在1.2~1.5个标准大气压范围内,最大不超过1.5个标准大气压;
弹性层形成阶段,所述的连续增加是指:氧气浓度每分钟增加0.00463~0.00694%,直至氧气浓度达到40%时不再增加;所述的阶段性增加是指:氧气浓度每小时增加0.278~0.417%,直至氧气浓度达到40%时不再增加;
致密层形成阶段,所述的连续增加是指:氧气浓度每分钟增加0.0174~0.0347%,直至氧气浓度达到100%时不再增加;所述的阶段性增加是指:氧气浓度每小时增加1.042~2.083%,直至氧气浓度达到100%时不再增加。
5.根据权利要求1所述的一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的制备方法,其特征在于,所述的高压灭菌是指将所述后处理后的具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料浸泡在纯净水中置于高压灭菌锅内121℃灭菌处理30分钟后取出冷却至室温;所述的低温封存是指将高压灭菌后的具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料于4℃下保存。
6.根据权利要求1所述的一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的制备方法,其特征在于,所述的透氧材料是指在常温常压下的氧气透过速率为100~1000mL.m-2.s-1,孔隙均一度偏差<±0.3的材料。
7.根据权利要求1所述的一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的制备方法,其特征在于,所述的周期性的舒张/收缩交替性变化是指通过调节中空透氧模具内部气体压力,充气使中空透氧模具发生膨胀、放气使中空透氧模具恢复原状,以充/放气交替实施的方式,使中空透氧模具外径在每分钟60~165次的频率范围内,每次充气膨胀使中空透氧模具外径产生1~5%的变化。
8.根据权利要求1所述的一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的制备方法,其特征在于,所述的细菌纤维素膜是由菌种消耗糖源,分泌纤维素微纤丝通过分子内与分子间氢键结合形成;所述的菌种是指能够生物合成纤维素的微生物,包括:木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的一种具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的制备方法,其特征在于,所述的具备梯度结构的中空异型细菌纤维素人造血管支架材料的壁厚为0.3~3mm,其中所述致密层的厚度为0.1~1mm,所述弹性层的厚度为0.1~1mm,所述疏松层的厚度为0.1~1mm。
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