CN102978132B - 一种能防治番茄青枯病的微生物植物疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种防除连作番茄青枯病的微生物植物疫苗，属于农业集约化生产技术。本发明从番健康茄根际分离到了一株青枯菌同属细菌皮氏罗尔斯通氏菌(Ralstoniapickettii)NJQL-A6。该菌对青枯病病原菌茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)平板抑制作用弱，但在番茄根际和植物内部定殖能力强，能抑制茄科罗尔斯通氏菌对番茄植株的侵染。试验表明，这种疫苗浇灌施用到土壤后能迅速繁殖，在土壤中形成优势群，在发病严重的番茄青枯病土壤中生防效率达70％以上。对于根部已被青枯菌侵染的番茄植株，通过地上部接种该生防菌能有效控制病害的进一步发展。

Description

一种能防治番茄青枯病的微生物植物疫苗

一、技术领域

本发明一种能防除连作番茄青枯病的微生物植物疫苗，属于农业集约化生产技术，专用于克服和消除连作番茄青枯病问题。

二、背景技术

番茄青枯病是由茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的细菌性维管束土传病害。1906年美国Simth学者首次发现并报道这一病害，至今全世界除南极洲外，其他国家和地区均有青枯菌的存在。罗尔斯通菌被分为五个生理小种和6个生化小种。各小种对番茄均有一定的致病能力，其中生理小种1对番茄的致病力最强。在我国，番茄青枯病主要发生在温暖湿润的南方，随着气候变暖和高效农业发展，青枯病逐渐向我国北方发展。青枯菌能通过土壤、流水(灌溉等)、种子等方式传播，对环境有很强的适应能力。土壤中存在青枯菌后，初期由于病菌数量少，植株生长受到限制，矮小，果实小，农民往往认为是养分问题而加大氮肥投入，导致土壤中微生物群落进一步失衡，番茄连作3季以上，病原菌在根际成优势，就能侵染番茄。在高温高湿的条件下，病害发展迅速，发病严重的田块发病率达100％，造成绝收。目前南方很多蔬菜基地不再适合种植番茄，对我国番茄市场的发展影响很大。目前没有防治番茄青枯病的有效手段，利用根际微生物防治病害是综合防治土传病害的重要措施之一。生防菌的根际定殖和内生能力是影响其防效的关键因子。生物防治技术满足现代农业对环境保护，食品安全等的要求，是实现农业可持续农业发展的有效方法之一。

三、发明内容

1.技术问题

本发明的目的在于开发一种能防治连作番茄青枯病的微生物植物疫苗，克服或消除连作番茄作物青枯病效率达到70％以上，减少或完全替代农药的使用，确保集约化农业的顺利发展。

2.技术方案

防除连作番茄青枯病的生防菌NJQL-A6，该微生物属于皮氏罗尔斯通菌(Ralstoniapickettii)，2012年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.6628，主要生物学特性为革兰氏染色阴性G^-，细胞形状为短杆状，0.5～0.6×1.5～3.0μm，单一极生鞭毛，不形成芽孢，严格好氧生长，在平板上不产色素，氧化酶、接触酶反应阳性，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阴性，明胶水解阴性，精氨酸双水解酶阴性，卵黄反应阴性，脂肪酶、磷酸酶、脯氨酸氨肽酶呈阳性；发酵丙三醇、D-木糖、L-***糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、己二酸、L-色氨酸、L-络氨酸、γ-氨基丁酸、L-天冬氨酸盐、L-缬氨酸、L-苏氨酸、甘氨酸和苏氨酸、L-丝氨酸；能利用核酸盐、L-谷氨酸盐、葡萄糖酸盐、奎酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、马尿酸盐。

用生防菌NJQL-A6所生产的防除连作番茄青枯病微生物植物疫苗，该疫苗中含有1×10¹⁰个/ml以上的生防菌NJQL-A6。

所述的防除连作番茄青枯病微生物植物疫苗，其生产方法包括：

选用生防菌NJQL-A6，接种到KB(20g蛋白胨，10mL甘油，1.5g MgSO4·7H₂O，1.5gFeSO₄·7H₂O，蒸馏水1L，pH 7.2，121℃灭菌20min)或CPG(10g蛋白胨，1g水解络蛋白，5g葡萄糖，18g琼脂，1L蒸馏水，pH 7.2，115℃，高压灭菌30min)培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：pH生长范围6-8，培养温度范围25～37℃，搅拌速度为170～300转/分钟，发酵液含菌量≥1×10¹⁰个/ml。

所述微生物植物疫苗可专用于防除连作番茄青枯病。

3.有益效果

本发明一株防控连作番茄青枯病的微生物植物疫苗，具有如下优点：

1)生防菌NJQL-A6是青枯菌同属菌，其生活习性与青枯菌类似(但对植物不致病)，与青枯菌竞争营养物质和生存位点的能力非常强。该菌施入土壤后能在番茄根际形成优势群，起到保护植物根系的作用，抵御病菌的侵染。

2)该菌株内生性能好，在番茄茎基部稳定大量存活。针对已经被青枯菌感染的植株，通过地上部接种，该生防菌可以快速在植物体内扩散大量定殖，抵御病菌进一步侵染。

3)本发明田间施用方便，用量少。在育苗期伤根浇灌该生防菌悬液，可使菌株在苗期在根部和根内定殖，在育苗期间即完成疫苗施用。

4)本植物疫苗生产原料成本较低，生产工艺简便，固定资产投入少，生产过程中耗电耗水极少，因此产品价位适中而针对性强，企业每生产1吨微生物植物疫苗的所有成本不超过2000元，而目前市场上一般的特效专用为菌剂价格在20000元/吨以上，而且非常紧缺，因此本产品具有强大的社会、环境和经济生命力。

5)试验结果表明，在连作番茄的土壤上施用本产品后，能显著降低番茄青枯病的发病率，生物防治率达70％以上。

四、附图说明

图1施用不同浓度疫苗NJQL-A6对番茄青枯病发病率和生防率的影响

图2灌根和茎部注射法施用疫苗NJQL-A6处理青枯病的发病率

图3无菌水和疫苗NJQL-A6处理田间番茄青枯病发病率(A)和番茄茎基部、接种点和叶柄处青枯菌的数量(B)

五、具体实施方式

(一)菌株的分离和鉴定

防除连作番茄青枯病的植物疫苗NJQL-A6，分离来自于连作番茄青枯病发病的田块健康番茄植株根际土壤。通过采集已经发生连作障碍并出现番茄青枯病病症的植株和周围土壤，样品低温保存，采用M-SMSA青枯病选择性培养基获得病原菌株和大量供试生防菌(疑似非致病性青枯菌)，分别利用CPG，TZC和M-SMSA培养基通过平板对峙实验初筛，根际和茎基部定殖能力实验复筛，最后通过盆栽试验确定高效生防菌株，鉴定属种，菌种冻干-20℃保存。

该菌株NJQL-A6属于皮氏罗尔斯通氏菌(Ralstonia pickettii)，主要生物学特性为革兰氏染色阴性G^-，细胞形状为短杆状，0.5～0.6×1.5～3.0μm，单一极生鞭毛，不形成芽孢，严格好氧生长，在平板上不产色素，氧化酶、接触酶反应阳性，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阴性，明胶水解阴性，精氨酸双水解酶阴性，卵黄反应阴性，脂肪酶、磷酸酶、脯氨酸氨肽酶等呈阳性。发酵丙三醇、D-木糖、L-***糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、己二酸、L-色氨酸、L-络氨酸、γ-氨基丁酸、L-天冬氨酸盐、L-缬氨酸、L-苏氨酸、甘氨酸和苏氨酸、L-丝氨酸；能利用核酸盐、L-谷氨酸盐、葡萄糖酸盐、奎酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、马尿酸盐等。

(二)疫苗生产

选用生防菌NJQL-A6，接种到KB(20g蛋白胨，10mL甘油，1.5g MgSO₄·7H₂O，1.5gFeSO₄·7H₂O，蒸馏水1L，pH 7.2，121℃灭菌20min)或CPG(10g蛋白胨，1g水解络蛋白，5g葡萄糖，18g琼脂，1L蒸馏水，pH 7.2，115℃，高压灭菌30min)培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：pH生长范围6-8，培养温度范围25～37℃，搅拌速度为170～300转/分钟，发酵液含菌量≥1×10¹⁰个/ml。

(三)温室防效试验

1、不同施用浓度

在番茄三叶期采用灌根法比较施用不同浓度疫苗NJQL-A6防控番茄青枯病的效果。试验设置三个处理，即疫苗R._pickettii NJQL-A6与病原菌R.solanacearum QL-Rs1115三种接种比率：0∶1Rs，作为对照(CK)，即不施用疫苗NJQL-A6，只接种5mL病原菌菌液(1.0×10⁸cfu/mL)；1Rp∶1Rs，即每杯浇灌5mL疫苗NJQL-A6菌液(1.0×10⁸cfu/mL)，1h后接种5mL病原菌菌液(1.0×10⁸cfu/mL)；10Rp∶1Rs，即每杯浇灌5mL疫苗NJQL-A6菌液(1.0×10⁹cfu/mL)，1h后接种5mL病原菌菌液(1.0×10⁸cfu/mL)。每处理24重复(24株苗)，每12杯置于一个周转箱内。统计发病率和生防率：根据植株叶片萎蔫程度，将发病级别分5级：0表示植株正常；1表示植株叶片萎蔫≤25％；2表示26％≤植株叶片萎蔫≤50％；3表示51％植株叶片萎蔫≤75％；4表示76％≤植株叶片萎蔫或死亡。每天记录番茄青枯病发病程度。发病率(DI)和生防率(BCE)的计算如下：

BCE＝(DI_CK-DI_t/DI_CK)×100％；

其中i为发病等级代表数值，i_max为发病最高等级代表值，n_i为发病等级为i的株数，N为某处理考察总株数。DI_CK和DI_t分别为对照和处理发病率。

灌根法施用疫苗NJQL-A6能有效降低青枯病发病率(图1)。当疫苗NJQL-A6与病原菌施用比例为1∶1时，发病率显著低于对照。提高疫苗NJQL-A6施用比例到10∶1，发病率显著下降。接种21d后，对照发病率达到79.2％，显著高于1∶1处理(41.7％)，而10Rp∶1Rs处理植株在整个考察期内无发病症状。

2、不同施用方式

番茄移栽45d后，用灌根和茎部注射两种方法施用疫苗NJQL-A6。灌根处理：每钵灌根法施用15mL疫苗NJQL-A6菌液(10⁹cfu/mL)；注射处理：茎部注射法施用10μL疫苗NJQL-A6菌液(10⁸cfu/mL)；无菌水处理设为对照。注射处理1d后，每钵灌根法接种15mL青枯菌QL-Rs1115菌液(10⁹cfu/mL)。发病率统计参照上文。灌根和茎部注射法施用疫苗NJQL-A6均显著降低了青枯病发病率。接种28d后，对照(未接种疫苗NJQL-A6)、灌根和注射处理发病率分别为38.4％、18.1％和10.9％；注射处理发病率显著(P＜0.001)低于灌根处理(图2)。

(四)田间试验

为验证本发明微生物植物疫苗在田间防治效果，在南京麒麟镇后村番茄大棚布置田间试验，考察茎部注射法施用疫苗NJQL-A6防控青枯病的能力。

设置两个处理：NJQL-A6，在开花期茎部注射法在番茄叶柄处(用记号笔标记)施用10μL NJQL-A6菌液(10⁸cfu/mL)；CK，无菌水处理。每处理160株苗。施用疫苗45d后考察发病率。

田间试验表明，茎部注射施用疫苗NJQL-A6显著降低了青枯病发病率(图3A)。在番茄收获时，对照(无菌水处理)发病率达33.1％，疫苗NJQL-A6处理仅为8.8％(图3A)。茎部注射疫苗NJQL-A6显著降低了地上部青枯菌的数量(图3B)。NJQL-A6处理植株茎基部、接种点和叶柄处病原菌含量分别为5.0、3.6和3.21g cfu/gfps，而在对照中地上部病原菌平均含量大于8.21g cfu/gfps。

本发明专利从同属细菌在生存位点和营养利用方面竞争更激烈的角度出发，筛选到与青枯菌同属的生防菌NJQL-A6，研制出一种能显著降低连作番茄青枯病发生的微生物植物疫苗产品，防治率达70％以上。本疫苗产品的作用机制在于功能菌NJQL-A6具有很强的根际定殖和内生能力，能迅速在植物根系或组织内部抢占病原菌的生态位及食物链，使病原菌从土壤向地上部侵染的过程步步受阻，大大提高了作物的立苗率和抗逆能力。

Claims (6)

1.一种防除连作番茄青枯病的生防菌，该菌株NJQL-A6属于皮氏罗尔斯通氏菌(Ralstonia pickettii)，2012年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.6628，主要生物学特性为革兰氏染色阴性G^-，细胞形状为短杆状，0.5～0.6×1.5～3.0μm，单一极生鞭毛，不形成芽孢，严格好氧生长，在平板上不产色素，氧化酶、接触酶反应阳性，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阴性，明胶水解阴性，精氨酸双水解酶阴性，卵黄反应阴性，脂肪酶、磷酸酶、脯氨酸氨肽酶呈阳性；发酵丙三醇、D-木糖、L-***糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、己二酸、L-色氨酸、L-络氨酸、γ-氨基丁酸、L-天冬氨酸盐、L-缬氨酸、L-苏氨酸、甘氨酸和苏氨酸、L-丝氨酸；能利用核酸盐、L-谷氨酸盐、葡萄糖酸盐、奎酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、马尿酸盐。

2.用权利要求1所述生防菌NJQL-A6所生产的防除连作番茄青枯病微生物植物疫苗。

3.根据权利要求2所述的防除连作番茄青枯病微生物植物疫苗，其特征在于：该菌株中含有1×10¹⁰个/ml以上的皮氏罗尔斯通氏菌CGMCC NO.6628。

4.权利要求2或3所述防除连作番茄青枯病微生物植物疫苗的生产方法，步骤如下：

选用皮氏罗尔斯通氏菌CGMCC NO.6628，接种到KB或CPG培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：pH生长范围6-8，培养温度范围25～37℃，搅拌速度为170～300转/分钟，发酵液含菌量≥1×10¹⁰个/mL。

5.根据权利要求4所述微生物植物疫苗的生产方法，其中步骤中所用KB和CPG培养液配制方法为：

(1)KB：20g蛋白胨，10mL甘油，1.5g MgSO₄·7H₂O，1.5g FeSO₄·7H₂O，蒸馏水1L，pH 7.2，121℃灭菌20min；

(2)CPG：10g蛋白胨，1g水解络蛋白，5g葡萄糖，18g琼脂，1L蒸馏水，pH 7.2，115℃，高压灭菌30min。

6.权利要求2或3所述微生物植物疫苗在防除连作番茄青枯病中的应用。