CN102978295A - 病原微生物核酸无扩增检测与分型方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种病原微生物核酸无扩增检测和分型方法以及相关的试剂盒，本发明以多探针并结合荧光量子点层层组装技术，实现病原微生物核酸无扩增检测和分型。本发明的方法对于低浓度核酸无需扩增，可以直接检测；多探针保证了信号放大过程中容易出现的假阳性问题，提高了检测准确性，该技术可以实现病原微生物拷贝数的实时检测与同步基因分型，速度快，成本低廉。

Description

病原微生物核酸无扩增检测与分型方法

技术领域

本发明属于医药生物领域，尤其涉及一种病原微生物核酸无扩增直接检测与分型方法及试剂盒。

背景技术

感染性疾病是严重危害人类健康的最重要疾病之一。据国家疾控中心(CDC)统计：2011年我国法定传染病发病632万例，死亡1.5万人。其中病毒性肝炎、肺结核和梅毒的发病率位居前三位，占乙类传染病发病总数的85.41％。且乙型肝炎、丙型肝炎等血源性传染病的发病率呈逐年上升趋势。上述数据表明，乙型病毒性肝炎仍占据我国感染性疾病发病率首位，其发病人数亦占我国肝炎发病总人数的70％以上。大量临床资料和研究表明，乙型病毒性肝炎患者的血清学转归和预后与所感染乙型肝炎病毒(HBV)的基因型及拷贝数密切相关。因此，建立快速、准确的HBV检测与分型方法对于乙型病毒性肝炎的早期诊断、疗效监测、预后判断和个体化治疗具有重要临床意义。

对于HBV感染的检测，目前的实验室方法主要分为直接检测和间接检测两大类。其中间接检测以生物化学方法和免疫学为主。生物化学方法通过检测多项转氨酶(ALT，AST，γ-GGT等)的升高来间接判断病毒感染，其灵敏度较高，但易受其它原因导致的肝损伤影响，故特异性差。免疫法包括早期的ELISA和逐渐发展形成的免疫散射比浊、化学发光和时间分辨荧光检测等技术。其原理是通过同时检测多项HBV特征性抗原(HBsAg、HBcAg、HBeAg)和患者机体产生的相应抗体(HBsAb、HBcAb)来进行综合判定。该方法简便易行，在临床上广为应用。但是免疫学方法无法检出处于“窗口期”的HBV感染，易导致假阴性。最重要的是，所有间接检测方法都无法对HBV进行基因型分型，因而无法指导个体化临床用药。

直接检测法则检测患者样本中的HBV的数量和基因亚型，具有早期、实时、动态监测HBV拷贝数变化的特点，在早期诊断、疗效判断、个体治疗等方面具有无可比拟的优势。因病毒在体外极难培养，因此目前病毒直接检测技术均通过检测HBV核酸实现。然而，由于早期HBV感染患者体内的HBV拷贝数较低(通常10⁴-10⁶/ml)，不足以被核酸杂交等常规分子生物学方法直接检出。因此进行靶分子信号放大是实现HBV DNA高分辨检测与分型的前提。目前的信号放大策略主要包括两类：DNA模板扩增技术(前放大)和检测信号放大技术(后放大)。其中DNA模板扩增技术以PCR为基础，通过体外扩增核酸分子模板至10⁹倍，以实现信号放大。PCR技术相继衍生出一系列变温核酸扩增、检测技术，如巣式PCR，荧光定量PCR和多重PCR等。这些基于PCR的扩增技术用于HBV检测与分型尚存在以下不足：(1)对扩增条件要求极为严格，极易产生假阳性或者假阴性。(2)多基因型同步扩增时常导致高浓度模板对低浓度模板的竞争抑制，导致低浓度样本的假阴性结果。(3)PCR相关技术核心知识产权的壁垒导致了其相关试剂和设备价格昂贵，增加了医疗成本和患者负担。近年来，相继发展出一系列等温扩增技术，如链置换扩增(SDA)，环介导等温扩增(LAMP)，滚环扩增(RCA)等技术，部分降低了医疗成本和解决了上述低浓度模板扩增受抑制等不足。然而这些技术仍然无法解决同步进行HBV高分辨检测和基因分型的难题。

相对于DNA模板扩增技术而言，检测信号放大(后放大)技术仅对已检测到的低信号进行放大，可消除因不同浓度模板扩增导致的扩增性抑制。由于检测信号放大技术是与检测原理紧密联系的，因此每个检测技术平台都有自己最适合的信号放大技术。如：基于石英晶体微天平(QCM)传感器的质量放大，基于表面等离子体(SPR)传感器的折射光角度放大，基于电化学传感器的酶学放大，基于荧光检测的纳米传感器的荧光增强等。在这些检测平台中，均需使用生物传感技术将低于检测限的微弱信号转化为可以识别的物理或者化学信号。以前使用最多的是酶化学传感器，其原理是通过酶的催化或者与底物的结合进行信号放大。近年来，纳米材料合成、表面修饰技术的飞速发展为信号放大技术的研发提供了广阔空间。发明人前期在纳米材料信号放大方面进行了大量研究，成功将纳米金颗粒用于QCM传感器的信号放大，实现了血液中低浓度金黄色葡萄球菌的检测；同时也实现了HCR反应的无酶荧光信号放大。然而，试验中我们发现，传统荧光染料极易被漂白，用于临床样本检测难度较大。

然而，HBV的A-H亚型间的序列同源性非常高，利用核酸杂交技术对其进行分型需要制备特异性极高的探针。因此目前存在的HBV分型技术则采用PCR首先将各亚型归类，然后用多组DNA探针分别检测不同组别的基因型以提高检测特异性。相比DNA分子而言，肽核酸(PNA)分子因其独特的碳链骨架结构，其与DNA单链结合的亲和常数较普通DNA-DNA的结合常数高10³倍，因此短链PNA探针(14-20bp)对于单碱基突变具有极强的识别能力，PNA探针的这种高特异识别能力为HBV病毒的基因分型提供了新的突破口。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种病原微生物核酸无扩增检测和分型方法。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明涉及一种病原微生物核酸无扩增检测和分型方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)根据待测样品的核酸序列合成DNA和/或PNA探针1，2，3，所述的探针1，2，3能够分别与待测样品杂交并且互不重叠；

(2)分别将探针1，2，3与磁性纳米颗粒和两种荧光量子点耦联，所述的荧光量子点的荧光可以相同，也可以不相同。

(3)合成生物素连接的桥连DNA合/或PNA序列1，2以及互补的序列1’，2’，将序列1’和2’与步骤(2)中的两种荧光量子点分别耦联；

(4)合成两种生物素修饰的荧光颜色不同的两种荧光量子点，这两种荧光量子点可以与步骤(2)中的荧光量子点相同，也可以不同；

(5)选择步骤(2)中的探针修饰的磁性纳米颗粒和其中一种探针修饰的荧光量子点，将其与待测样品以及相应的桥连序列进行杂交并进行磁性分离；然后通过重复加入Sa(中文全称)-洗涤-加入步骤(4)中的其中一种生物素修饰的荧光量子点-洗涤的步骤进行层层组装，然后通过磁性分离得到待测样品的富集物，任选地，对富集物的样品进行荧光强度测定；

(6)选择另外一种探针修饰的荧光量子点，将其与步骤(5)获得的富集物以及相应的桥连序列进行杂交并进行磁性分离；然后通过重复加入Sa(中文全称)-洗涤-加入步骤(4)中的另外一种生物素修饰的荧光量子点-洗涤的步骤进行层层组装，然后通过磁性分离得到待测样品的第二富集物，任选地，对第二富集物的样品运用荧光光谱成像技术或者流式细胞仪技术进行检测。

本发明另一方面还涉及种病原微生物核酸无扩增检测和分型的试剂盒，其特征在于包括：三种DNA和/或PNA探针耦联的磁性纳米颗粒和两种荧光量子点，所述的三种探针能够分别与待测样品杂交并且互不重叠，荧光量子点的荧光可以相同，也可以不相同；生物素修饰的桥连DNA和/或PNA，桥连DNA和/或PNA的互补序列耦联的两种荧光量子点；生物素修饰的荧光颜色不同的两种荧光量子点，这两种荧光量子点可以与上述荧光量子点的荧光相同，也可以不同；SA以及缓冲溶液。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于待测样品为HBV核酸。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的探针为PNA，所述的荧光量子点中的一个或多个或全部为CdSe/ZnS量子点。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的磁性纳米颗粒是

纳米颗粒。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的三种探针为PNA，其中两个种属特异性探针序列为下表探针1或者探针2的序列，所述的生物素修饰的桥连DNA序列如下表所示。

另外一个用于分型的序列选自以下三条探针之一：

探针名称	序列
		P3b	5’-NH2-(CH2)6-TGTGTTTACTGAGTG-3’
P3c	5’-NH2-(CH2)6-AACGCCCACATGATCT-3’
		P3d	5’-NH2-(CH2)6-CGGTACGAGATCTTCTA-3’

在本发明的一个优选实施方式中，所述的方法是非诊断目的的。

本发明的方法对于低浓度核酸无需扩增，可以直接检测；多探针保证了信号放大过程中容易出现的假阳性问题，提高了检测准确性，该技术可以实现病原微生物拷贝数的实时检测与同步基因分型，速度快，成本低廉。

附图说明

图1：检测原理示意图；

图2：合成的CdSe/ZnS量子点SEM图片；

图3：合成的超顺磁四氧化三铁SEM图片；

图4：量子点的DLS图；

图5：磁性微球的DLS图；

图6：含有生物素配体的聚合物合成示意图；

图7：量子点合成、修饰示意图；

图8：不同摩尔比例DNA探针与量子点偶联电泳图；

图9：不同摩尔比例DNA探针与量子点偶联后荧光光谱图片；

图10：不同QD自组装层数与荧光信号放大的关系；

图11：不同浓度HBV病毒检测荧光光谱结果；

图12：不同浓度HBV检测的标准曲线；

图13：不同错配序列杂交的检测结果比较(特异性)；

图14：同步检测与分型的检测结果(检测为540nmQD，分型为620nmQD)。

具体实施方式

(1).HBV鉴定探针的制备

HBV探针主要采用oligo6.0软件结合primer Premier6.0软件进行DNA探针的设计，对于PNA探针的设计则通过上述软件查找到多对候补序列区域后(将候补区域扩大至1倍以上)，然后再用oligonucleotide软件验证出多条候补序列(1∶10比例)，然后将候补序列提交至PNA合成公司(Bio-Synthesis)进行序列验证，最后合成的PNA探针序列长度在14-20bp之间。PNA探针的验证和合成均由Bio-Synthesis公司完成。桥连DNA探针的设计原则为在保证短序列的前提下实现高Tm值，且不能有回环结构。

探针名称	探针序列
		PNA种属特异性探针1	5’-NH2-(CH2)6-AGGCACAGCTTGGAGGC-3’

PNA种属特异性探针2	5’-NH2-(CH2)6-GTGATGTGCTGGGTGTGTCG--3’
		桥连DNA序列	5′-biotin-GGGCAGCTGGGGCGGGCGGG-NH2-3′

(2).多色量子点纳米微球的合成与表征

CdSe/ZnS量子点的合成：无氧条件下，将156mgNaBH₄溶于2mL超纯水中。超声混匀后加入157.8mgSe粉并于冰浴中反应生成无色NaHSe溶液。反应方程为：4NaBH₄+2Se+7H₂O＝2NaHSe+Ha₂B₄O₇↓+14H₂↑

精确称取CdCl₂·25H₂O228.5mg溶于100ml双蒸水并将溶液倒入三颈烧瓶。通氮气30min后向烧瓶中滴加262μl 3-巯基丙酸，然后用NaOH调节pH值至11.0。烧瓶中持续通入氮气30-40min以除去其中O₂，同时向烧杯中缓慢加入制备的NaHSe溶液1ml，用磁力搅拌器剧烈搅拌后密封反应容器，于95℃水浴中回流1h即得CdSe量子点溶液。将上述所合成CdSe溶液降至室温，向其中通入氮气30min并伴随剧烈磁力搅拌，缓慢滴加88mgZn(Ac)₂·2H₂O和96mgNa₂S·9H₂O配成的溶液10mL，于95℃水浴2h，得CdSe/ZnS量子点溶液。按照上述方法，通过控制回流时间分别制得多种不同波长量子点(现初步拟定为525nm、550nm、565nm、605nm、620nm)。

量子点的表征：运用荧光光度计和双光束紫外可见分光光度计分别检测不同发光波长的CdSe/ZnS量子点的荧光发射光谱和可见吸收光谱。利用激光光散射仪对纳米粒子分散液的纳米粒径、粒径分布及表面Zeta电荷值进行测定。将制备的纳米分散液滴在镀有碳膜的铜网上，室温干燥后用透射电镜观察QDs纳米粒子的径粒分布。运用电子衍射图判断CdSe/ZnS量子点的衍射环的情况。根据上述结果分别优化量子点合成的反应条件(PH值、摩尔比、回流时间等)。

量子点的表面修饰与表征：量子点的表面生物素修饰主要根据HediMattoussi等报道的方法进行，其原理主要是首先合成一种表面修饰有生物素的聚合物，该聚合物包裹的量子点应该具有高度液相分散性的体积小、可控偶联位点的优点。具体的方法为首先合成(1)Diazide功能化的四甘醇，合成好的产品(1)经过柱进行纯化，然后加入250ml0.7M磷酸，110mmol三苯基膦(PPh₃)反应16h，经清洗、过滤、萃取并干燥后得到单胺修饰的四甘醇。然后加入55.8mmol硫辛酸、10.3mmol4-二甲氨基CH₂Cl₂后降温至零度，然后缓慢加入53.8mol DCC反应16h后过滤、过柱纯化得到TA-TBG-N3复合物，然后加入150ml THF，8lmmol PPh₃反应20小时，分离纯化后得到氨基末端标记的TA-TEG，然后加入羟基化的生物素，在DMF中反应16小时，分离纯化后得到TA-TEG-biotin。再加入18.5mmol NaBH₄并在75％的乙醇中反应4h，经氯仿萃取并过柱纯化后得到DHLA-TEG-biotin。然后加入TOP/TOPO表面覆盖的CdSe/ZnS溶液，加热至60-80℃反应6-12小时。经正己烷、乙醇、氯仿混合物(比例11∶10∶1)沉淀后再次分散在水中。最后得到生物素修饰的CdSe/ZnS量子点溶液(CdSe/ZnS-biotin)。

表面修饰后的量子点采用TEM、SEM电镜观察形成的微球的直径(10-20nm)，运用DLS观察其在双蒸水和PBS buffer中的水合直径。运用XRD判断其晶体结构。运用可见分光度计检测修饰前后量子点的吸收光谱和荧光发射光谱的变化。荧光光度计检测不同发光波长的量子点的荧光发射光谱，以及它们共同装入微球后的荧光光谱，比较其光谱变化(如半峰宽、红移、蓝移以及荧光强度的变化)。通过量子点装入前后的半峰宽恒定来证明QDs之间没有聚集。通过微球荧光光谱研究可以进一步确认多色QDs之间有无发生能量共振转移(FRET)，如果有发生，可以通过增大合成量子点的直径来解决。因为FRET要求受体与供体间距离＜10nm，故增加量子点的直径可有效防止不同量子点间FRET的发生。

(3).量子点与双探针的生物偶联

为实现CdSe/ZnS量子点与桥连DNA和PNA的生物偶联，需对油溶性CdSe/ZnS量子点进行水溶性转换。其方法为取2ml油溶性量子点，加入二巯基丙酸，在甲苯中搅拌反应12小时，并经20000rpm离心30min后弃上清，沉淀用甲苯清洗3次后离心、然后采用3.5kD滤膜进行透析12小时，烘干后得到羧基化CdSe/ZnS(CdSe/ZnS-COOH)并溶于1X PBS(pH7.4)中保存待用。其荧光性能用可见光分光光度计进行检测。然后取2mmolCdSe/ZnS-COOH加入100mmol 5’端氨基修饰的桥连DNA探针和等摩尔的5’端氨基修饰的PNA种属特异性探针(P2)，在EDC和NHS的存在下进行缩合反应。反应结束后，然后20000rpm离心30min后弃上清，沉淀用甲苯清洗3次后得到桥连DNA标记的CdSe/ZnS量子点。再次采用可见光分光光度计检测DNA偶联前后的荧光性能的变化，并且用琼脂糖凝胶电泳检测是否偶联成功。

(4).量子点标记探针前后荧光光谱变化研究：

分别于量子点标记探针前后运用荧光光度计和双光束紫外可见分光光度计检测CdSe/ZnS量子点的荧光发射光谱和可见吸收光谱，观察量子点标记探针后发生的蓝移或者红移程度。进一步通过改变CdSe/ZnS量子点的荧光波长获得不同颜色量子点，并与不同长度的DNA探针偶联，分别检测其荧光发射光谱和可见吸收光谱。建立量子点标记探针前后荧光光谱与量子点波长、探针长度的关系。

(5).超顺磁纳米微球的合成表征并与探针的生物偶联

超顺磁Fe₃O₄采用化学共沉淀方法合成。主要方法为：混合0.005molFeCl₃和0.0025mol FeSO₄于50ml双蒸水中，保持Fe³⁺/Fe²⁺＝2。然后快速加入1.5M NaOH溶液，搅拌10min后分离并清洗沉淀4次。然后用无氧无水乙醇清洗后50℃干燥即得到Fe₃O₄晶体。然后通过水解TEOS在Fe₃O₄表面从而形成二氧化硅包裹的Fe₃O₄。其主要步骤为：将Fe₃O₄溶于240ml酒精中，调节pH＝9，加入4ml TEOS并反应10h，然后加热至50℃再次反应12h。然后用无氧无水乙醇清洗后50℃干燥过夜。然后将表面二氧化硅包裹的Fe₃O₄超声分散于120mlDMF和80ml甲苯中，随后加入10ml APTES反应24小时，离心收集沉淀并清洗3次得到表面氨基修饰的

纳米颗粒。重新将氨基修饰的

溶于200ml甲苯中，加热至110℃再加入4.85g戊二酸酐反应2h，离心收集沉淀并清洗3次得到表面羧基修饰的

纳米颗粒(

)。

超顺磁纳米微球的探针标记采用氨基与羧基间的缩合反应进行。其方法主要为将100mmol

溶于MES(pH＝5.4)缓冲液中，然后加入500mmol的5’端氨基标记的种属特异性探针(P2)，再加入EDC和NHS，在体系中反应1h，即可形成

复合物。通过磁性富集、分离，并采用PBS清洗4次，将最后的沉淀溶于1×PBS缓冲液中保存备用。

(6).量子点标记探针的性能研究

量子点探针生物活性研究：生物活性是判断探针质量的重要指标。本课题中拟合成多个不同长度寡核苷酸探针(10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp)分别标记不同颜色的量子点(在此拟用DNA替代PNA进行条件优化以降低实验成本，因为不同序列长度DNA-DNA杂交或者PNA-DNA杂交对荧光强度的影响成正相关)，然后与碱基完全匹配的核酸序列在DNA杂交仪中进行杂交，通过杂交前后荧光强度变化情况判断杂交效率并以此优化探针设计。

量子点探针保存时间研究：同上设计PNA探针以及完全匹配的核酸序列(DNA)，将探针上标记多色量子点微球后，避光保存于-20℃，分别于1d、5d、10d、20d、30d、60d、90d后取出并分别用荧光分光光度计进行荧光强度测试和探针杂交实验验证探针的降解情况，从而优化探针保存时间。

(7).核酸样本的制备

方法学评价所需短链DNA寡核苷酸样本(＜80bp)为上海英俊公司或者上海生工合成。长链靶分子序列采用确诊HBV患者且为血清学检查HBsAg、HBcAb、HBeAb三者均为阳性者血清中提取HBV DNA。该DNA采用碱裂解法进行提取，然后将提取产物作为模板，运用设计的引物对(该引物对设计时考虑到需能够使扩增产物同时包含所需的P1和P2探针的互补序列)进行PCR扩增。PCR产物经胶回收后重新进行PCR扩增以提高纯度，同时将扩增产物提交上海英俊公司进行测序。待测序产物为包含所需P1和P2探针的互补序列后，即可作为待检测的靶分子进行方法学评价试验。

临床样本验证则需要选取正常体检者血清50例，明确诊断HBV患者100例(其中尽量收集每个亚型的病例，因为我国HBV以B/C/D基因型居多，因此发明以此三型为代表)。全血样本经静脉收集后，经4000rpm离心20min并收集上清液。所收集血清采用碱裂解法进行核酸提取并保存于不含RNA酶的EP管中，低温保存于-80℃待用。

(8).量子点信号放大***研究

为证明其放大***的有效性，我们设计了一段靶序列[P1-(T)₆-P2]，该靶序列两端分别可以与种属特异性探针P1、P2完全互补，我们在此两段序列用一段(T)₆linker将其偶联。首先加入前面准备好的标记有扩增DNA探针(Pa)和P1DNA探针的量子点，随即加入与扩增DNA探针互补序列(Pac)，该序列末端为biotin标记，另外加入P2偶联的磁珠，在杂交液中反应30min。再加入过量链霉亲和素(Sa)，待其完全反应后，利用磁性富集技术去除溶液中未结合的所有化学分子、DNA序列。重新加入PBS(pH7.4)缓冲液复溶沉淀(磁珠-DNA-QD复合物)，然后加入表面修饰有biotin的量子点(CdSe/ZnS-biotin)，通过Sa-biotin间的高效特异性结合，形成第一层量子点的自组装。再次运用磁性富集以去除未能结合的量子点，将沉淀溶于PBS(pH7.4)，加入过量Sa并反应10min，磁性富集后将沉淀复溶于PBS，第二次加入CdSe/ZnS-biotin，从而形成量子点的第二层自组装，以此类推，可以形成量子点的层层自组装，从而将单个信号放大至10^8-9倍。

从理论上讲，其放大效率可以用以下公式进行推导：

$5=A\underset{i=1}{\overset{x}{\mathrm{\Σ}}}3m\·{\left[3(n-1)\right]}^{i-1}=A\{3m+3m\·{\left[3(n-1)\right]}^1+3m\·{\left[3(n-1)\right]}^2+\·\·\·+3m\·{\left[3(n-1)\right]}^{N-1}\}$

上述公式中，A为溶液中DNA拷贝数，m为每个QD表面结合的ssDNA数目，n为QD表面偶联的biotin数目，N为LBL-SA量子点的层数。

运用上述方法，我们进行了HBV病毒放大倍数与QD自组装层数的研究。其方法为：将合成的P1-(T)₆-P2序列倍比稀释至10¹⁰倍(其终浓度为0.01fM)，然后取10ml靶分子溶液，加上10ulFe₃O₄-P2，10ul540nm QD-P1溶液于PBS(pH7.4)缓冲液中杂交20min，然后通过0.3T的外加磁场作用3min，将杂交后的靶分子-磁珠-量子点复合物进行分离，然后分别用PBS(pH7.4)缓冲液清洗3次后，再将复合物复溶于1mlPBS(pH7.4)中，同时加入100μl 1mM的链霉亲和素，反应10min后运用0.3T外加磁场分离，清洗3次后复溶于1mlPBS(pH7.4)中，然后加入100μl1mM的生物素标记的540nmQD，反应10min后用外加磁场分离、清洗从而形成第一层QD的自组装。此时记录复合物的荧光强度记为FL1。依照同样的方法再次先后加入100μl1mM的链霉亲和素，和100μl1mM的生物素标记的540nmQD，磁性富集后分离得到第二层QD的自组装，记录复合物的荧光强度为FL2。依照此方法，分别记录第三层、第四层…….的QD自组装的荧光强度FL3，FL4，FL5…..直至第10层自组装FL10。结果如图表明，第一层QD自组装可将信号放大12倍，第二层可将信号放大至174倍，第三层放大到1634倍，第四层放大到15876倍，依次类推，在10层时，达到原始荧光强度的1.13E8倍。因此，我们时间检测结果与理论推导结果非常接近，但略微低于理论结果，其原因可能是由于多层放大之后的空间位阻导致了量子点多层组装时未能全部组装。

(9).同步鉴定与基因型分型

在含有靶分子(T)的溶液中加入量子点标记的P1探针和磁性微球标记的P2探针之后，待杂交30min进行磁性分离，所得沉淀为同时含有540nmQD-P1、Fe₃O₄-P2和靶分子的复合体(P1-T-P2)。由于P1P2同为针对不同位点的种属特异性探针，故此复合体检测的是所有HBV病毒DNA。进而加入620hm CdSe/ZnS标记的基因型分型探针(P3)，因为P3可以与靶分子中的型特异性位点互补杂交，故可以通过呈现不同的颜色来判断不同基因型的存在。这样，再次通过磁性分离可以将待检靶分子复合物(P1-P2-P3-T)从体系中分离出来，运用荧光光谱成像技术或者流式细胞仪技术进行检测。由于P2和P3探针分别标记为不同的颜色，因此通过最后检测到的颜色进行鉴定和分型的同步实施。并且，两种颜色的同时出现可以作为自身内参，及如果只有P3探针的颜色(无P2探针颜色)说明是假阳性结果。同样，只有P2探针的颜色(无P3探针颜色)说明是P2探针信号放大时产生的假阳性结果，只有当P2、P3的颜色同时出现，才能确定为真阳性结果，从而提高了检测的特异性。在本实施例中，我们针对不同基因型分别设计了相应的探针并进行了量子点标记，分别为：B基因型探针(P3b-QD560nm)，C基因型探针(P3c-QD580nm)，D基因型探针(P3d-QD620nm)，同样的方法可以建立针对不同基因型的分型探针。结果表明，P3b-QD620nm能够与540hm的鉴定探针完全分开，不存在光谱的重叠，因此可以非常准确的进行鉴定。因为此时的鉴定探针未进行扩增，其信号较弱，如果进行扩增，则可达到与540nm QD想类似的荧光强度。

各个分型探针的PNA序列分别为：

探针名称	序列
		P3b	5’-NH2-(CH2)6-TGTGTTTACTGAGTG-3’
P3c	5’-NH2-(CH2)6-AACGCCCACATGATCT-3’
		P3d	5’-NH2-(CH2)6-CGGTACGAGATCTTCTA-3’

当理解的是，本发明的具体实施例仅仅是出于示例性说明的目的，其不以任何方式限定本发明的保护范围，本领域的技术人员可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种病原微生物核酸无扩增检测和分型方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)根据待测样品的核酸序列合成DNA和/或PNA探针1，2，3，所述的探针1，2，3能够分别与待测样品杂交并且互不重叠；

(2)分别将探针1，2，3与磁性纳米颗粒和两种荧光量子点耦联，所述的荧光量子点的荧光可以相同，也可以不相同。

(3)合成生物素连接的桥连DNA合/或PNA序列1，2以及互补的序列1’，2’，将序列1’和2’与步骤(2)中的两种荧光量子点分别耦联；

(4)合成两种生物素修饰的荧光颜色不同的两种荧光量子点，这两种荧光量子点可以与步骤(2)中的荧光量子点相同，也可以不同；

(5)选择步骤(2)中的探针修饰的磁性纳米颗粒和其中一种探针修饰的荧光量子点，将其与待测样品以及相应的桥连序列进行杂交并进行磁性分离；然后通过重复加入Sa(链霉亲和素)-洗涤-加入步骤(4)中的其中一种生物素修饰的荧光量子点-洗涤的步骤进行层层组装，然后通过磁性分离得到待测样品的富集物，任选地，对富集物的样品进行荧光强度测定；

(6)选择另外一种探针修饰的荧光量子点，将其与步骤(5)获得的富集物以及相应的桥连序列进行杂交并进行磁性分离；然后通过重复加入Sa-洗涤-加入步骤(4)中的另外一种生物素修饰的荧光量子点-洗涤的步骤进行层层组装，然后通过磁性分离得到待测样品的第二富集物，任选地，对第二富集物的样品运用荧光光谱成像技术或者流式细胞仪技术进行检测。

2.一种病原微生物核酸无扩增检测和分型的试剂盒，其特征在于包括：三种DNA和/或PNA探针耦联的磁性纳米颗粒和两种荧光量子点，所述的三种探针能够分别与待测样品杂交并且互不重叠，荧光量子点的荧光可以相 同，也可以不相同；生物素修饰的桥连DNA和/或PNA，桥连DNA和/或PNA的互补序列耦联的两种荧光量子点；生物素修饰的荧光颜色不同的两种荧光量子点，这两种荧光量子点可以与上述荧光量子点的荧光相同，也可以不同；SA以及缓冲溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于待测样品为HBV核酸。

4.根据权利要求1所述的方法或权利要求2所述的试剂盒，所述的探针为PNA，所述的荧光量子点中的一个或多个或全部为CdSe/ZnS量子点，优选的，两种不同的荧光量子点的发射波长相差至少30nm，优选至少50nm，进一步优选至少80nm。

5.根据权利要求1所述的方法或权利要求2所述的试剂盒，所述的磁性纳米颗粒是 纳米颗粒。

6.根据权利要求1所述的方法或权利要求2所述的试剂盒，所述的三种探针为PNA，其中两个种属特异性探针序列为PNA种属特异性探针1和/或PNA种属特异性探针2的序列：

7.根据权利要求6所述的方法或试剂盒，期特征在于另一个用于分型的序列选自以下三条探针之一： 

  探针名称   序列   P3b   5’-NH₂-(CH2)₆-TGTGTTTACTGAGTG-3’   P3c   5’-NH₂-(CH2)₆-AACGCCCACATGATCT-3’   P3d   5’-NH₂-(CH2)₆-CGGTACGAGATCTTCTA-3’

8.根据权利要求7所述的方法或试剂盒，所述的桥连DNA的序列为5′-biotin(生物素)-GGGCAGCTGGGGCGGGCGGG-NH₂-3′ 。

9.根据权利要求1，3-8任意一项所述的方法，所述的方法是非诊断目的的。 

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