CN102994539A

CN102994539A - 加强钝齿棒杆菌nad激酶表达在高低供氧条件下提高该菌株l-精氨酸生产能力的方法

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Publication number: CN102994539A
Application number: CN2012105119925A
Authority: CN
Inventors: 许正宏; 赵芹芹; 窦文芳; 饶志明; 史劲松; 徐美娟
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-12-04
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2013-03-27

Abstract

本发明加强钝齿棒杆菌NAD激酶的表达，以提高该菌株的L-精氨酸生产能力。在高供氧的条件下，NAD激酶活性提高了86.2%，NADP⁺及NADPH分别提高了7.30%及36.84%，L-精氨酸产量提高了12%；在低供氧的条件下，NAD激酶活性提高了34.8%，NADP⁺及NADPH分别提高了14.67%及15.0%，L-精氨酸产量提高了38.5%。

Description

加强钝齿棒杆菌NAD激酶表达在高低供氧条件下提高该菌株L-精氨酸生产能力的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种加强钝齿棒杆菌NAD激酶表达，在高低供氧条件下提高该菌株L-精氨酸生产能力的方法。

背景技术

L-精氨酸(L-Arginine，简称L-Arg)作为一种半必需氨基酸，是合成蛋白质、磷酸肌酸的重要原料，也是生物体内尿素循环的重要中间产物，具有重要的生理功能和应用价值,广泛应用于食品、化工和医药等领域。由于精氨酸具有特殊的应用价值，所以国内需求量巨大，采用发酵法生产L-精氨酸具有环保、经济等优点，所以构建高产L-精氨酸工程菌株对于实现发酵法生产L-精氨酸工业化生产具有重要意义。

NADPH是生物体中一种重要的辅酶，作为电子供体，其为氧化还原反应提供还原动力，而且对于细胞抗活性氧的毒害起到重要作用。NAD激酶催化NAD⁺与ATP反应生成NADP⁺与ADP,这是NADP⁺生物合成的最后一步，也是限速步骤，而NADP⁺通过还原反应生成NADPH，其在生物体内发挥重要的生理功能。谷氨酸棒杆菌作为氨基酸生产菌株，其发酵生产各种氨基酸需要在高溶氧的环境下进行，提供充足的NADPH对于缓解菌体所处的氧胁迫的环境具有重要意义。NADPH作为一些氧化还原反应中的辅酶，在氨基酸生物合成过程中起到了重要作用。在L-精氨酸生物合成途径中需要NADPH的参与：(1)由α-酮戊二酸经谷氨酸脱氢酶（gdh）合成L-谷氨酸需一分子NADPH;(2)由N-乙酰谷氨酸磷酸经乙酰谷氨酸半醛脱氢酶合成N-乙酰谷氨酸-5-半醛需要一分子NADPH，所以增加菌体生产NADPH能力对于提高其L-精氨酸生产能力具有重要意义。在谷氨酸棒杆菌中NADP⁺的还原主要通过脱氢酶催化来实现，其中主要由磷酸戊糖途径（PPP途径）中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH/zwf）及6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGDH/gnd）提供，另外一小部分由TCA循环中的异柠檬酸脱氢酶（ICD/icd），苹果酸酶（ME/malE），其中由G6PDH提供的NADPH占细胞总量的70%以上，而G6PDH是PPP途径中的限速酶，该途径的代谢流受到[NADP+]/[NADPH]比例的调控。所以通过加强NAD激酶的表达增加NADP⁺含量，从而调控PPP途径的流量，进而增加胞内NADPH的含量是有效的方法。

通过加强酶或破坏酶基因的表达来提高菌株对于目标产物的生产能力是代谢工程的主流手段，除此之外，一些研究通过改变辅酶（如NADPH）的水平来改变菌株对目标产物的生产能力，并应用于大肠杆菌、酿酒酵母、谷氨酸棒杆菌中。NADPH作为氨基酸生物合成途径中重要的辅酶因子，通过应用代谢工程手段增强PPP途径或加强NADPH合成的相关基因的表达来增加NADPH的供应，对于提高菌株氨基酸生产能力具有积极的作用。据相关文献报道，在谷氨酸棒杆菌中通缺失葡萄糖磷酸异构酶、加强G6PDH的表达、克隆表达大肠杆菌中关于NADPH合成的相关基因等可有效提高菌株L-赖氨酸的生产能力。

钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）是我国研究者分离得到的一株短棒状、革兰氏阳性菌株。其突变株在国内氨基酸工业中得到广泛的应用。钝齿棒杆菌 SYPA是本实验室通过多级复合诱变筛选获得的一株L-精氨酸高产菌株，其在高供氧的条件下发酵产L-精氨酸。作为一株高产L-精氨酸的菌株，其需要大量NADPH来提供还原动力，同时需要充足的NADPH作为电子供体缓解氧自由基可能对微生物产生的损伤作用。本发明通过加强表达NADPH生物合成的限速酶（NAD激酶）来增加胞内NADPH的供应，一方面保证充足的NADPH为L-精氨酸生物合成提供还原动力；另一方面缓解高供氧发酵条件可能对菌株产生的氧胁迫。通过这种方法来增加钝齿棒杆菌生产L-精氨酸的能力。

发明内容

本发明提供了通过加强钝齿棒杆菌NAD激酶表达在高低溶氧条件下提高该菌株L-精氨酸生产能力的方法。从钝齿棒杆菌SYPA中扩增编码NAD激酶的ppnK基因，与含有tac启动子的穿梭表达质粒pJC-tac连接，电击转化入钝齿棒杆菌SYPA中，构建重组菌株，来增强该菌株的NAD激酶的表达量，从而增加胞内NADP⁺及NADPH的含量，进而提高L-精氨酸的产量。具体发明方案如下：

1.重组菌株SYPA/pJC-tac-ppnK的获取

克隆钝齿棒杆菌SYPA基因组上的ppnK基因，构建表达质粒pJC-tac-ppnK，将该重组穿梭质粒通过电击转化的方法转入钝齿棒杆菌中，获得重组钝齿棒杆菌SYPA/pJC-tac-ppnK。

（1）穿梭质粒pJC-tac-ppnK质粒的构建

依据NCBI中公布的谷氨酸棒杆菌中编码NAD激酶的ppnK的基因序列（GenBank：NC_006958），利用其同源性，设计引物扩增钝齿棒杆菌中的ppnK基因。引物设计如下：

ppnK F Xba I：5’-GCTCTAGAATGACTGCACCCACGAACG-3’

ppnK R Sal I：5’-GCGTCGACTTACCCCGCTGACCTGG-3’

以钝齿棒杆菌基因组为模板，以ppnK F及ppnK R为引物，扩增两端酶切位点分别为XbalⅠ及SalⅠ的ppnK基因片段，PCR产物经过纯化后与pMD 19-T vector 连接，转入E.coli JM 109中保存质粒。从含Amp的平板上挑取单菌落，提取质粒经单、双酶切验证，并测序。对于成功与目的基因连接的质粒，与pJC-tac用相同限制性内切酶进行双酶切，经纯化后连接，获得pJC-tac-ppnk重组质粒。

（2）重组菌株SYPA/pJC-tac-ppnK的构建

提取质粒pJC-tac-ppnK，通过电击转化的方法转化入钝齿棒杆菌中，涂布于含50ug/L的Kan平板上，于30℃条件下培养36h，挑取转化子，于含Kan的液体培养基中培养后，提取质粒验证。

2.重组菌株发酵评价

采用250mL的摇瓶对钝齿棒杆菌进行发酵培养，设定两个不同供氧模型，即装液量分别为20mL、60mL/250mL,分别考察不同供氧条件下，重组菌株与出发菌株发酵过程各项参数的差异，评价NAD激酶增强表达对菌株生长、L-精氨酸生产及碳源消耗的影响。发酵方法如下：

摇瓶种子培养基(g·L^-1)：葡萄糖 30，酵母粉10，尿素 1.5，(NH₄)₂SO₄ 20，KH₂PO₄ 1，MgSO₄·7H₂O 0.5。NaOH调pH7.0～7.2，装液量30 mL/250 mL。115℃灭菌7min

摇瓶发酵培养基(g·L^-1)：葡萄糖 150，酵母粉10，KH₂PO₄ 1.5，(NH₄)₂SO₄ 50， MnSO₄·H₂O 0.02，MgSO₄·7H₂O 0.5，FeSO₄·7H₂O 0.02，L-His 5.0×10^-4，生物素 8×10^-5，轻质CaCO₃ 30。NaOH调pH7.0~7.2，装液量20 mL/250 mL或60 mL/250 mL，115℃灭菌7 min。

培养方法：将保存菌种与含糖肉汤培养基斜面划线，于30℃恒温生化培养箱中培养约20-24h，从斜面上挑取一环菌接种于摇瓶种子培养基，于30℃ 120rpm/min 往复式摇床上培养14-16h至OD562约为15-18，按5%的接种量接种于摇瓶发酵培养基，于30℃ 120rpm/min 往复式摇床上培养24-36h，补加5%的葡萄糖，至发酵结束共培养96h。

发酵参数测定方法：

A.菌体生长：以0.25M的HCl对发酵样品进行适当的稀释，于分光光度计测定A₅₆₂。

B.L-精氨酸含量测定：按照坂口试剂法测定。

C.葡萄糖含量测定：按照DNS法测定。

3.确定pJC-tac-ppnK于钝齿棒杆菌中加强表达。

通过对比重组菌株与出发菌株中NAD激酶的活性，确定由穿梭质粒pJC-tac携带目的基因ppnK在重组菌株中有效表达。

本发明的结果：重组菌株与出发菌株在高低供氧的条件下发酵，在其对数生长后期测定NAD激酶的活性，分别提高了2倍（HOS）及1.2倍（LOS）。发酵108h后测定菌体生物量及发酵液中L-精氨酸产量，高供氧条件下重组菌的生物量为27g/L较出发菌株（32g/L）低，但L-精氨酸产量为28.85g/L较出发菌株（25.35g/L）提高了12%；在低供氧的条件下，重组菌的生物量为17g/L较出发菌株（21g/L）低，但L-精氨酸产量为10.87g/L较出发菌株（7.85g/L）高38.5%。同时，重组菌株中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性提高，NADP⁺及NADPH的含量均有提高，NAD⁺及NADH的含量均有下降。综合以上数据，pJC-tac-ppnK在钝齿棒杆菌中成功表达，且NAD激酶的表达，对菌株产L-精氨酸具有积极的意义。

附图说明

图1 重组质粒pJC-tac-ppnK构建的示意图

图2 pJC-tac-ppnK质粒构建的核酸电泳图 1：DL5000 marker 2：PCR扩增ppnK产物 3：pJC-tac质粒酶切 4：pJC-tac-ppnK单酶切 5：pJC-tac-ppnK以XbaⅠ及SalⅠ双酶切 6：DNAλHindⅢ marker

图3 高低供氧条件重组菌株与出发菌株的全细胞蛋白电泳

M：蛋白Marker

1：高供氧出发菌株 2：高供氧重组菌株 3：低供氧出发菌株 4：低供氧重组菌株；

图4 高供氧条件下重组菌株与出发菌株发酵过程测定与比较

（A）菌体生物量（B）L-精氨酸产量（C）葡萄糖含量

（▲）重组菌株（◆）出发菌株

图5 低供氧条件下重组菌株与出发菌株发酵过程测定与比较

（A）菌体生物量（B）L-精氨酸产量（C）葡萄糖含量

（▲）重组菌株（◆）出发菌株

图6 应用高效液相分析发酵液中的游离氨基酸

具体实施方式

实施例1 重组钝齿棒杆菌SYPA/pJC-tac-ppnK的构建

1.重组菌株SYPA/pJC-tac-ppnK的获取

（1）穿梭质粒pJC-tac-ppnK质粒的构建

依据NCBI中公布的谷氨酸棒杆菌中编码NAD激酶的ppnK的基因序列，利用其同源性，设计引物扩增钝齿棒杆菌中的ppnK基因。引物设计如下：

ppnK F Xba I：5’-GCTCTAGAATGACTGCACCCACGAACG-3’

ppnK R Sal I：5’-GCGTCGACTTACCCCGCTGACCTGG-3’

以钝齿棒杆菌基因组为模板，以ppnK F及ppnK R为引物，扩增两端酶切位点分别为XbalⅠ及SalⅠ的ppnK基因片段，PCR产物经过纯化后与pMD 19-T vector 连接，转入E.coli JM 109中保存质粒。从含Amp的平板上挑取单菌落，提取质粒经单、双酶切验证，并测序。获得目的基因序列完全正确的pMD 19-T-ppnK质粒。

对于成功连入T载体的质粒，与pJC-tac用Xba I及Sal I双酶切，经核酸电泳分别对目的基因片段和pJC-tac酶切片段进行割胶回收，用T4 DNAligase连接后转化入E.coli JM 109中保存质粒。从含Kan的平板上挑取单菌落，提取质粒经单双酶切验证，获得pJC-tac-ppnK重组质粒。

重组质粒pJC-tac-ppnK的构建流程示意图如图1所示，其构建过程的核酸电泳图如图2所示。ppnK基因约960bp，与图2中ppnK的PCR产物的长度一致。之后对重组质粒进行单双酶切，单酶切条带位置约7300bp左右，双酶切有两条带，一条与空质粒酶切的位置相当，一条与ppnK的PCR产物条带位置相当，说明pJC-tac-ppnK穿梭质粒构建成功。

（2）重组菌株SYPA/pJC-tac-ppnK的构建

从E.coli JM 109中提取质粒pJC-tac-ppnK，通过电击转化的方法转化入钝齿棒杆菌感受态中，电转后加入培养基，于30℃ 120rpm/min摇床上振摇2h，使菌体复苏，表达抗性基因。而后将菌液涂布于含50ug/L的Kan平板上，于30℃条件下培养36h，挑取转化子，于含Kan的液体培养基中培养后，提取质粒进行PCR验证或双酶切验证。挑选成功转化的菌株进行进一步发酵实验。

实施例2：重组菌株与出发菌株分别在高低供氧的条件下发酵，分别考察NAD激酶表达对其发酵参数的影响。

采用250mL的摇瓶对钝齿棒杆菌进行发酵培养，设定两种不同的供氧模型，即摇瓶装液量分别为20/250mL及60/250mL。发酵方法如发明内容中所述，发酵108h，每隔12h取一次样，测定所有样品的菌浓及发酵上清中L-精氨酸及葡萄糖的含量。具体发酵过程参数如图5。

如图5所示，在高供氧的环境下，重组菌株的菌体生物量一直低于出发菌株，这可能与重组菌株本身携带者较大的重组质粒有关。至发酵96h，重组菌的生物量为27g/L较出发菌株（32g/L）降低约16%。在L-精氨酸积累的过程中，重组菌株在发酵前期并未表现出明显的优势，至发酵72h后，重组菌株才表现出产酸的优势，至发酵96h，重组菌株L-精氨酸产量为28.85g/L较出发菌株（25.35g/L）提高了12%。在葡萄糖的消耗过程中，出发菌株的消耗速率高于重组菌株，在发酵后期，消耗速率的差距缩小，碳源的消耗主要用于菌体的繁殖及L-精氨酸的积累。

如图6所示，在低供氧的环境下，重组菌株的菌体生物量一直低于出发菌株，这与高供氧的情况类似，但其菌体生物量较高供氧的环境下大幅度下降。至发酵96h，重组菌的生物量为17g/L较出发菌株（21g/L）降低约19%。在L-精氨酸积累的过程中，重组菌株在发酵前期并未表现出明显的优势，至发酵36h后，重组菌株表现出产酸的优势，至发酵96h，重组菌株L-精氨酸产量为10.87g/L较出发菌株（7.85g/L）提高了38.5%。在葡萄糖的消耗过程中，在发酵前期出发菌株的消耗速率高于重组菌株，在发酵后期，重组菌株的糖耗速率明显加快，这可能是由于 L-精氨酸积累量的提高有关。

由以上发酵实验可见，在高低供氧的条件下NAD激酶增强表达对菌株的生长及L-精氨酸的生产存在影响。在一定程度上提高了菌体L-精氨酸的生产能力，所以加强NAD激酶的表达对于钝齿棒杆菌生产L-精氨酸具有积极的意义。

实施例3 高低供氧条件下重组菌与出发菌发酵液中其它游离氨基酸分析

高低供氧条件下重组菌与出发菌的发酵方法如发明内容中所述，至发酵72h后，取样，离心获得上清，经适当稀释后，采用异硫氰酸苯酯衍生法对发酵样品中的氨基酸进行衍生化。衍生后的样品用高效液相色谱进行分析，以80%的乙腈及碳酸氢钠为流动相，采用梯度洗脱的方式，分析图谱如图7所示。发酵液中的杂酸较少，以L-精氨酸含量最高，其次为赖氨酸、异亮氨酸、甘氨酸及苯丙氨酸等。

分析结果如表3所示，其中以精氨酸、异亮氨酸及赖氨酸含量有较大变化。在高低溶氧条件下，重组菌较出发菌在精氨酸、赖氨酸及异亮氨酸的含量上均有不同程度提高。这可能与三种氨基酸生物合成途径中多种氧化还原反应需要NADPH提供还原动力有关。所以通过加强NAD激酶的表达来提高菌株L-精氨酸的生产能力的方法是行之有效的。

表3 发酵液中游离氨基酸分析

Claims

1.一种提高钝齿棒杆菌SYPA在高低供氧条件下生产L-精氨酸生产能力的方法，其特征为，通过加强钝齿棒杆菌SYPA的NAD激酶表达，以提高该菌株的L-精氨酸生产能力。

2.依据权力要求1中所述的方法，其特征为应用穿梭表达质粒pJC-tac携带编码NAD激酶的ppnK基因于钝齿棒杆菌SYPA中表达。

3.依据权力要求1所述方法，其特征为克隆钝齿棒杆菌SYPA基因组上的ppnK基因，构建表达质粒pJC-tac-ppnK，将该重组穿梭质粒通过电击转化的方法转入钝齿棒杆菌中，获得重组钝齿棒杆菌SYPA/pJC-tac-ppnK；

（1）穿梭质粒pJC-tac-ppnK质粒的构建

依据NCBI中公布的谷氨酸棒杆菌中编码NAD激酶的ppnK的基因序列，利用其同源性，设计引物扩增钝齿棒杆菌中的ppnK基因，引物设计如下：

ppnK FXba I：5’-GC TCTAGA ATGACTGCACCCACGAACG-3’

ppnK R SalI：5’-GC GTCGAC TTACCCCGCTGACCTGG-3’

以钝齿棒杆菌基因组为模板，以ppnK F及ppnK R为引物，扩增两端酶切位点分别为XbalⅠ及SalⅠ的ppnK基因片段，PCR产物经过纯化后与pMD 19-T vector 连接，转入E.coli JM 109中保存质粒；从含Amp的平板上挑取单菌落，提取质粒经单、双酶切验证，并测序；对于成功与目的基因连接的质粒，与pJC-tac用相同限制性内切酶进行双酶切，经纯化后连接，获得pJC-tac-ppnK重组质粒；

（2）重组菌株SYPA/pJC-tac-ppnK的构建

4.依据权力要求1所述方法，其特征为采用250mL摇瓶对重组钝齿棒杆菌发酵培养，构建两种不同的供氧模式，装液量20ml的为高供氧环境，装液量60ml的为低供氧环境，分别在高供氧和低供氧的发酵环境下利用重组钝齿棒杆菌生产L-精氨酸。