CN102952838B - 一种免疫增强贻贝酶解多肽的制备方法及其相应片剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种免疫增强贻贝酶解多肽及其相应片剂的制备方法，步骤为：以贻贝干粉作为原料，与缓冲液按照1∶20～1∶25的重量体积比混合、匀浆，然后调节pH值至9.5～10，得混合液；将混合液温度升至50～55℃预热10～15分钟，按照原料的1.0％～1.5％分别加入碱性蛋白酶和中性蛋白酶，酶解温度为50～55℃，酶解时间2～4h；将所得的酶解产物先经灭酶处理，得酶解液，所述酶解液依次经脱盐、浓缩和喷雾干燥，得免疫增强酶解多肽；本发明还公开了相关的免疫增强型贻贝多肽片。本发明的制备方法简单，得到的免疫增强肽及其片剂具有较高的活性，同时原料资源丰富，具有较强的工业实施性。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种由贻贝等软体动物酶解制备免疫增强贻贝酶解多肽和相应片剂的方法。
背景技术
贻贝属软体动物门、瓣鳃纲、贻贝目、贻贝科，贻贝属，是海产双壳贝类，俗称青口、海红，素有“海中鸡蛋”之称，其蛋白质含有人体需要的缬氨酸、亮氨酸等8种必需氨基酸，且含量远高于鸡蛋、鸡、鸭、鱼、虾和肉类。
贻贝优良的蛋白组成为贻贝深度开发提供了保证，如新西兰从贻贝中提取治疗风湿性关节炎和骨关节的药物，俄罗斯专门用贻贝生产一种防动脉粥样硬化的食品。但是我国贻贝基本停留在带壳鲜销、加工成各种冷冻食品、油炸食品和贻贝油等方面，精深加工产品的开发利用极少。因此，与其它大宗海产品相比而言，贻贝的加工利用率极低，造成了高营养贻贝资源的极大浪费，从而限制了我国贻贝产业的持续快速发展。因此，高效开发利用贻贝蛋白资源具有广阔的市场前景和重要的社会意义。
近年来，国内部分学者对贻贝酶解多肽的制备工艺进行了研究。如中国专利CN102020709 A“一种厚壳贻贝抗菌肽及制备方法和用途”即研究了从厚壳贻贝制备抗菌肽的方法及其在饲料中做为添加剂的应用；中国专利CN 101991840 A“抗***癌贻贝酶解提取物的制备方法及应用”即研究了利用Alcalase制备抗***癌贻贝酶解提取物的方法及其应用；中国专利CN 101991840 A“酶解贻贝蛋白制备降血压肽的方法”即研究了一种利用碱性蛋白酶酶解贻贝蛋白制备降血压肽的方法。以上方法利用酶解工艺制备具有特定功效的多肽，但是由于单一酶酶解相对效率较低，从而具有特定功效的多肽得率极低，难以达到产业化需求。另外，中国专利CN 101991840 A“贻贝活性多肽的制备方法”即研究了一种酸性条件下利用真空超声波反应釜制备贻贝活性多肽的方法，该方法虽然具有工艺简单，适于工业化生产的优势，但是所得酶解产物除含有多肽外，尚含有多糖等多种物质，是多种成分的混合物，所得制备物不能直接用于纯度要求高的用途中。
申请人在检索过程发现我国以贻贝为原料，利用酶解技术制备免疫增强作用多肽的工艺研究处于空白阶段，对于实际可行的酶解工艺尚没有报道，而以此为原料制备免疫增强型多肽片的制备工艺及配方更是未见报道。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种免疫增强贻贝酶解多肽的制备方法，以贻贝为原料，资源丰富，同时制备工艺简单、制得的免疫增强肽纯度高、且具有较高的活性。
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种贻贝多肽片的制备方法，以贻贝蛋白免疫增强肽为原料进行制备，制得的片剂可作为老年人和体弱多病者的日常保健产品，亦可作为术后病人的医用食品。
本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种免疫增强贻贝酶解多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)以贻贝干粉作为原料，将原料与pH为9.5～10.5的甘氨酸-NaOH缓冲液按照1g∶20ml～1g∶25ml的重量体积比混合、匀浆，然后调节pH值至9.5～10，得混合液；
2)将混合液温度升至50～55℃搅拌预热15～20分钟，按原料质量的1.0％～1.5％分别加入碱性蛋白酶和中性蛋白酶，酶解温度为50～55℃，酶解时间2～4h；
3)将所得的酶解产物先经灭酶处理，得酶解液，再将酶解液依次经脱盐、浓缩和喷雾干燥，得到免疫增强贻贝酶解多肽。
作为优选，所述的步骤1)中的贻贝为紫贻贝、厚壳贻贝或者翡翠贻贝。
作为优选，所述的步骤1)中的缓冲液的pH为10。
再优选，所述的步骤2)中的碱性蛋白酶的酶活力≥1.9×104U/g，中性蛋白酶的酶活力≥4.9×104U/g。
最后，所述步骤3)中的灭酶处理为：将步骤2)所得的酶解产物升温至95～100℃，并于此温度保持10～15min，再冷却至0～10℃以终止酶反应，然后离心，得酶解液；
所述步骤3)中脱盐、浓缩和喷雾干燥的具体过程为：将酶解液制成浓度10mg/ml～20mg/ml的溶液，进行大孔树脂脱盐；脱盐后的酶解液在≤40℃的低温下进行真空浓缩，得到浓缩酶解液的比重为1.05～1.15g/cm3；浓缩酶解液在进行温度为160～200℃下进行喷雾干燥，出口温度为65～110℃。
获得的贻贝酶解多肽经SEC-HPLC试验表明：酶解产物平均分子量为385.9kDa，分子量(80～2500u)含量为90.89％。
本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种免疫增强贻贝酶解多肽片剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)以贻贝干粉作为原料，采用上述的酶解技术制备免疫增强贻贝酶解多肽；
2)将制得的酶解多肽与稀释剂混合均匀，过60～80目筛，加入适量乙醇，将混合物制成软材，过20～24目筛，制成颗粒状，再在50～60℃条件下通风干燥，再过18～22目筛，得到制片颗粒；
3)在所得制片颗粒中加入适量的崩解剂和润滑剂，混合均匀，最后在压片机上压成片剂，包薄膜衣，即得免疫增强型贻贝多肽片。
作为优选，所述稀释剂为微晶纤维和淀粉，所述酶解多肽与微晶纤维和淀粉按照质量比1∶0.8～1∶0.3～0.6混合均匀。
再优选，所述崩解剂为干淀粉，所述润滑剂为滑石粉；所用干淀粉的量为制片颗粒重量的2.5％～3.5％，所用滑石粉的量为制片颗粒重量的1％～2％。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明工艺科学合理，操作简单，选用碱性蛋白酶和中性蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合大孔树脂脱盐和喷雾干燥等手段进行制备，酶解过程易监控，使免疫增强肽最大程度地释放出来，提高原料的利用率，同时制得的免疫增强肽及其片剂具有较高的活性；
2、本发明采用的原料是贻贝，资源丰富，成本较低，同时可以有效提高贻贝的附加值，对贻贝产业的可持续发展具有重要的意义；
3、本发明所制备的免疫增强肽是贻贝蛋白经酶水解制得，安全、无毒副作用，并且免疫增强作用显著，对老年人、体弱多病者和术后病人具有良好的保健作用，免疫增强肽可以作为药品、保健食品、食品、食品添加剂等，本发明的免疫增强肽片剂可作为老年人和体弱多病者的日常保健产品，亦可作为术后病人的医用食品。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一种免疫增强贻贝酶解多肽的制备工艺及其片剂制备方法，制备工艺流程如下：贻贝干粉→酶解→大孔树脂脱盐→喷雾干燥→免疫增强肽→片剂。
具体步骤为：
1、称取贻贝脱脂干粉5.0g，加入pH为10的甘氨酸-NaOH缓冲液125mL，于组织捣碎机内均质5min，用1mol/L HCl将该混和物调pH值为9.5，得混和液。
2、将混合液温度升至55℃搅拌预热，并于搅拌状态下保温20min；然后加入0.075g碱性蛋白酶(酶活力≥1.9×104U/g)和0.050g中性蛋白酶(酶活力≥4.9×104U/g)启动酶解反应，酶解温度为53～55℃，连续搅拌，保持反应体系的温度及pH恒定(温度为53～55℃，pH为9.5)，酶解时间为3h。得酶解产物。
3、将步骤2)所得的酶解产物先经灭酶处理，得酶解液，所述酶解液依次经大孔树脂脱盐、浓缩和喷雾干燥，得免疫增强肽。具体实验为：
①灭酶：将酶解产物于95℃水浴中灭酶10min，然后冷却至10℃；从而终止酶反应，接着在5000r/min下离心15min，取上清液作为酶解液。
②D101大孔树脂脱盐：将酶解液制成质量浓度为10mg/ml溶液，加入到D101大孔树脂层析柱，以水洗除酶解液中的盐及杂质，然后用70％乙醇以2.0BV/h的流速将酶解物从D101大孔树脂上解吸下来，低温(≤40℃)真空浓缩得酶解液浓缩液。
③喷雾干燥：喷雾干燥时酶解液比重为1.1g/cm3，进行温度应为175～180℃，出口温度应为75～80℃。
所得的贻贝酶解多肽经SEC-HPLC试验表明：酶解产物平均分子量为385.9kDa，分子量(80～2500u)含量为90.89％。
将制得的贻贝酶解多肽做小鼠机体的免疫增强作用实验(对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响、对小鼠血清溶血素的影响和对小鼠碳廓清能力的影响)，测定方法参照徐增莱，汪琼，赵猛等“淮山药多糖的免疫调节作用研究”[记载于《世珍国医国药》，2007年第5期(第18卷)：第1040-041页]
实验结果表明：贻贝酶解多肽能显著增强小鼠淋巴细胞增殖能力、促进小鼠抗体生成、增强小鼠碳廓清能力，亦即贻贝酶解多肽对小鼠的体液免疫、细胞免疫功能、非特异性免疫功能都具有一定的增强作用。
表1贻贝酶解多肽对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响(n＝3)
表2贻贝酶解多肽对小鼠血清溶血素的影响(n＝3)
表3贻贝酶解多肽对小鼠碳廓清能力的影响(n＝3)
4、将酶解多肽与微晶纤维和淀粉以1∶0.9∶0.5混合均匀，过60目筛，加入适量乙醇，将混合物制成软材，过22目筛，制成颗粒状，再在55℃条件下通风干燥，再过20目筛，得到制片颗粒。
5、将制片颗粒加入重量占制片颗粒3.0％的淀粉和1.5％的滑石粉，混合均匀，在压片机上压成片剂，包薄膜衣，即得免疫增强型贻贝多肽片。
本发明的免疫增强肽可以作为药品、保健食品、食品、食品添加剂等，工艺科学合理，操作简单，具有较强的工业实施性。本发明的免疫增强肽片剂可作为老年人和体弱多病者的日常保健产品，亦可作为术后病人的医用食品。
采用本发明方法制备而得的免疫增强肽片的实际用法为：口服，每日3次，每次4～6片。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种免疫增强贻贝酶解多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)以贻贝干粉作为原料，将原料与pH为9.5～10.5的甘氨酸-NaOH缓冲液按照1g∶20ml～1g∶25ml的重量体积比混合、匀浆，然后调节pH值至9.5～10，得混合液；
2)将混合液温度升至50～55℃搅拌预热15～20分钟，按原料质量的1.0％～1.5％分别加入碱性蛋白酶和中性蛋白酶，酶解温度为50～55℃，酶解时间2～4h；
3)将所得的酶解产物先经灭酶处理，得酶解液，再将酶解液依次经脱盐、浓缩和喷雾干燥，得到免疫增强贻贝酶解多肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤1)中的贻贝为紫贻贝、厚壳贻贝或者翡翠贻贝。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤1)中的缓冲液的pH为10。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中的碱性蛋白酶的酶活力≥1.9×104U/g，中性蛋白酶的酶活力＞4.9×104U/g。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)中的灭酶处理为：将步骤2)所得的酶解产物升温至95～100℃，并于此温度保持10～15min，再冷却至0～10℃以终止酶反应，然后离心，得酶解液；
所述步骤3)中脱盐、浓缩和喷雾干燥的具体过程为：将酶解液制成浓度10mg/ml～20mg/ml的溶液，进行大孔树脂脱盐；脱盐后的酶解液在540℃的低温下进行真空浓缩，得到浓缩酶解液的比重为1.05～1.15g/cm3；浓缩酶解液在进行温度为160～200℃下进行喷雾干燥，出口温度为65～110℃。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)中所得的贻贝酶解多肽的酶解产物平均分子量为385.9Da，分子量80～2500Da的含量为90.89％。
7.一种免疫增强贻贝酶解多肽片剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)以贻贝干粉作为原料，采用权利要求1至5任意一种的酶解技术方法制备免疫增强贻贝酶解多肽；
2)将制得的酶解多肽与稀释剂混合均匀，过60～80目筛，加入适量乙醇，将混合物制成软材，过20～24目筛，制成颗粒状，再在50～60℃条件下通风干燥，再过18～22目筛，得到制片颗粒；
3)在所得制片颗粒中加入适量的崩解剂和润滑剂，混合均匀，最后在压片机上压成片剂，包薄膜衣，即得免疫增强型贻贝多肽片。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述稀释剂为微晶纤维和淀粉，所述酶解多肽与微晶纤维和淀粉按照质量比1∶0.8～1∶0.3～0.6混合均匀。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述崩解剂为干淀粉，所述润滑剂为滑石粉；所用干淀粉的量为制片颗粒重量的2.5％～3.5％，所用滑石粉的量为制片颗粒重量的1％～2％。
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