CN102994515A - 同种异基因肿瘤治疗剂 - Google Patents
同种异基因肿瘤治疗剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102994515A CN102994515A CN2012103165007A CN201210316500A CN102994515A CN 102994515 A CN102994515 A CN 102994515A CN 2012103165007 A CN2012103165007 A CN 2012103165007A CN 201210316500 A CN201210316500 A CN 201210316500A CN 102994515 A CN102994515 A CN 102994515A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- nucleic acid
- sequence
- acid molecule
- csf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title abstract description 39
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 title abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 title description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims description 55
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 50
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 44
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims description 44
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 43
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 claims description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 29
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 claims description 28
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 claims description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 23
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 13
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 8
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- 229940109357 desoxyribonuclease Drugs 0.000 claims description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 31
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 25
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 76
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 37
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 31
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 description 26
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 25
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 241000256135 Chironomus thummi Species 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 7
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 5
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940046168 CpG oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 101001043807 Homo sapiens Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018259 Solanum vestissimum Nutrition 0.000 description 2
- 240000002825 Solanum vestissimum Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- -1 amido modified Brdurd Chemical class 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 102000052622 human IL7 Human genes 0.000 description 2
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 1
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 1
- 108010069446 Fertilins Proteins 0.000 description 1
- 102000001133 Fertilins Human genes 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108010035452 HLA-A1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000005711 Keratin-7 Human genes 0.000 description 1
- 108010070507 Keratin-7 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 108060006580 PRAME Proteins 0.000 description 1
- 102000036673 PRAME Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710143177 Synaptonemal complex protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036234 Synaptonemal complex protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010047281 Ventricular arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000284 endotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 208000027889 monkey disease Diseases 0.000 description 1
- PUPNJSIFIXXJCH-UHFFFAOYSA-N n-(4-hydroxyphenyl)-2-(1,1,3-trioxo-1,2-benzothiazol-2-yl)acetamide Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1NC(=O)CN1S(=O)(=O)C2=CC=CC=C2C1=O PUPNJSIFIXXJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- MKNJJMHQBYVHRS-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[11-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)undecanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCCCCCCN1C(=O)C=CC1=O MKNJJMHQBYVHRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 238000009603 uroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5152—Tumor cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K2039/55527—Interleukins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种用于***疾病的基于同种异基因肿瘤细胞的疫苗,以及一种用于制备这种疫苗的方法,此外还涉及用作疫苗的转染的人肿瘤细胞。
Description
本申请是申请日为2004年4月20日的第200480039664.3号发明名称为“同种异基因肿瘤治疗剂”的中国专利申请的分案申请。
本发明涉及一种用于***疾病的基于同种异基因肿瘤细胞的疫苗,以及一种制备这种疫苗的方法。此外,本发明还涉及转染的人肿瘤细胞作为疫苗的用途。
除了治疗癌性疾病的传统方法(如放疗和化疗,从20世纪50年代以来它们就构成了治疗进展性和播散性肿瘤疾病的唯一选择)之外,当面对着转移性肿瘤时,免疫治疗似乎是一种很有前途的方法。
免疫治疗的目的是通过来源于基因技术领域的修饰技术来增强对抗肿瘤疾病的天然应答,据此增加免疫***对癌细胞的“警惕性”,并提高肌体本身对抗肿瘤的防御反应。
一些恶性疾病例如进展性肾细胞癌似乎对免疫治疗的干预是相当敏感的,但是利用细胞因子(例如IL-2和IFN-α)的全身治疗有时伴有严重的副作用。因此,已经发展出了其他的免疫治疗方案。
目前绝大多数的临床研究都依赖于取出肿瘤、随后用治疗基因在离体转染肿瘤细胞、照射肿瘤细胞群以及随后重新植入经修饰的肿瘤细胞。通过这样的肿瘤疫苗接种,可以不同程度地增加抗肿瘤效应,增加的程度依赖于所转染的治疗基因。
根据这种方法以及试验动物研究的结果,已经批准了多个I期和II期临床研究(Finke et al.,1997;Wittig et al.,2001)。
但是,这些研究的初步结果表明除了对治疗的较好的耐受性之外,仅仅在少数病例中观察到了部分或完全反应。
基因转移CD40L/CD154能在结肠癌小鼠模型中诱导肿瘤的根除和免疫力(Sun等,2000)。
本发明的申请者/受让人发现,向肿瘤细胞内转移人白介素7(IL-7)的表达质粒导致了肿瘤细胞对免疫***的效应细胞的敏感性的增加,尤其是自体转移(Finke et al.,1997,Cancer Gene Ther.4:260-268)。相似地,本发明者证实,向自体肿瘤细胞内转移进两种治疗基因(IL-7、GM-CSF)之后,可以在50%患者中观察到显著的临床反应(WO02/060476)。
从US 5,681,562的阐述中已知,给患有某些癌症的患者体内注射已经以编码细胞因子的DNA或RNA转染的细胞,可刺激患者的免疫***对抗肿瘤抗原。在专利说明书中,描述了其中用编码IL-2的逆转录病毒载体转染小鼠成纤维细胞的试验。也描述了一个体内试验,其中在小鼠的结肠癌模型中测试了治疗的疗效。与对照组比较,经皮下注射转染的成纤维细胞的小鼠表现出明显更慢的肿瘤生长。利用人转染成纤维细胞的体外试验显示其显著增加了IL-2的表达水平。除了缺乏小鼠模型以外的临床数据外,在这些试验中被采用作为表达载体的病毒载体也被认为是不利的载体。减毒疫苗株的不稳定性不能确保其不被逆转成为有毒株,以及病毒组分本身可以是免疫原性的,这将使得患者的免疫***减弱它们的疗效。在此所列的这些缺点仅仅是病毒***的缺点的一部分,这明显削弱了该***作为基因治疗载体的用途。
一些文章显示用细胞因子基因联合生长因子GM-CSF获得了最佳的治疗效果(Paillard,1998,Hum.Gene Ther.9:2457-2458;Schadendorf et al.,1995,J.Mol.Med.73:473-477)。GM-CSF在肿瘤抗原接种中的重要性也体现在其增强针对肽疫苗接种的临床及免疫学的抗肿瘤应答1996)。呈递抗原的树突状细胞的活化以及对效应细胞群的刺激似乎在这个方面起到了关键作用。
但是,至今还不清楚哪个细胞因子基因联合免疫原性制剂和GM-CSF能触发最有效的抗肿瘤应答。
在小鼠试验中,显示用编码IL-7的表达构建体的接种生成了抗肿瘤效应(Miller et al.,1993,Blood 18:3686-3694;Murphy et al.,1993,J.Clin.Invest.92:1918-1924)。也显示细胞毒淋巴细胞(CTL)与IL-7或IL-7转染的细胞进行孵育导致了小鼠体内的肿瘤消退(Jicha et al.,1991;Hock et al.,1993),以及用IL-7和B7.1/CD80的转染导致了CD28+CD25+T细胞的浸润及免疫力(Cayeux et al.,1995)。
至今还没有实现治疗的成功,甚至在小鼠模型中也没有成功。
此外,在涉及通过利用质粒DNA或寡核苷酸序列的基因治疗而刺激免疫应答的试验中,观察到某些包括CpG基序(CpG=未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸)的核酸序列具有巨大的免疫刺激作用(Schmidt-Wolf et al.,1989,J.Immunol.Methods 125:185-189)。基于这个原因,在非常早的时候,免疫刺激序列(ISS)就已经在基于DNA的抗感染性病原体的免疫接种方案中被用作佐剂。在小鼠试验中,证实了注射富含CpG的DNA序列导致了对B细胞的强烈激活并刺激了某些细胞因子(例如IL-6和GM-CSF)的表达。在小鼠模型中也显示,在肿瘤接种前3天,用CpG寡脱氧核苷酸(ODN)与融合蛋白的共同免疫接种可以阻止小鼠体内的肿瘤生长(Liu etal.,1998)。在WO 98/18810中详细地解释了对含有免疫刺激性CpG的ISS的用途及合成的阐述。
WO 00/04918显示了用编码例如干扰素γ和GM-CSF的基因转染肿瘤细胞。质粒可以被用作为表达载体。该申请阐述了一种用免疫治疗方法***疾病的概念。没有显示相关的证明要求保护的疫苗的疗效的体内或体外数据或临床结果。需附加说明的是这些没有限定其应用的基于质粒的载体在人体基因治疗中是没有用的,因为除了治疗序列外,它们还包括其复制所必需的遗传学功能单位。它们也包括其选择所需的抗生素耐药基因。结果是非治疗所需的哺乳动物或细菌的蛋白质的持续表达。
尽管研究了多年以及有着有前途的方法,但是通过施用免疫原性物质发展出一种基于对抗肿瘤疾病的免疫功能的有效治疗仍是不可能的。
本发明的目的是提供一种用于治疗与细胞因子有关的疾病(例如癌性疾病)的药物组合物形式的疫苗,它是特异性的和有效的,并特异性地诱导了肿瘤特异性的免疫应答。此外,也将提供了一种制备这种疫苗的方法。
通过独立权利要求的要素实现该目的。
在本发明中,将采用下面的含义:
同种异基因 起源于同一物种的遗传学不一致的个体,与“自体”(来自同一个体的细胞)相反
APC 抗原呈递细胞
B7.1/CD80 分化抗原簇80
CD40L/CD154 分化抗原簇40配体
DC 树突状细胞
dSLIM 双茎环免疫调节寡脱氧核苷酸
GM-CSF 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子
IL-7 白介素-7
ISS 免疫刺激核酸序列
ODN 寡脱氧核苷酸
TAA 肿瘤相关抗原
在下面所述的内容中,应当如下理解许多常用的术语:
转染的细胞在本发明中的含义是经本发明的编码表达载体在离体处理过的人同种异基因肿瘤细胞,因此,作为这种处理的结果,所述细胞表达所编码的细胞因子和共刺激因子序列,并能用作肿瘤疾病的一种免疫治疗工具。
在本发明中,术语“共刺激因子”和/或细胞因子代表天然存在的共刺激因子和/或细胞因子、共刺激因子和/或细胞因子的所有修饰体、突变体和衍生物、以及用重组技术制备的含有如倒转、缺失、***、附着等氨基酸修饰的共刺激因子和/或细胞因子,条件是它们保留了至少一部分野生型共刺激因子和/或细胞因子的基本功能。这些共刺激因子和/或细胞因子可以含有罕见的氨基酸和/或修饰例如烷基化、氧化、巯基修饰、变性和寡聚化等。在本发明中,共刺激因子和/或细胞因子可以是蛋白、肽和/或含有共刺激因子和/或细胞因子的全部或一部分,并与其他蛋白、肽或其一部分结合的融合肽。在本发明的另一个实施方式中,共刺激因子和/或细胞因子是天然存在的共刺激因子和/或细胞因子的截断形式。
上述提及的所有的适用于调节免疫***的反应的共刺激因子都是如在本发明中所定义的免疫原性物质。因此,本发明的疫苗是一种免疫原性组合物,因为它含有免疫原性物质的组合。在很多性质上,肿瘤细胞都不同于正常细胞,如细胞表面蛋白的不同表达。特别的,肿瘤相关抗原(TAA)的表达理论上容许免疫***识别并破坏这些细胞。但是,在许多情况中,患者的免疫***被严重地抑制,以致其不能识别这些突变细胞。
通过提供一种用于治疗患有确定的肿瘤疾病的患者的疫苗解决了这个问题,其中该疫苗包括另一个患者的肿瘤细胞(同种异基因细胞),并且在此之前已经用编码白介素-7(IL-7)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF和共刺激因子CD40L/CD154和B7.1/CD80的表达构建体离体转染了这些肿瘤细胞。在本发明的另一个实施方式中,获得了一种相应的疫苗,其中在此之前用编码白介素-7(IL-7)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF和共刺激因子CD40L/CD154的表达构建体转染了肿瘤细胞。
所采用的肿瘤细胞可以来源于具有与所治疗的患者相似的病症的患者,或来源于具有不同于所治疗的患者的病症的患者。
疫苗的组分(免疫原性化合物)的组合将保证生成所有信号级联的三个步骤,它们对于诱导特异性的免疫应答是必需的。这三个步骤包括抗原呈递、共刺激以及提供合适的局部环境。
GM-CSF和CD40L/CD154的表达将确保局部募集并激活抗原呈递细胞(APC)和树突状细胞(DC)。因此,观察到对TAA呈递的增强。
B7.1/CD80的表达造成了共刺激活性的增加。这反过来增加了TAA组分的抗原性以及增加了被活化的抗TAA的T淋巴细胞的数目。IL-7的表达另外还诱导了肿瘤特异性T淋巴细胞的增殖。
因此,本发明的疫苗结合肿瘤细胞表面的TAA诱导了高浓度的可溶性的刺激增殖的细胞因子和共刺激分子,这导致了在施用部位的肿瘤特异性T细胞的增殖。也诱使APC和DC迁移到施用部位。
表达构建体可以以质粒的形式存在,优选的也可以是最小化免疫学定义的基因表达构建体。有着仅仅由CMV启动子、内含子、编码基因序列和聚腺苷酸化序列构成的线性双链共价闭合表达盒。表达盒的两个末端均通过单链核苷酸残基短环而共价闭合。这些共价闭合的最小DNA构建体在下文中称为MIDGE载体(MIDGE:最小免疫学定义的基因表达载体);见EP 0 941 318 B1。MIDGE构建体所表现出的优点是应用该构建体可以避免非治疗疗效所必需的结构,因此避免了普通基因转移载体的缺点。
通过施用免疫刺激核酸序列(ISS)形式的佐剂提供了容许诱导特异性免疫应答的局部环境。为了实现这个目的,本发明提供了含有附加的免疫调节寡脱氧核苷酸的疫苗作为佐剂。优选地,疫苗包括免疫调节寡脱氧核苷酸,其包括:
a)包括碱基序列N1N2CGN3N4的序列,其中N1N2是选自包括GT、GG、GA、AT或AA的组的元件,N3N4是选自包括CT或TT的组的元件,C是脱氧胞苷,G是脱氧鸟苷,A是脱氧腺苷,以及T是脱氧胸苷,
b)和具有部分互补的反向平行碱基序列的环状链脱氧核糖核酸,并且它具有哑铃状的形状。
ISS的CpG基序(见图2a)增加了NK细胞和巨噬细胞的活性并强烈刺激了TH1型细胞免疫应答。因此,它们可作为免疫调节剂,容许并增强了肿瘤特异性的免疫应答。在一个优选的实施方式中,使用了如在WO01/07055中所述的长度为30个碱基对的共价闭合的ISS。这些构建体在下面被称作为dSLIM(双茎环免疫调节寡脱氧核苷酸)。
具有碱基序列N1N2CGN3N4的序列位于寡脱氧核苷酸的单链区,并包括40到200个核苷酸(见图2b)。
本发明的主题还涉及一种制备如上所述的用于治疗患有肿瘤疾病的患者的疫苗的方法,其中用编码
a)白介素-7(IL-7)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD40L/CD154和B7.1/CD80,或
b)白介素-7(IL-7)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和CD40L/CD154
的核酸分子离体转染同一物种的遗传学不一致的供体(同种异基因)的肿瘤细胞,随后将肿瘤细胞转移到适用的药物组合物中。上面已经所述的免疫调节寡脱氧核苷酸包括具有部分互补的反向平行碱基序列的环状链脱氧核酸,并具有哑铃状的形状。作为佐剂,它们也是本发明的方法的一部分。
因此本发明提供了一种同种异基因肿瘤细胞,其含有至少3种(优选的4种)核酸分子,所述核酸分子编码共刺激因子B7.1/CD80和CD40L/CD154以及细胞因子白介素-7和GM-CSF。
因此,本发明的主题也是同种异基因人肿瘤细胞,其相应地被编码
a)白介素-7(IL-7)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD40L/CD154和B7.1/CD80,或
b)白介素-7(IL-7)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和CD40L/CD154
的核酸构建体进行离体转染,并且所述肿瘤细胞包括相应的表达构建体。肿瘤细胞包括质粒形式的表达构建体,或在双链的两个末端均经单链核苷酸残基短环共价闭合的仅仅由CMV启动子、内含子、编码基因序列和聚腺苷酸化序列构成的线性双链共价闭合表达盒形式的表达构建体。优选地,使用的是肾细胞癌细胞系的同种异基因肿瘤细胞。
对于疫苗,本发明的方法提供了作为一或多种表达构建体形式的核酸分子。因此,可以提供用于多基因表达的DNA表达构建体,其
-由含有线性表达盒的双链区构成,所述线性表达盒至少包括启动子序列和编码序列,
-且这些双链区通过DNA单链或非编码性DNA双链而连接,
-且那些末端未与其他表达盒通过DNA单链或非编码性DNA双链相连接的表达盒被保护而免于外切核酸酶的降解。
PCT/DE03/02478已经描述了这种用于多基因表达的DNA表达构建体。因此,多个作为本发明的疫苗的对象的核酸可以包括在单独一种表达构建体中。
在本发明的一个特别优选的实施方式中,核酸分子是DNA,特别是cDNA或基因组DNA。显而易见,可以优选的是核酸分子为RNA分子。
同种异基因肿瘤细胞来源于患有结直肠癌、小细胞和非细胞肺癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌和肾细胞癌、以及恶性黑色素瘤的患者。
在本发明的描述过程中,具体采用了肾细胞癌细胞系,它特别适合于制备本发明的疫苗。一个优选的肾细胞癌细胞系是作为活培养物保藏于DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物菌种保藏中心))的保藏号为DSM ACC 2635的细胞系。通过经生物的、化学的和/或物理的方法的转染方式将DNA表达构建体转移到该细胞系的细胞内,这导致细胞表达所需的基因。将一种佐剂(优选的是ISS,最优选的是dSLIM(见上))加入到转染的同种异基因细胞内。在用伽马射线放射性照射转染的同种异基因肿瘤细胞之后,将本发明的疫苗施用给患有肿瘤疾病的患者。
与自体细胞不同的是,细胞所来源的肌体并非药物组合物所治疗的肌体。一方面,使用同种异基因细胞的优点是细胞可被表征一次并可重复地增殖。另一方面,同种异基因的作用被认作为是附加的佐剂刺激。
被修饰的细胞可以来源于单个(不同个体)肌体或可以收集于数个具有相同病症的肌体。
因此,本发明的对象是可被表达的并编码两种细胞因子和一种或两种共刺激因子的三种或四种核酸的组合。
ISS,优选地是dSLIM,可被用作为附加的免疫调节剂。
在原代人细胞系的细胞培养试验中可以验证在转染后为三重或四重阳性的细胞(见图1)。“三重”或“四重”在本文中意思是高百分比的被所有的三种或四种编码GM-CSF、IL-7、CD40L/CD154和B7.1/CD80的基因所成功转染的细胞以及这些细胞表达这三种或四种基因。对于在本试验中所采用的结肠癌细胞系,用FACS(荧光激活细胞分类术)分析确定出所有细胞中的14.4%是四重阳性的细胞。此外,不论基因的种类,确定出所有细胞中的20.3%被一种基因所成功转染,19.9%的细胞被三种不同的基因所成功转染。确定出在用编码CD40L/CD154、GM-CSF、B7.1/CD80和IL-7的表达构建体四重转染之后被成功转染的结肠癌细胞的百分比是14.4%的细胞。因此,14.4%的细胞被四种不同的基因所转染并能成功地表达这些基因。总之,69.4%的所有细胞被至少一种或多种基因所转染。
利用数个基因的转染是有利的,因为通过这种方式,所表达的细胞因子和共刺激因子以紧密的空间接近性的方式被表达在免疫***的效应器官内。这种空间接近性是重要的,因为共刺激因子只有效地增强抗原的免疫接种。
对于转染,可以采用基本已知的生物的、化学的和/或物理的方法,例如经弹道转移(ballistischem transfer)的转染(EP 0686697)、聚阳离子转染、磷酸钙沉淀、微注射、原生质融合、脂质体融合、病毒转染***、脂染和/或电穿孔。在本发明的一个优选的实施方式中,用电穿孔实现转染。
另外,有利的方法是生物学转染方法,例如受体介导的基因转移。在此,在一个实例中,编码至少一种(优选的是两种)共刺激因子和两种细胞因子的DNA表达构建体与寡肽共价连接,寡肽优选地是猴病毒SV-40的核定位信号(NLS)。
通过使用其他的肽(可以是人工合成的肽)进一步地增加转染效率是有可能的。本方法特别适用于在静脉内应用之后的细胞特异性的体内基因转移。
本发明的疫苗以及根据本发明的方法从同种异基因肿瘤细胞中制备的疫苗显示出令人惊讶的作用。其可以纠正肿瘤患者的免疫***的缺陷并且可以增强针对肿瘤特异性抗原的内在的免疫应答,两者都是在同一时间以及都是以有利的方式进行。
此外,可以采用疫苗作为用于增强和重建针对残余肿瘤细胞或消除已经去除了肿瘤的患者体内的残余肿瘤块的免疫应答的佐剂治疗。因此,预测经外科手术去除了原发肿瘤且没有可见的转移灶的患者将从可能降低复发率的附加的肿瘤特异性治疗中获益。
本发明的其他有利的实施方式可以来源于独立的权利要求书和说明书。下面在附图和实施例中更详细地描述了本发明(包括本发明的治疗方法如疫苗用于癌症治疗剂的令人惊讶的作用)以及本发明的方法。如附图所示:
图1:四重转染的人结肠癌细胞的FACS强度。通过编码CD40L/CD154、GM-CSF、B7.1/CD80和IL-7的表达载体的电穿孔实现转染。
图2a和b:免疫调节剂(dSLIM)的图解描述:具有三个CG基序的哑铃结构,每个CG基序都是图解所示的发夹环结构;I是环和II是茎。
为了证实基因产物,采用了与四种不同的荧光染料相连接的抗体。在图1中,它们被称作为:
CD80-FITC
hGMCSF-PE
IL7-PerCP
CD154-APC
荧光激活细胞分类术(FACS)在四个不同的通道中检测这些颜色,在x坐标系中分别被称作为FL1-H、FL2-H、FL3-H和FL4-H。x轴上的指数表示相对荧光强度。y轴显示近似代表所检测的细胞的数目的计数。用“设门”操作进行分析,其中仅仅计数适合通过某一能量门的细胞。
在下面的表1中,给出了在用编码CD40L/CD154、GM-CSF和IL-7的表达构建体三重转染或用编码CD40L/CD154、GM-CSF、B7.1/CD80和IL-7的表达构建体四重转染之后被成功转染的同种异基因肾细胞癌细胞的百分比。
表1:
通过用荧光标记的抗体染色细胞确定出共刺激因子B7.1/CD80和CD40L/CD154的转染;通过测定细胞培养物的培养基中的细胞因子的浓度确定出细胞因子IL-7和GM-CSF的转染程度。
在7到10天的间隔内,以注射周期的形式(每次都包括两次注射)将由离体转染的同种异基因细胞构成的本发明的疫苗注射到具有转移性实体肿瘤的患者体内。先前已经用编码IL-7、GM-CSF、CD40/CD154和/或B7.1/CD80的表达载体转染了细胞,以及在其后已经将其与免疫刺激序列(ISS)混和。在第1天,将第一次的两次注射施用到左侧和右侧上臂的外侧皮肤的经典接种部位内(皮内),在第7天(第10天)施用到左侧和右侧大腿的上方皮肤的经典接种部位(皮内)内,在第14天(到20天)施用到脐右侧和右侧约30mm的皮肤下(皮下),以及在第21天(到30天)再次施用到上臂,只是这次是皮下注射。
所有的患者在治疗开始时都是疾病的进展状态。为了评价临床成效,根据世界卫生组织(1979)使用下面的术语:部分应答(PR)指的是已知肿瘤灶在过去四周内缩小超过50%,并且没有出现新的肿瘤灶。疾病稳定(SD)指的是病变持续。混和应答(MR)指的是混和应答,例如转移灶的进展以及另一处转移灶的缩小,完全应答(CR)指的是肿瘤病灶的完全缓解。
下面将通过实施例更详细地解释本发明,本发明并非被限定于这些实施例。
接种
患有小细胞肺癌的男性患者在7天的间隔内接受了本发明疫苗的四次序贯接种。已经如上所述的处理同种异基因的肾细胞癌细胞系。在转染后24小时进行对表达的控制(control)。通过用荧光标记的抗体染色细胞以及随后用流式细胞术分析进行对共刺激因子B7.1/CD80和CD40L/CD154的表达的控制。通过用ELISA的方式测定相应的浓度进行对细胞因子IL-7和GM-CSF的表达的确定。
成功转染指的是:活的、阳性细胞。表1给出了转染数据。被B7.1/CD80成功转染的细胞的百分比的范围是在66.3和87.6%之间。被CD40L/CD154成功转染的细胞的百分比的范围是在21.6和29.5%之间。细胞因子IL-7的浓度范围是在每1x106个细胞14.9和38.2ng之间。GM-CSF的浓度范围是在每1x106个细胞370.6和1,567.2ng之间。
对于用编码CD40L/CD154、GM-CSF和IL-7的表达构建体的三重接种的转染,被CD40L/CD154成功转染的细胞的百分比是60.8%。细胞因子IL-7的浓度是每1x106个细胞21.7ng。GM-CSF的浓度是每1x106个细胞698.9ng。
转移性肿瘤疾病的治疗
患者的选择:入选的患者都是年龄18到70岁以及Karnofsky指数为70-100的结直肠癌、小细胞和非细胞肺癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌和肾细胞癌、以及恶性黑色素瘤的患者。排除标准是:在不到28天前有过先前的细胞因子或化疗的治疗、肌酐值超过265微摩尔/L、胆红素值超过51微摩尔/L、失代偿性心功能不全、室性心律失常、重度精神疾病、活动性A、B或C型肝炎、HIV感染。
治疗:除了既往病史之外,在治疗前先确定出以下参数:体格检查、血液学(血红蛋白、红细胞压积、白细胞和血小板计数)、以及血液的生化分析和尿液检查。取血确定免疫状态。用Multitest Merieux assay(Leimen,德国)进行DHT(延迟型过敏反应)皮肤测试。进行上半身和腹部的x线扫描和计算机断层。患者接受四次至少8x106-1.4x107个先前经离体处理的肿瘤细胞的细胞的皮下注射。在第14、28和56天重复全面的免疫学检查、血液学检测和粗略的临床检查(体格检查、超声波检查以及如果需要,则检查下半身)。在第84天进行与注册之前进行的检查相当的完整的临床和免疫学检查。
最小免疫学定义的基因表达构建体(MIDGE)
采用共价闭合的最小DNA表达载体转染肿瘤细胞。用表达载体表达人白介素-7(IL-7)、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和共刺激因子B7.1/CD80和CD40L/CD154。在符合B级标准的实验室中,根据SOP流程以及随后的质量控制合成MIDGE载体。
将IL-7(NCBI编号Nr.:J04156)、GM-CSF(NCBI编号Nr.:M11220)、B7.1/CD80(NCBI编号Nr.:AF177937)和CD40L/CD154(NCBI编号Nr.:S49008,取自国立生物技术信息中心的数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov))的编码序列***到pMOK质粒内,并作用为合成MIDGE载体的起始材料。质粒pMOK包括来自CMV病毒的强立即早期启动子、内含子和SV-40病毒(MOLOGEN,Berlin)的聚腺苷酸化序列。
用限制性内切酶Eco31I在37°C下消化过夜以完成对编码IL-7的质粒pMOK的消化。限制性消化生成了两个DNA片段。一个片段是由卡那霉素耐药基因以及在细菌中繁殖质粒所必需的其他序列构成。另一个片段是由作为MIDGE载体的一部分的序列构成:增强的CMV启动子、嵌合的内含子、IL-7的基因序列以及来自SV-40的聚腺苷酸化序列。在存在T4DNA连接酶和限制性内切酶Eco31I时,在37°C下过夜将5’-磷酸化的发夹寡脱氧核苷酸(TIB-MolBiol,Berlin,ODN1=来自WO 03/031469A2(Mologen等)的Seq.ID 5,无修饰碱基X,而ODN2=来自WO 03/031469A2(Mologen等)的Seq.ID 6)连接成MIDGE的成形片段。在本文中,引用在WO03/031469A2(Mologen等)中所包含的描述以及在其中所包含的寡脱氧核苷酸的序列。通过加热到70°C终止反应。用酶T7DNA聚合酶处理所形成的核酸混和物。用阴离子交换色谱法纯化MIDGE DNA并用异丙醇沉淀(见EP0 941 318 B1)。
类似地进行编码GM-CSF、B7.1/CD80和CD40L/CD154的载体的合成。
合成与NLS连接的MIDGE
对于NLS-MIDGE的合成,引用了在WO 03/031469 A2(Mologen等)中所包含的描述以及在其中所包含的寡脱氧核苷酸(ODN)的序列。首先将NLS肽(来自WO 03/031469 A2(Mologen等)的Seq.ID 4)与ODN结合。在这个反应中采用了在其发夹环上与氨基修饰的脱氧尿嘧啶(XT)连接的ODN1以及如在WO 03/031469 A2(Mologen等)中所述的未修饰的ODN2:
首先用硫代KMUS(5mM)的PBS溶液在室温下激活氨基修饰的寡核苷酸ODN 1(0.1mM)。在120分钟后,通过加入50mM三羟甲基氨基甲烷终止反应,并在乙醇沉淀(300mM NaOAc,pH 5.2,5.5mM MgCl2,70%乙醇)、离心和用70%乙醇洗涤之后得到了活化的ODN 1。然后将得到的ODN 1(0.1mM)溶解在PBS中,并容许其与NLS肽(0.2mM)在室温下反应1个小时。用凝胶电泳(3%)和乙啶染色控制反应。用HPLC纯化NLS结合的ODN1,并将其与如上所述的ODN 2一起用于合成MIDGE-NLS构建体)。
双链免疫调节寡脱氧核苷酸(d-SLIM)
双链免疫调节寡脱氧核苷酸是包括CG系列的分子。为了获得这些分子,用核苷酸环的方式将线性的寡脱氧核苷酸(ODN)共价地闭合,以保护它们避免外切核酸酶的降解。因此,得到了被称作为dSLIM“双链茎环免疫调节剂”的哑铃状分子(见图2)。免疫调节活性依据于通过非甲基化的CG序列与Toll样受体的结合而非特异地激活免疫***。dSLIM中的每个环都含有三个非甲基化的CG基序。
在B级实验室中,根据SOP流程以及随后的质量控制合成了ISS30型的双链免疫调节剂dSLIM。为此,用T4DNA连接酶连接单链的、发夹状的5’磷酸化的寡脱氧核苷酸(ODN)。在用T7DNA聚合酶消化起始材料以及用色谱法纯化之后,用乙醇/乙酸镁钠沉淀浓缩ODN,并将其溶解在PBS中。详细的流程可取自WO 01/07055。图2b显示了一种d-SLIM分子。
同种异基因肿瘤细胞系的表征
所采用的细胞系来源于一女性患者的原发肾细胞癌。从这些原代细胞中制备出细胞系,并将其作为活体培养物保藏于DSMZ(Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物菌种保藏中心)),保藏号为DSM ACC 2635。在筛选步骤之后,确定出作用为多种原代培养物的基本细胞库(master cell bank)的起始材料的细胞。细胞群必须表现出稳定的TTA的表达、恒定的和较好的细胞***率以及优选的均质生长的特征。也必须保证没有病毒或细菌的污染。
通过合乎标准的实验室测试肾细胞癌细胞系HI病毒、B型和C型病毒阴性。也表征了HLA型以及TAA的表达和细胞因子的释放。至此,已经建立了测定(例如)TNF-α、IL-6、GM-CSF和IL-7的不同的技术例如ELISA。此外,建立了细胞内FACS检测和实时PCR检测。在转染之后,控制细胞表达表面抗原、信号转导分子和报告基因。用下面的特异性表面标记物的免疫学数值表征细胞系:
EpCAM: 阳性
Her-2/neu: 阴性
Cytokeratin 7+8: 阳性
HLA-A1: 阳性
HLA-A2: 阳性
成纤维细胞: 阴性
肿瘤特异性抗原的确定:
PRAME: 阳性 SCP-1: 阳性
MAGE-4: 阴性 Fertilin-beta: 阴性
MAGE-3: 阴性 RAGE-1: 阳性
MAGE-1: 阴性 G250: 阳性
电穿孔
对于肿瘤细胞和对照细胞的核内的离体基因转移,优选的方法是电穿孔。用胰蛋白酶/EDTA溶液将肿瘤细胞与培养瓶表面分离,并在培养基(无FCS)或PBS中将其细胞浓度调整为每600μl 1-1.5x107细胞。将600μl体积的细胞悬浮液与5-10μg表达载体混和,将其转移到冷冻的电穿孔管(Eurogentec)内,并在Easyject电穿孔设备(EquiBio)中用300V电压1050微法拉电容进行电穿孔。
然后,将细胞转移到新鲜的培养基(5-20ml)中,并在细胞孵育箱(5%CO2、37°C、饱和湿度)中孵育24个小时。在此之后用四色流式细胞术测定表面分子(CD40L/CD154和B7.1/CD80)和细胞因子(GM-CSF和IL-7)。同样控制了细胞数目和活力。
在基因转移之后即刻,用10ml温的细胞悬浮液培养基覆盖肿瘤细胞,并通过小心移液将其转移到15ml离心管内。在300xG和4°C下沉淀细胞5分钟之后,将细胞重悬在培养基内。再次取出一部分进行无菌测定,进行细胞重建和活力的检测、FACS分析以及进行细胞因子表达的确定。如文献所述确定了转染效率(Foa et al.,1994,Nat.Immun.13:65-75)。
再次弄干转染细胞悬浮液,将其重悬在1.5ml冷冻培养基(80%FCS、10%DMSO、10%悬浮培养基)中,并将8x106到1.4x107个细胞保存在2ml的密封的冷冻管内。将冷冻管以每分钟下降1°C冷冻到-80°C,并保存在液氮中。
本发明疫苗的完成
在仔细地融化冷冻管之后,再次确定细胞计数,并取出一部分进行无菌测试。在仔细的和重复的洗涤细胞之后,将细胞沉淀重悬在Dulbecco磷酸缓冲液(DPBS,Camprex Kat.Nr.:17-512F)中。根据批次,加入500微克佐剂dSLIM。将所完成的疫苗转移到无内毒素的反应器内。以针头向每个注射器内抽吸750微克疫苗。
在施用之前,用伽马射线照射注射器5次,相应剂量为总剂量150Gray。
淋巴细胞制备
利用淋巴细胞分离剂(GIBCO,Karlsruhe)和密度梯度离心从经肝素处理的外周血中制备出外周血单个核细胞(PBMC)。用PBS洗涤细胞两次,并在存在超过20%FCS时将其在液氮内冻干,用于ELISPOT和细胞毒检测。
统计学分析
用Wilcoxons适用的配对和非配对检测分析统计学显著性。p值小于0.05被认为具有显著性。
Claims (14)
1.核酸分子,其编码白介素-7(IL-7)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD40L/CD154和B7.1/CD80。
2.编码白介素-7(IL-7)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD40L/CD154和B7.1/CD80的核酸分子的组合,其中每个所述核酸分子编码选自以下组中的至少一种共刺激因子:白介素-7(IL-7)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD40L/CD154和B7.1/CD80。
3.权利要求1的核酸分子或权利要求2的组合,其中所述核酸分子包括:
a)质粒;或
b)线性双链共价闭合表达盒,其仅由CMV启动子、内含子、编码基因序列和聚腺苷酸化序列构成,双链的两个末端均通过单链核苷酸残基短环而闭合。
4.权利要求1的核酸分子或权利要求2的组合与免疫调节寡脱氧核苷酸的组合。
5.权利要求4的组合,其中所述免疫调节寡脱氧核苷酸包括:
a)具有碱基序列N1N2CGN3N4的序列,其中N1N2是选自包括GT、GG、GA、AT或AA的组的元件,N3N4是选自包括CT或TT的组的元件,以及C是脱氧胞苷,G是脱氧鸟苷,A是脱氧腺苷和T是脱氧胸苷,和
b)具有部分互补的反向平行碱基序列的环状链脱氧核糖核酸并具有哑铃状的形状。
6.权利要求5的组合,其中所述具有碱基序列N1N2CGN3N4的免疫调节寡脱氧核苷酸的序列位于所述寡脱氧核苷酸的单链区,并包括40到200个核苷酸。
7.离体转染了权利要求1-6之一的核酸分子的人肿瘤细胞。
8.权利要求7的人肿瘤细胞,其中所述肿瘤细胞选自以下组中:结直肠癌、小细胞或非小细胞肺癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌和恶性黑色素瘤。
9.权利要求7的人肿瘤细胞,其中所述肿瘤细胞对应于保藏在DSMZ的保藏号为DSM ACC 2635的肾细胞癌细胞系。
10.权利要求1的核酸分子或权利要求2的组合在转染人肿瘤细胞中的用途。
11.权利要求10的用途,其中所述核酸分子包括:
a)质粒;或
b)线性双链共价闭合表达盒,其仅由CMV启动子、内含子、编码基因序列和聚腺苷酸化序列构成,双链的两个末端均通过单链核苷酸残基短环而闭合。
12.权利要求1的核酸分子或权利要求2的组合与免疫调节寡脱氧核苷酸的组合在转染人肿瘤细胞中的用途。
13.权利要求12中的用途,其中所述免疫调节寡脱氧核苷酸包括:
a)具有碱基序列N1N2CGN3N4的序列,其中N1N2是选自包括GT、GG、GA、AT或AA的组的元件,N3N4是选自包括CT或TT的组的元件,以及C是脱氧胞苷,G是脱氧鸟苷,A是脱氧腺苷和T是脱氧胸苷,和
b)具有部分互补的反向平行碱基序列的环状链脱氧核糖核酸并具有哑铃状的形状。
14.权利要求13的用途,其中所述具有碱基序列N1N2CGN3N4的免疫调节寡脱氧核苷酸的序列位于所述寡脱氧核苷酸的单链区,并包括40到200个核苷酸。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE0304299 | 2003-12-30 | ||
DEPCT/DE03/04299 | 2003-12-30 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2004800396643A Division CN1921882A (zh) | 2003-12-30 | 2004-04-20 | 同种异基因肿瘤治疗剂 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102994515A true CN102994515A (zh) | 2013-03-27 |
Family
ID=34716109
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2004800396643A Pending CN1921882A (zh) | 2003-12-30 | 2004-04-20 | 同种异基因肿瘤治疗剂 |
CN2012103165007A Pending CN102994515A (zh) | 2003-12-30 | 2004-04-20 | 同种异基因肿瘤治疗剂 |
CN2012103159773A Pending CN103173460A (zh) | 2003-12-30 | 2004-04-20 | 同种异基因肿瘤治疗剂 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2004800396643A Pending CN1921882A (zh) | 2003-12-30 | 2004-04-20 | 同种异基因肿瘤治疗剂 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2012103159773A Pending CN103173460A (zh) | 2003-12-30 | 2004-04-20 | 同种异基因肿瘤治疗剂 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7635468B2 (zh) |
EP (1) | EP1699480B1 (zh) |
JP (1) | JP4945247B2 (zh) |
CN (3) | CN1921882A (zh) |
AT (1) | ATE512668T1 (zh) |
BR (1) | BRPI0418157A (zh) |
DK (1) | DK1699480T3 (zh) |
ES (1) | ES2366694T3 (zh) |
PL (1) | PL1699480T3 (zh) |
PT (1) | PT1699480E (zh) |
RU (1) | RU2354694C2 (zh) |
WO (1) | WO2005063280A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111818940A (zh) * | 2018-01-05 | 2020-10-23 | 安德烈亚斯·罗尔夫-乔纳斯·尼尔森 | 用作疫苗的内源性肿瘤衍生的环状rna及其蛋白质 |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1699480B1 (de) * | 2003-12-30 | 2011-06-15 | Mologen AG | Allogenes tumortherapeutikum |
WO2006015560A1 (de) * | 2004-08-09 | 2006-02-16 | Mologen Ag | Immunmodulierendes mittel in verbindung mit chemotherapeutischen massnahmen |
CN101292159A (zh) * | 2005-09-08 | 2008-10-22 | 莫洛根股份公司 | 功能性体外免疫测定 |
PT2027266E (pt) * | 2006-05-11 | 2011-03-14 | Mologen Ag | Multímero para a imunoestimulação |
CN101199862B (zh) * | 2007-12-19 | 2011-07-06 | 北京大学第三医院 | B7-1、cd40l质粒混合物 |
GB2483462A (en) * | 2010-09-08 | 2012-03-14 | Mologen Ag | Use of a dumbbell-shaped DNA construct for the treatment of cancer through jet-injection administration |
GB2523187A (en) | 2014-02-18 | 2015-08-19 | Mologen Ag | Covalently closed non-coding immunomodulatory DNA construct |
AU2015243562B2 (en) * | 2014-04-07 | 2019-02-28 | Lokon Pharma Ab | New medical agents and uses thereof |
LT3240801T (lt) | 2014-12-31 | 2021-02-25 | Checkmate Pharmaceuticals, Inc. | Kombinuota navikų imunoterapija |
LU92821B1 (en) | 2015-09-09 | 2017-03-20 | Mologen Ag | Combination comprising immunostimulatory oligonucleotides |
GB2542425A (en) | 2015-09-21 | 2017-03-22 | Mologen Ag | Means for the treatment of HIV |
WO2017173334A1 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Checkmate Pharmaceuticals, Inc. | Fc receptor-mediated drug delivery |
US11185586B2 (en) | 2016-11-22 | 2021-11-30 | Alloplex Biotherapeutics, Inc. | Allogeneic tumor cell vaccine |
KR20190100200A (ko) | 2016-11-22 | 2019-08-28 | 알로플렉스 바이오테라퓨틱스 | 동종이형 종양 세포 백신 |
US10731128B2 (en) | 2016-11-22 | 2020-08-04 | Alloplex Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for in vitro activation and expansion of serial killer T cell populations and passive immunization of a cancer patient with tumor cell killing cells |
CN113412120A (zh) * | 2019-02-15 | 2021-09-17 | Rjan控股公司 | 用作治疗性疫苗的自体癌症肿瘤相关染色体外环状dna |
KR20220149505A (ko) | 2019-12-03 | 2022-11-08 | 누보젠 인코포레이티드 | 종양 세포 백신 |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5681562A (en) * | 1991-06-25 | 1997-10-28 | Sidney Kimmel Cancer Center | Lymphokine gene therapy of cancer |
JP3580371B2 (ja) * | 1991-10-04 | 2004-10-20 | ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ | サイトカインおよび抗原を用いた全身の免疫応答の調節 |
DE4416784A1 (de) | 1994-05-09 | 1995-11-30 | Soft Gene Gmbh | Methode zur Anreicherung von Zellen, die durch ballistischen Transfer modifiziert wurden |
DE4431401A1 (de) * | 1994-08-24 | 1996-02-29 | Max Delbrueck Centrum | Lebendvakzine gegen Tumorerkrankungen |
DE19648625A1 (de) | 1996-11-13 | 1998-05-14 | Soft Gene Gmbh | Mikroprojektil für das Einbringen von Substanzen in Zellen durch ballistischen Transfer |
DE19746173A1 (de) * | 1997-10-18 | 1999-04-22 | Boehringer Ingelheim Int | Tumorvakzine |
CN1100879C (zh) | 1998-02-23 | 2003-02-05 | 上海东方肝胆外科医院 | 多基因转染的细胞株及其构建方法 |
DE19832840C1 (de) | 1998-07-21 | 2000-06-08 | Kerkmann Tucek Aida | Mittel zur Immuntherapie von Tumorerkrankungen |
DE19935756A1 (de) | 1999-07-27 | 2001-02-08 | Mologen Forschungs Entwicklung | Kovalent geschlossenes Nukleinsäuremolekül zur Immunstimulation |
EP1355661A2 (de) * | 2001-01-31 | 2003-10-29 | Mologen Forschungs-, Entwicklungs- und Vertriebs GmbH | Tumorvakzine |
AU2002320079A1 (en) | 2001-06-11 | 2002-12-23 | Jeong-Im Sin | Vaccines, immunotherapeutics and methods of using the same |
DK1432439T3 (da) | 2001-10-02 | 2006-04-03 | Mologen Ag | Middel til forbedring af immunsvaret |
WO2003039592A2 (de) * | 2001-11-09 | 2003-05-15 | Medigene Aktiengesellschaft | Zelluläre impfstoffe mit adjuvanzien |
WO2003045428A2 (de) * | 2001-11-30 | 2003-06-05 | Medigene Aktiengesellschaft | Verwendung einer technisch veränderten zelle als vakzine zur behandlung einer tumorerkrankung |
DE10393455D2 (de) | 2002-07-19 | 2005-06-16 | Mologen Ag | DNA-Expressionskonstrukt zur multiplen Genexpression |
DE10234739A1 (de) | 2002-07-30 | 2004-02-12 | Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf | Splicing-Variante des humanen p53-Proteins und deren Verwendung zur Herstellung pharmazeutischer Präparate zur Behandlung von Tumorerkrankungen |
EP1699480B1 (de) * | 2003-12-30 | 2011-06-15 | Mologen AG | Allogenes tumortherapeutikum |
WO2006063301A1 (en) | 2004-12-10 | 2006-06-15 | Maxcyte, Inc. | Genetically modified tumor cells as cancer vaccines |
-
2004
- 2004-04-20 EP EP04728317A patent/EP1699480B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-20 ES ES04728317T patent/ES2366694T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-20 RU RU2006127428/13A patent/RU2354694C2/ru active
- 2004-04-20 JP JP2006545896A patent/JP4945247B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-04-20 CN CNA2004800396643A patent/CN1921882A/zh active Pending
- 2004-04-20 CN CN2012103165007A patent/CN102994515A/zh active Pending
- 2004-04-20 PT PT04728317T patent/PT1699480E/pt unknown
- 2004-04-20 DK DK04728317.1T patent/DK1699480T3/da active
- 2004-04-20 CN CN2012103159773A patent/CN103173460A/zh active Pending
- 2004-04-20 BR BRPI0418157-3A patent/BRPI0418157A/pt active Search and Examination
- 2004-04-20 AT AT04728317T patent/ATE512668T1/de active
- 2004-04-20 PL PL04728317T patent/PL1699480T3/pl unknown
- 2004-04-20 WO PCT/DE2004/000859 patent/WO2005063280A1/de active Application Filing
-
2006
- 2006-06-30 US US11/482,233 patent/US7635468B2/en active Active
-
2009
- 2009-11-09 US US12/614,985 patent/US9345754B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111818940A (zh) * | 2018-01-05 | 2020-10-23 | 安德烈亚斯·罗尔夫-乔纳斯·尼尔森 | 用作疫苗的内源性肿瘤衍生的环状rna及其蛋白质 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PT1699480E (pt) | 2011-08-30 |
RU2354694C2 (ru) | 2009-05-10 |
US9345754B2 (en) | 2016-05-24 |
JP4945247B2 (ja) | 2012-06-06 |
JP2007516985A (ja) | 2007-06-28 |
WO2005063280A1 (de) | 2005-07-14 |
US20100297189A1 (en) | 2010-11-25 |
CN103173460A (zh) | 2013-06-26 |
EP1699480A1 (de) | 2006-09-13 |
US7635468B2 (en) | 2009-12-22 |
RU2006127428A (ru) | 2008-02-10 |
PL1699480T3 (pl) | 2011-11-30 |
US20070160587A1 (en) | 2007-07-12 |
DK1699480T3 (da) | 2011-10-10 |
CN1921882A (zh) | 2007-02-28 |
ATE512668T1 (de) | 2011-07-15 |
ES2366694T3 (es) | 2011-10-24 |
BRPI0418157A (pt) | 2007-04-17 |
EP1699480B1 (de) | 2011-06-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7635468B2 (en) | Allogeneic tumor therapeutic agent, a vaccine using allogeneic tumor cells for the therapeutic treatment of tumor diseases, and a method for the making of such a vaccine, and transfected human tumor cells for use as a vaccine | |
US20210340543A1 (en) | Non-coding immunomodulatory dna construct | |
CN102597222B (zh) | 用于增殖抗原特异性t细胞的方法 | |
CN101918544B (zh) | 提高免疫反应性的方法 | |
RU2766457C2 (ru) | Способы и композиции для лечения рака с помощью антисмысла | |
KR101831713B1 (ko) | 공유결합적으로 폐쇄된 논-코딩 면역조절 dna 구조체 | |
CN102300990A (zh) | Tlr9的合成激动剂 | |
CN101161288B (zh) | 寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物及其在制备***的药物中的应用 | |
CN103370413A (zh) | Dna表达构建体 | |
CN113101363B (zh) | 一种环状rna疫苗及其应用 | |
ES2254527T3 (es) | Metodo para la preparacion de suspensiones de particulas submicronicas de agentes farmaceuticos. | |
Yamamoto et al. | Activation of NK cell (human and mouse) by immunostimulatory DNA sequence | |
Gorskaya et al. | Effect of immunization with polyvinylpyrrolidone on the counts of stromal precursor cells in the bone marrow and spleen of CBA and CBA/N mice and cytokine gene expression in primary cultures of these cells | |
CN108486120A (zh) | 一种新型CpG ODN序列及其在抗黑色素瘤上的应用 | |
CN107574149A (zh) | 一种树突状细胞的高效促成熟方法及其用途 | |
EP1355661A2 (de) | Tumorvakzine | |
JP2022512894A (ja) | アンチセンスを使用した乳癌治療用の方法および組成物 | |
Issabekova et al. | Comparable Analysis of Mature Antigen-Loaded Dendritic Cells Preparation Methods for Cytokine-induced Killer Cells Activation In Vitro | |
Tarhini et al. | Early development of the toll-like receptor 9 agonist, PF-3512676, for the treatment of patients with advanced cancers | |
MXPA06007495A (en) | Allogeneic tumor therapeutic agent | |
CN101637608A (zh) | 一种结核菌hsp和肿瘤裂解物的混合物 | |
Hasan | Development of novel DNA vaccine and immunotherapeutic approaches |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130327 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |