CN102988341A - 一种组织特异性蛋白酶体抑制剂及其应用 - Google Patents

一种组织特异性蛋白酶体抑制剂及其应用 Download PDF

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本发明公开了一种组织特异性蛋白酶体抑制剂，该组织特异性蛋白酶体抑制剂为藤黄酸和/或其代谢产物MT1。还公开了上述组织特异性蛋白酶体抑制剂在制备具有抑制肿瘤蛋白酶体的药物中的用途。

Description

一种组织特异性蛋白酶体抑制剂及其应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种蛋白酶体抑制剂及其应用。
背景技术
真核细胞中存在两种不同的蛋白质降解途径，一种是自噬-溶酶体途径，主要降解包括应激产生蛋白，膜相关蛋白和经包吞进入细胞的外源性蛋白；一种是泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome system,UPS)，泛素-蛋白酶体途径是ATP依赖的，主要降解细胞内正常和不正常的蛋白质，包括一系列重要的生命活动调节蛋白(参见Hershko A,等，Annu RevBiochem.1998，67，425-479；Mizushima等，Nature.2008,451,1069-1075)。泛素-蛋白酶体***降解蛋白质主要包括两个步骤：靶蛋白被标记上多聚泛素链和26S蛋白酶体降解标记上泛素链的靶蛋白。26S蛋白酶体（2.5MD）是一种依赖ATP的蛋白降解复合体，它由2个环状的19S调节亚基（890KD）和1个圆筒状的20S催化亚基组成。除此之外，20S蛋白酶体还可以通过不依赖于ATP和泛素标记的方式降解一些特定的蛋白质，比如鸟氨酸脱羧酶和氧化的蛋白质。
泛素-蛋白酶体***(ubiquitin-proteasome system，UPS)介导了细胞内多种蛋白的降解，从而参与细胞生命过程的调节。由于该***的发现及其重要性，以色列及美国的三位科学家共同分享了2004年度诺贝尔化学奖。蛋白酶体本身已经成为抗肿瘤药物、组织缺血-再灌注损伤、免疫调节、糖尿病治疗的重要靶点。经美国FDA批准蛋白酶体抑制剂PS-341已经进入II期临床应用于肿瘤的治疗，并取得了比较理想的治疗效果。寻找蛋白酶体抑制剂对于开发我国中医药资源具有重要的应用前景。
藤黄酸（Gambogic acid，GA）是从藤黄科植物藤黄分离出来的一种天然产物，藤黄在中国传统医学中已经被用于治疗多种人类疾病，包括消化不良、炎症、溃疡等，藤黄酸的化学式是C38H44O8，分子量为628.75。
藤黄酸经过大鼠肝脏微粒体代谢能够产生I级代谢产物MT1和MT2(参见Liu等，Acta Pharmacol Sin.2006，27,1253-1258),但迄今尚未见藤黄酸和/或其代谢产物能够作为蛋白酶体抑制剂应用的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种组织特异性蛋白酶体抑制剂。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述组织特异性蛋白酶体抑制剂在制备具有抑制肿瘤蛋白酶体的药物中的用途。
本发明的第一个技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种组织特异性蛋白酶体抑制剂，该组织特异性蛋白酶体抑制剂为藤黄酸和/或其代谢产物MT1。
藤黄酸的化学结构式为：
Figure BDA00002129947800021
藤黄酸代谢产物MT1化学结构式为：
Figure BDA00002129947800022
已有文献报道藤黄酸的细胞代谢产物包括MT1和MT2(参见Liu等，ActaPharmacol Sin.2006，27,1253-1258)，但关于其作用研究较少，发明人在实验中发现，藤黄酸能够通过细胞内细胞色素P4502E1(即CYP2E1)代谢产生其代谢物MT1对蛋白酶体活性具有较强的抑制作用，这种抑制作用能够被CYP2E1的抑制剂二乙基二硫碳酸盐（diethyldithiocarbonate，DDC）所逆转，同时这种抑制作用也能够通过CYP2E1的特异性siRNA敲除CYP2E1的表达后逆转，表明藤黄酸能够被组织细胞代谢后产生蛋白酶体抑制作用，并且这种作用与组织细胞CYP2E1的表达量密切相关。
本发明的第二个技术问题是通过如下技术方案来实现的：上述组织特异性蛋白酶体抑制剂在制备具有抑制肿瘤蛋白酶体的药物中的用途。
所述肿瘤包括骨髓瘤、乳腺癌、胃癌、肝癌、头颈部癌、肺癌和白血病。
尽管发现藤黄酸具有很强的抗肿瘤活性，能够诱导肿瘤细胞和病人白血病细胞凋亡，明显延长P388腹水瘤小鼠的生存时间，通过大量实验发现，藤黄酸及其代谢产物MT1对蛋白酶体具有抑制作用，而蛋白酶体本身已经成为抗肿瘤药物、组织缺血-再灌注损伤、免疫调节、糖尿病治疗的重要靶点，因此藤黄酸及其代谢产物MT1可在制备具有抑制肿瘤蛋白酶体的药物中应用。
本发明具有如下优点：本发明中的藤黄酸及其代谢产物能够作为蛋白酶体抑制剂，能够在代谢后组织特异性的抑制蛋白酶体活性，抑制蛋白酶体底物的降解，在制备各种因蛋白酶体活性异常引起的疾病治疗中具有广泛的应用。
附图说明
图1是实施例1中藤黄酸和其代谢产物MT1对纯化20S蛋白酶体的抑制作用；
图2是实施例2中计算机模拟模型藤黄酸和其代谢产物MT1、MT2对蛋白酶体的空间对接；
图3是实施例3中CYP2E1抑制剂DDC对藤黄酸抑制蛋白酶体活性的影响；
图4是实施例4中CYP2E1特异性siRNA敲除CYP2E1后对藤黄酸抑制蛋白酶体活性的影响；
图5是实施例5中藤黄酸对蛋白酶体外源性特异性底物GFPu和泛素化蛋白的影响；
图6是实施例6中CYP2E1抑制剂DDC对藤黄酸诱导P388白血病细胞死亡的影响；
图7是实施例7中CYP2E1抑制剂DDC对藤黄酸诱导P388白血病细胞凋亡相关蛋白的影响；
图8是实施例8中藤黄酸对临床病人人白血病细胞的增殖抑制作用；
图9是实施例9中藤黄酸对临床病人人白血病细胞死亡的影响；
图10是实施例10中藤黄酸对P388腹水瘤小鼠生存时间的影响；
图11是实施例11藤黄酸对P388腹水瘤蛋白酶体底物的影响；
图12是实施例12中CYP2E1抑制剂DDC对藤黄酸诱导多发性骨髓瘤细胞H929，U266细胞增殖抑制的影响；
图13是实施例13中CYP2E1抑制剂DDC对藤黄酸诱导多发性骨髓瘤细胞H929凋亡相关蛋白的影响。
具体实施方式
下面通过以下具体实施方式对本发明作进一步阐述，但是本发明的内容完全不局限于此。
实施例1藤黄酸及其代谢产物MT1对纯化20S蛋白酶体的抑制作用
利用纯化20S蛋白酶体(购自美国bostonbiochem公司)，藤黄酸（(购自美国biomol公司)，藤黄酸代谢产物MT1由本实验室合成(合成方法参见Cai等,InventPatent WO2000US02332 20000201)，实验前先配好反应缓冲液Tris-Hcl(25mmol/L，PH7.4)，实验在96孔板上进行，每孔加入20μL蛋白液体/10ng 20S纯化蛋白酶体，然后加入各浓度（0.01,0.05,0.1,0.5,1,2.5μM）的藤黄酸和MT1的储存液2μL，每个浓度设3个复孔，最后每孔分别加入180μLTris-Hcl(25mmol/L，PH7.4)（含2μL蛋白酶体chymotrysin-like活性亚基底物SUC-LLVY-AMC），以上步骤均在冰上操作；37℃，反应90分钟，最后用荧光分光光度计测定荧光值，激发波长350nm，发射波长438nm。结果发现藤黄酸对纯化20S蛋白酶体无明显抑制作用，而藤黄酸代谢产物MT1对纯化20S蛋白酶体产生明显的浓度依赖抑制作用；结果参见图1。从图1说明藤黄酸是一种间接的蛋白酶体抑制剂，通过组织细胞代谢产生的代谢产物MT1发挥蛋白酶体抑制作用。
实施例2计算机模拟模型藤黄酸和其代谢产物MT1、MT2对蛋白酶体的空间对接
利用SYBYL 6.9软件对藤黄酸和其代谢产物MT1、MT2作用于蛋白酶体的位点进行分析发现只有MT1C9及C10是活性部位，对β5亚单位的苏氨酸N-端羟基群亲核攻击有高度的敏感性。用电脑模拟其与β5亚单位结合得出的构像图，其中MT1C9及C10与β5亚单位结合形成共价键的距离分别为
Figure BDA00002129947800041
和
Figure BDA00002129947800042
在
Figure BDA00002129947800043
的距离范围内，是这两者结合的最有可能的构像图（如图5）。结果参见图2。从图2说明在空间结构上只有MT1具有与蛋白酶体β5亚单位结合的可能性。
实施例3CYP2E1抑制剂DDC对藤黄酸抑制蛋白酶体活性的影响
用不同浓度（0.25、0.5、0.75、1、1.5、2μM，其中DM代表溶剂对照DMSO）的藤黄酸和CYP2E1抑制剂DDC处理白血病K562细胞，在处理细胞6小时后，加入细胞蛋白酶体chymotrysin-like活性底物（购自美国Promega公司），作用15分钟后在化学发光酶标仪检测化学发光值。结果发现，CYP2E1抑制剂DDC能够显著逆转藤黄酸对细胞蛋白酶体活性的抑制，结果参见图3。从图3说明藤黄酸可能是通过CYP2E1代谢产生MT1发挥蛋白酶体抑制作用。
实施例4CYP2E1特异性siRNA敲除CYP2E1后对藤黄酸抑制蛋白酶体活性的影响
用CYP2E1特异性siRNA转染处理肝癌HepG2细胞(其中CTR代表阴性对照siRNA)，在处理细胞72小时后加入不同浓度的藤黄酸，作用6小时后，加入细胞蛋白酶体chymotrysin-like活性底物（购自美国Promega公司），作用15分钟后在化学发光酶标仪检测化学发光值。结果发现，抑制CYP2E1的表达能够明显逆转藤黄酸对细胞蛋白酶体活性的抑制，结果参见图4，从图4进一步说明藤黄酸是通过CYP2E1代谢产生MT1发挥蛋白酶体抑制作用。
实施例5藤黄酸对蛋白酶体外源性特异性底物GFPu和泛素化蛋白的影响
GFPu-SY5Y稳定转染细胞系由本实验室建立（参见Huang等，CellResearch.2010,20,1372-1385），用不同浓度的藤黄酸处理细胞，在处理细胞9小时后，收集细胞，提取总蛋白，然后用GFP，ubiquitin抗体（购自美国Santa Cruz公司）进行Western Blot免疫印迹。结果发现，藤黄酸可以明显引起GFP和泛素化蛋白的聚集，且呈明显的浓度依赖关系，结果参见图5。
实施例6CYP2E1抑制剂DDC对藤黄酸诱导P388白血病细胞死亡的影响
用不同浓度的藤黄酸和CYP2E1抑制剂DDC（100μM）处理白血病P388细胞，在处理细胞6小时后，收集细胞，PBS清洗，加入Annexin V-FITC和PI，上机分析。结果发现，DDC可以明显逆转藤黄酸诱导的P388白血病细胞死亡，结果参见图6。
实施例7CYP2E1抑制剂DDC对藤黄酸诱导P388白血病细胞凋亡相关蛋白的影响
用不同浓度的藤黄酸和CYP2E1抑制剂DDC（100μM）处理白血病P388细胞，在处理细胞6小时后，收集细胞，PBS清洗，提取总蛋白，然后用凋亡相关PARP，caspase-3,caspase-8,caspase-9抗体（购自美国Cell Signal公司）进行WesternBlot免疫印迹。结果发现DDC可以明显逆转藤黄酸诱导P388白血病细胞凋亡相关蛋白的变化。结果参见图7。
实施例8藤黄酸对临床病人白血病细胞的增殖抑制作用
正常人和白血病病人在知情同意的情况下抽取血液，并用淋巴细胞分离液分离出单核细胞，用不同浓度的藤黄酸和阳性对照硼替佐米处理24小时后，加入MTS溶液(购自美国Promega公司，CellTiter
Figure BDA00002129947800061
AQ ueous One Solution CellProliferation Assay)，再孵育3小时，然后用酶标仪测定其在490nm的吸光度。结果发现，藤黄酸可以明显的抑制白血病人单核细胞的增殖，且呈明显的浓度依赖关系，结果参见图8。
实施例9藤黄酸对临床病人白血病细胞死亡的影响
正常人和白血病病人在知情同意的情况下抽取血液，并用淋巴细胞分离液分离出单核细胞，用不同浓度的藤黄酸和阳性对照硼替佐米处理24小时后，收集细胞，PBS清洗，加入Annexin V-FITC和PI，上机分析。结果发现，藤黄酸可以诱导白血病人单核细胞死亡，且呈明显的浓度依赖关系，结果参见图9。
实施例10藤黄酸对P388腹水瘤小鼠生存时间的影响
1000rpm，5min离心收集培养的P388白血病细胞，调整细胞浓度至10×106/mL，重悬细胞于无血清无菌RPMI1640培养基。将细胞悬液接种于昆明小鼠（18-22g，购自广东省动物中心）腹腔，每只小鼠接种0.2mL。接种24小时后，将小鼠随机分为两组，每组10只，一组为溶剂对照组，一组为藤黄酸1.5mg/kg组，并开始腹腔注射给药，持续给药7天，第8天开始停止给药，观察小鼠生存时间。结果发现溶剂对照组小鼠最长可以活至23天，而藤黄酸组出来第20天和第23天死亡一只小鼠，剩余小鼠都存活至60天，结果参见图10。
实施例11藤黄酸对P388腹水瘤蛋白酶体底物的影响
1000rpm，5min离心收集培养的P388白血病细胞，调整细胞浓度至10×106/mL，重悬细胞于无血清无菌RPMI1640培养基。将细胞悬液接种于昆明小鼠（18-22g，购自广东省动物中心）腹腔，每只小鼠接种0.2mL。接种5天后，藤黄酸2mg/kg腹腔注射给药，于0、1、3、5、7、11小时处死小鼠抽取腹水，收集细胞，PBS清洗，提取总蛋白，然后用ubiquitin，IkBα,Bax，P21，P27，P53，GAPDH抗体（购自美国Santa Cruz公司）进行Western Blot免疫印迹。结果发现藤黄酸可以引起腹水瘤细胞蛋白酶体底物泛素化蛋白，IkBα,Bax，P21，P27，P53明显的聚集，结果参见图11。
实施例12CYP2E1抑制剂DDC对藤黄酸诱导多发性骨髓瘤细胞H929、U266细胞增殖抑制的影响
用不同浓度的藤黄酸和CYP2E1抑制剂DDC（50μM）处理多发性骨髓瘤细胞H929，U266，在处理细胞24小时后，加入MTS溶液(购自美国Promega公司，CellTiter
Figure BDA00002129947800071
AQ ueous One Solution Cell Proliferation Assay)，再孵育3小时，然后用酶标仪测定其在490nm的吸光度。结果发现，藤黄酸可以明显的浓度依赖抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖，但藤黄酸的这一作用可以被CYP2E1抑制剂DDC明显的逆转，结果参见图12。从以上结果说明藤黄酸具有抗多发性骨髓瘤的作用，但这一作用能够被CYP2E1抑制剂DDC逆转。
实施例13CYP2E1抑制剂DDC对藤黄酸诱导多发性骨髓瘤细胞H929凋亡相关蛋白和泛素化蛋白的影响
用不同浓度的藤黄酸和CYP2E1抑制剂DDC（50μM）处理多发性骨髓瘤H929细胞，在处理细胞6小时后，收集细胞，PBS清洗，提取总蛋白，然后用凋亡相关PARP，caspase-3,caspase-8,caspase-9抗体（购自美国Cell Signal公司）和ubquitin抗体（购自美国Santa cruz公司）进行Western Blot免疫印迹。结果发现DDC可以明显逆转藤黄酸诱导多发性骨髓瘤H929细胞凋亡相关蛋白的变化，并且能够明显逆转泛素化蛋白的聚集。结果参见图13。从以上结果说明CYP2E1抑制剂DDC可以逆转藤黄酸诱导的蛋白酶体抑制和凋亡相关蛋白的变化。

Claims (3)

1.一种组织特异性蛋白酶体抑制剂，其特征是：该组织特异性蛋白酶体抑制剂为藤黄酸和/或其代谢产物MT1。
2.权利要求1所述的组织特异性蛋白酶体抑制剂在制备具有抑制肿瘤蛋白酶体的药物中的用途。
3.根据权利要求2所述的蛋白酶体抑制剂在制备具有抑制肿瘤的蛋白酶体的药物中的用途，其特征是：所述肿瘤包括骨髓瘤、乳腺癌、胃癌、肝癌、头颈部癌、肺癌和白血病。
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