CN102978278B - 内源性的非编码小RNAs及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种微小RNA即miR‑644及其前体序列在诊断、预防、治疗和/或预后评估恶性肿瘤中的用途。本发明提供的微小RNA为包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸或者其生物活性功能片段或变体：5′‑AGUGUGGCUUUCUUAGAGC‑3′，所述微小RNA的前体为包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的核苷酸或者其生物活性功能的片段或变体。该微小RNA可以作为一种新型的药物组合物用于恶性肿瘤的预防和/或治疗，此外，该微小RNA还可以作为一种新的生物标志物应用于恶性肿瘤的诊断和/或预后评估。

Description

内源性的非编码小RNAs及其应用

技术领域

本发明属于生物医药工程领域，涉及一种内源性的非编码小RNAs及其应用，具体涉及一种微小RNA(microRNA，miRNA)及其前体序列和它们在制备预防和/或治疗恶性肿瘤疾病的试剂盒中的应用。

背景技术

当前恶性肿瘤是全世界死亡率较高的疾病，且恶性肿瘤的发病率逐年增加，严重威胁着人类的健康。第三次全国死因调查结果表明，我国城乡居民恶性肿瘤死亡率属于世界较高水平，而且呈持续的增长趋势，恶性肿瘤已成为我国城市居民首位死因(25％)。近年来有关肿瘤发病机理及肿瘤防治的研究取得很大进展，但在全球范围内，恶性肿瘤的防治仍是当今生命科学研究领域的一个难点。

细胞凋亡在肿瘤发病机制中发挥重要作用，肿瘤细胞凋亡的抑制与肿瘤的发生发展具有密切的关系。许多参与凋亡调控的基因在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，这些基因可以作为肿瘤诊断及治疗的作用靶点。因此，寻找肿瘤细胞中新的参与凋亡的蛋白因子、miRNA等及阐明其在肿瘤细胞凋亡中的作用机理具有极其重要的应用价值。

microRNA(miRNA)是一类长度在22nt左右的内源非编码小RNA，广泛存在于动物、植物、病毒等多种有机体中。它主要通过与靶基因的3′UTR的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，从而参与调控机体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动，预测超过1/3的人类基因都是保守的miRNA靶基因。实验证据表明，miRNA可通过调控其靶标基因参与的信号通路，影响肿瘤的发生和发展，发挥着类似于癌基因或抑癌基因的功能。miRNA的发现为肿瘤发病机制的研究提供了新的思路，为肿瘤诊断和治疗提供了新的策略。

随着科技的发展和肿瘤细胞信号传导途经研究的不断深入，以生物靶分子为基础的肿瘤生物治疗成为研究抗肿瘤药物的热点。肿瘤的生物疗法以分子生物学、细胞生物学和分析免疫学为基础，与手术放疗化疗三大常规疗法作用相互补充，大幅提高肿瘤的治疗疗效。将生物技术与放疗化疗结合起来，引入促凋亡的分子可以逆转肿瘤细胞产生的耐药性，增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性，从而避免了传统的放疗化疗方法引起的耐药性和毒副作用的缺点，达到***的效果。本领域迫切需要了解促肿瘤细胞凋亡相关的因子，将其作为药物治疗的靶分子应用于临床的治疗中，因此寻找与促肿瘤细胞凋亡相关的因子与放疗化疗结合***疾病，具有广阔的前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的具有促肿瘤细胞凋亡功能的微小RNA即miR-644，该miRNA为生物体内一段内源的miRNA，具有促进肿瘤细胞凋亡的功能，在肿瘤细胞模型和裸鼠荷瘤模型的实验中均增强了阿霉素对肿瘤细胞的治疗效果。

针对上述技术目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种微小RNA在制备用于预防、治疗和/或预后评估恶性肿瘤的药物或试剂盒中的用途，其中所述微小RNA为miR-644及其前体序列。

优选地，所述miRNA-644的序列为包含下述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或变体：

5′-AGUGUGGCUUUCUUAGAGC-3′。

优选地，所述miRNA-644前体的序列为包含下述SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的核苷酸或者其生物活性功能的片段或变体：

5′-UUUUUUUUUAGUAUUUUUCCAUCAGUGUUCAUAAGGAA

UGUUGCUCUGUAGUUUUCUUAUAGUGUGGCUUUCUUAGAGCAAA

GAUGGUUCCCUA-3′。

优选地，所述miRNA-644的序列进行了硫代修饰、甲氧修饰或胆固醇修饰。

优选地，所述miRNA-644或其前体的序列通过转入已知表达载体构建含有miRNA-644或其前体序列的表达载体，并将构建的含有miRNA-644或其前体序列的表达载体转入病毒表达获得。

优选地，所述已知表达载体为pSilencer Adeno CMV1.0穿梭载体(pSilencerAdeno CMV1.0shuttle vector)，所述病毒为腺病毒。

另一方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗恶性肿瘤的药物组合物，其包含治疗有效量的上述miR-644及其前体序列和药学上可接受的病毒、载体或辅料，其中所述微小RNA为包含以下SEQ ID NO：1序列的核酸或者其生物活性功能片段或变体：5′-AGUGUGGCUUUCUUAGAGC-3′。

优选地，所述药学上可接受的载体或辅料选自质粒表达载体、病毒、壳聚糖、胆固醇、脂质体、纳米颗粒等。

优选地，所述药物组合物的给药方式为口服给药或注射给药；更优选地，所述注射给药方式选自静脉注射、肌肉注射、直接肿瘤瘤内注射等。

又一方面，本发明还提供了一种用于预后评估恶性肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包含用于特异性检测上述miR-644的探针或引物。

优选地，所述试剂盒中包含的探针或引物具有下述SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列：

5′-GCTCTAAGAAAGCCACACT-3′。

综上所述，本发明人通过大量的实验证明，miRNA-644(5′-AGUGUGGCUUUCUUAGAGC-3′)通过诱导肿瘤细胞凋亡提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，在肿瘤预防、治疗及预后评估中具有重要的应用价值。

经化疗药物阿霉素处理，肿瘤细胞中miRNA-644表达显著上调，miRNA-644的上调可能参与了肿瘤细胞凋亡的发生。肿瘤细胞中过表达miRNA-644可以诱导肿瘤细胞凋亡的发生。将miRNA-644与适当的载体结合形成药物，导入肿瘤部位或体内，对恶性肿瘤患者将具有预防及治疗作用。发明人通过构建能够过表达miRNA-644的腺病毒感染胃腺癌SGC-7901细胞系及***Hela细胞系，发现miRNA-644可以诱导两种肿瘤细胞系凋亡，在细胞水平证明了miRNA-644通过诱导肿瘤细胞凋亡而达到***的潜在作用。通过miRNA-644反义寡核苷酸抑制miRNA-644的表达，可以抑制阿霉素诱导的肿瘤细胞凋亡。裸鼠皮下接种肿瘤细胞，接种部位同时注射miRNA-644模拟物，可显著抑制裸鼠皮下肿瘤生长。在整体动物水平也证明了miRNA-644的潜在预防、治疗作用。

肿瘤细胞中过表达miRNA-644，使用较低剂量的阿霉素即可诱导肿瘤细胞凋亡，提高了肿瘤细胞对药物的敏感性，在肿瘤治疗中可以克服化疗药物的毒副作用及耐药性的形成。

因此，本发明提供了将miRNA-644及其前体与适当载体或辅料如真核基因表达载体、腺病毒、壳聚糖、胆固醇、脂质体、纳米颗粒等包装形成药物，通过口服、静脉注射、肌肉注射、或直接肿瘤部位注射的方式，用于预防和/或治疗恶性肿瘤。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为阿霉素处理诱导肿瘤细胞凋亡过程中miRNA-644表达水平的变化的实验结果示意图；其中图1A为SGC-7901肿瘤细胞中miRNA-644表达水平实验结果示意图；图1B为Hela肿瘤细胞中miRNA-644表达水平实验结果示意图；

图2为miRNA-644过表达腺病毒构建载体后转入病毒后miRNA-644表达的实验结果示意图；其中图2A为含有miRNA-644的pSilencer Adeno CMV1.0穿梭载体的示意图；图2B为PCR验证获得含有miRNA-644的pSilencer Adeno CMV1.0穿梭载体的阳性克隆的电泳图，图中1为DNA标记(DNA Marker)，2为扩增获得610bp的miRNA-644片段；图2C为miRNA-644腺病毒感染SGC-7901肿瘤细胞miRNA-644表达水平检测实验结果示意图；图2D为miRNA-644腺病毒感染Hela肿瘤细胞miRNA-644表达水平检测实验结果示意图；

图3为通过腺病毒过表达miRNA-644可以诱导肿瘤细胞凋亡的实验结果示意图；其中图3A为SGC-7901肿瘤细胞凋亡的实验结果示意图；图3B为Hela肿瘤细胞中凋亡的实验结果示意图；

图4为通过转染人工合成的miRNA-644模拟物过表达miRNA-644可以诱导肿瘤细胞凋亡的实验结果示意图；其中图4A、4B为SGC-7901肿瘤细胞及Hela肿瘤细胞转染miRNA-644模拟物24小时后，实时荧光定量PCR方法检测miR-644表达水平的结果示意图；图4C、4D为SGC-7901及Hela肿瘤细胞转染miRNA-644模拟物后肿瘤细胞凋亡的实验结果示意图；

图5为裸鼠皮下接种肿瘤部位注射miRNA模拟物肿块形成的生长曲线；

图6为通过miRNA-644反义寡核苷酸抑制肿瘤细胞中miRNA-644表达，肿瘤细胞对阿霉素诱导的凋亡敏感性增强的实验结果示意图，其中图6A为Hela细胞转染miRNA-644反义寡核苷酸后，miRNA-644的表达情况的实验结果示意图；图6B为抑制内源性miRNA-644后，低剂量阿霉素作用下Hela细胞的凋亡情况的实验结果示意图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1阿霉素处理诱导肿瘤细胞凋亡过程中miRNA-644表达水平的变化

该实验分别用2uM阿霉素处理SGC-7901及Hela肿瘤细胞(均购自于中科院上海细胞库)3h，6h，12h，24h后收集细胞，用Trizol提取总RNA，采用实时荧光定量PCR的方法对miR-644的表达水平进行检测，观察在阿霉素处理肿瘤细胞的过程中miR-644的表达变化。如图1所示，随着阿霉素处理SGC-7901及Hela肿瘤细胞时间的增加，miR-644的表达水平在两种肿瘤细胞中均呈现明显上升的趋势。

实施例2miRNA-644腺病毒的构建

采用Ambion公司的pSilencer Adeno 1.0-CMV载体***构建miRNA-644过表达载体或腺病毒。按照公司说明书构建相应载体及腺病毒。

以大鼠基因组为模板，PCR扩增miRNA-644及其上下游两端各将近300个bp的序列，扩增得到片断约600bp(SEQ ID NO：2，如下所示)，扩增引物如下：

F：5′-CTAGTGTTTCCTATCCCTGTTGTG-3′(SEQ ID NO：7)；

R：5′-GGTAATGATGTGGTGTAAGTCCTG-3′(SEQ ID NO：8)。

扩增片段序列如下：

CTAGTGTTTCCTATCCCTGTTGTGGAGTGTTTTATCATGAAAGTGTATTAAATTTTG

TAAAATCCTTTTTTGGTATCAATTGAGATGATCATGTGATTTTTTTCCCCCCCTCAT

TCTGTTAATGTGGTATATTATGTTGATTTTTCATAGGTTGAACCTTTTTTGCATTCC

AGGAATAAATCCTACTTAGTCAAAAGGATTAAAGTGTGCTTTTAATATGCTGCTGA

GATTTTTTTGCTGATTTTTTTTTAGTATTTTTCCATCAGTGTTCATAAGGAATGTTGC

TCTGTAGTTTTCTTATAGTGTGGCTTTCTTAGAGCAAAGATGGTTCCCTATTACTTT

CTAATTTTATACTTCTACACATTAACAACTTTTATATTTAAAGCAGAAACTGGAAA

ATCAGGCCAATTTGGTATTAATGAAATTACAGAGGTAATTTAGATATGGGAATAA

ATTACCGATAATATTATTCTATCATTCATTTTAGTTACAATAAGTTTGGGTGCATAT

AATAGAAAACACTAAAATAATAGTGGTTTATGTAAGATAGAAGTGTATTTGTCCCC

ATTATTTAAAAATAGTCCAGCAGGACTTACACCACATCATTACC

扩增获得的片断克隆入T载体，亚克隆入pSilencer Adeno CMV1.0穿梭载体(pSilencer Adeno CMV1.0shuttle vector)，获得含miRNA-644的载体(如图2A)。通过PCR及测序验证获得含miRNA-644载体的克隆，PCR结果见图2B。Pac I酶切线性化该载体及腺病毒骨架(Adenovirus LacZ Backbone)，共转染HEK-293细胞(购自于美国ATCC)，包装腺病毒，扩增收集病毒，测定病毒滴度。实时定量PCR(Real-time PCR)鉴定miRNA-644的表达。

miRNA-644突变体病毒构建：将miR-644pSilencer Adeno CMV1.0穿梭载体通过基因定点突变的方法突变miRNA-644序列的四个碱基(通过QuikChange定点突变试剂盒(Stratagene公司)进行基因定点突变，具体方法参照试剂盒说明操作)，突变引物如下，突变的碱基划横线标出：

5′-GCTCTGTAGTTTTCTTATAGTTGACCTTTCTTAGAGCAAAGATGG-3′(SEQ ID NO：5)

5′-CCATCTTTGCTCTAAGAAAGGTCAACTATAAGAAAACTACAGAGC-3′(SEQ ID NO：6)。

得到突变后的miR-644pSilencer Adeno CMV1.0穿梭载体按照上述相同的方法构建miRNA-644突变体腺病毒。病毒均溶于无血清培养基，-80℃储存备用。

将miRNA-644腺病毒感染SGC-7901及Hela肿瘤细胞，24小时后，收集细胞，提取RNA，Real-time PCR检测miRNA-644表达水平，结果显示感染miRNA-644腺病毒的细胞miRNA-644表达量明显升高，而感染miRNA-644突变体病毒的细胞miRNA-644表达没有变化，(如图2C，2D)。

实施例3腺病毒过表达miRNA-644可以诱导肿瘤细胞凋亡

将miRNA-644腺病毒感染SGC-7901及Hela肿瘤细胞，腺病毒感染12、24、36、48小时后，通过原位末端缺口标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况。如图3所示，过表达miRNA-644后SGC-7901及Hela肿瘤细胞随着时间的延长均有细胞凋亡发生。

实施例4miRNA-644模拟物过表达miRNA-644可以诱导肿瘤细胞凋亡

将SGC-7901及Hela肿瘤细胞转染人工合成的miRNA-644模拟物(模拟物于上海吉玛公司合成，为2′-甲氧修饰的寡核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO：1)，转染后12、24、48小时，通过原位末端缺口标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况。如图4所示，过表达miRNA-644后SGC-7901及Hela肿瘤细胞随着时间的延长均有细胞凋亡发生。

实施例5裸鼠皮下接种肿瘤部位注射miRNA模拟物肿块形成生长曲线

培养Hela肿瘤细胞，胰酶消化收集细胞，接种1×10⁷细胞于无胸腺的BALB/c裸鼠(购自于北京维通利华动物动物实验有限公司)背部皮下。接种细胞3天后，于接种部位注射miRNA-644模拟物(与实施例4中的miRNA-644模拟物同)(模拟物于上海吉玛公司合成)，注射miRNA模拟物阴性对照作为对照组。每组6只BALB/c裸鼠进行实验，接种肿瘤细胞后每隔3天测量瘤块的大小，连续观察4周，按公式：长×宽2/2计算肿块体积，绘制肿瘤生长曲线，观察miR-644在裸鼠水平上对肿瘤形成的影响。如图5所示，注射miRNA-644的裸鼠肿瘤生长较对照组慢，成瘤体积较小。

实施例6肿瘤细胞中过表达miRNA-644，肿瘤细胞对阿霉素诱导的凋亡敏感性增强

SGC-7901及Hela肿瘤细胞感染miRNA-644腺病毒及其突变体病毒，感染24小时后，使用低剂量的阿霉素(0.2μM)处理细胞，24小时后通过原位末端缺口标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况。如图6所示，使用低剂量的阿霉素(0.2μM)处理SGC-7901及Hela肿瘤细胞，肿瘤细胞凋亡不太明显。过表达miRNA-644后，则用此剂量的阿霉素可以明显促进肿瘤细胞凋亡的发生，也就是过表达miRNA-644可以增加阿霉素诱导的肿瘤细胞凋亡的敏感性。

Claims (6)

1.一种人源miRNA-644及其前体在制备用于治疗恶性肿瘤的药物组合物或试剂盒中的用途，

其中，所述恶性肿瘤为胃腺癌和***。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA-644为包含下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或变体：

5′-AGUGUGGCUUUCUUAGAGC-3′。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA-644前体的序列为包含下述SEQID NO:3所示的核苷酸序列的核苷酸或者其生物活性功能的片段或变体：

5′-UUUUUUUUUAGUAUUUUUCCAUCAGUGUUCAUAAGGAAUGUUGCUCUGUAGUUUUCUUAUAGUGUGGCUUUCUUAGAGCAAAGAUGGUUCCCUA-3′。

4.根据权利要求1至3任一项所述的用途，其特征在于，所述miRNA-644的序列进行了硫代修饰、甲氧修饰或胆固醇修饰。

5.根据权利要求1至4任一项所述的用途，其特征在于，所述miRNA-644或其前体通过转入已知表达载体构建含有miRNA-644或其前体的表达载体，并将构建的含有miRNA-644或其前体的表达载体转入病毒表达获得。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述已知表达载体为p Silencer AdenoCMV1.0穿梭载体，所述病毒为腺病毒。