CN102952180B - 一种高纯度棘白菌素b的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用曲霉属(Aspergillus sp.)发酵代谢产物制备棘白菌素B(Echinocandin B)的方法。该方法经过曲霉属发酵代谢产物浸提、大孔树脂吸附、解吸、脱色、结晶等步骤，得到棘白菌素B粗提物，再借助Fracl ite800树脂对粗提物进行层析分离，得到高纯度的棘白菌素B产品。本发明的优点在于采用大孔吸附树脂提取分离棘白菌素B，工艺简单易行，适宜于工业化生产；并首次将Fraclite800用于棘白菌素B的层析分离，可以制备高纯度的产品。

Description

一种高纯度棘白菌素B的制备方法

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种高纯度棘白菌素B的制备方法。

背景技术

棘白菌素类是近年来新上市的一种抗真菌药物。棘白菌素类药作为新一代全身性抗真菌药，不经过肝代谢和肾清除，使联合用药以及肝、肾功能不良患者无需调整剂量成为可能。它们能够抑制真菌细胞中1，3-β-D葡聚糖的合成，具有毒性低和良好的动力学性质。其独特的作用靶点和确切显著的疗效，必将使其很快替代***类药成为医生和患者抗真菌药物的首选。

目前进入临床研究的此类药物有三种：卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净。阿尼芬净是第三代棘白菌素类的半合成抗真菌药，对治疗念珠菌和霉曲菌引起的严重感染具有广阔的前景。2006年2月21日，由辉瑞公司生产的阿尼芬净通过了美国FDA认证，用于治疗食管感染和其他形式的念珠菌感染。

阿尼芬净以发酵产物棘白菌素B(EchinocandinB)为原料，经犹他游动放线菌(Actinoplanesutahensis)产生的酰化酶作用脱去侧链亚油酰基，然后在DMF中与活性中间体4”-戊氧基-[1，1’，4’，1”]三苯基-4-甲酸-2，4，5-三氯-苯基酯反应制得。

EchinocandinB是曲霉菌属(Aspergillussp.)的发酵代谢产物，结构式如下：

目前，关于棘白菌素类药物提取分离的文献报道很少，且已有的制备方法具有工艺复杂，所得产品纯度不高、收率低等诸多缺点，难于实现规模化生产。辉瑞公司的科研人员对其进行过***研究，但在分离纯化工艺方面仅仅是实验室工艺的研究，尚没有成熟的能够直接应用于规模化生产的方法介绍。中国专利CN101659692A描述了EchinocandinB分离提取工艺的研究，该方法采取两种溶剂反复浓缩萃取，再借助树脂柱分离纯化EchinocandinB。其不足之处在于整个工艺须经三步填料柱纯化，工艺过于繁琐，难以放大；用酸性氧化铝对提取液进行脱色处理，成本较高；且整个工艺过程溶媒使用量较大、收率偏低，不利于工业化规模生产。

发明内容

本发明的目的在于开发一种操作简便，所用溶剂毒性低，适于工业化生产EchinocandinB的方法。本发明采用大孔吸附树脂提取分离EchinocandinB，工艺简单易行，适宜于工业化生产；并首次将Fraclite800树脂用于EchinocandinB的层析分离，可以制备高纯度的EchinocandinB产品。

下面对本发明进行具体描述：

在本发明方法中，通过固液分离去除杂质含量高的滤液，得到EchinocandinB发酵培养物。在发酵培养物中加入乙醇溶解EchinocandinB，收集乙醇提取液，并调低浓度后导入大孔吸附树脂进行富集，极性较大的杂质和小分子蛋白由于不被吸附而流出。饱和树脂用低浓度的乙醇净化洗涤后，用解吸剂解吸，收集的解吸液中加入活性炭脱色。脱色液经浓缩、萃取、结晶，得到EchinocandinB粗提物。粗提物经Fraclite800树脂层析分离，得到高纯度的EchinocandinB产品。

具体地，本发明涉及一种高纯度EchinocandinB的制备方法，包括下述步骤：

1)棘白菌素B发酵液固液分离，得到固形发酵培养物；

2)在固形发酵培养物中加入极性溶剂浸泡；

3)浸泡液固液分离，得到棘白菌素B提取液；

4)将调低极性溶剂浓度的提取液导入大孔吸附树脂进行富集；

5)吸附完毕，用梯度极性溶剂洗涤树脂，然后用解吸剂进行解吸；

6)解吸液脱色，搅拌均匀后过滤；

7)脱色液浓缩、萃取、结晶得棘白菌素B粗提物；

8)粗提物经Fraclite800层析分离，得到高纯度的棘白菌素B产品。

其中，步骤1)中的发酵培养物为通过传统的固液分离过程如离心、板框压滤等方式得到干燥的EchinocandinB发酵培养物。水溶性蛋白、发酵过程中产生的水溶性强的其他次级代谢产物等杂质存在于发酵液中，随着固液分离过程被舍弃。

步骤2)中向固形发酵培养物中加入极性溶剂乙醇或甲醇，加入的量为每千克固形发酵培养物2-6升，优选为4-6升。极性溶剂的浓度为70-90％，优选为70-80％。

步骤4)中的极性溶剂浓度应调至30-40％，大孔吸附树脂为HZ816、HZ830、DA201树脂，优选为HZ830树脂。吸附树脂的用量为提取液体积的1/33-1/10，优选为1/25-1/17。吸附流速为1-3BV/h，优选为1.5-2.5BV/h。

步骤5)中的洗涤剂为30-50％的乙醇溶液，优选为40％-50％的乙醇溶液。洗涤体积为2-6倍柱体积，优选为3-4倍柱体积；解吸剂为70-90％的乙醇溶液，优选为80％-90％的乙醇溶液。解吸流速为1/2-3BV/h，优选为1/2-1BV/h。

步骤6)中加入活性炭量为解吸液体积的0.5-2％，优选为0.5-1％。

步骤7)中脱色液浓缩后用乙酸乙酯萃取2-4遍，优选为萃取2-3遍，去离子水洗1遍；结晶溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、异丙醇或石油醚，优选为丙酮或石油醚。

步骤8)中洗脱溶剂为甲醇-水、乙醇-水或丙酮-水溶液，优选为甲醇-水或丙酮-水溶液；结晶液经传统的固液分离过程如离心、板框压滤等方式得到EchinocandinB粉末后，用真空干燥的方式在40-50℃条件下干燥24h，得到EchinocandinB产品。

本发明所得产品可供药品或食品使用，EchinocandinB的纯度可达98％以上，全程总收率大于65％。

本发明有如下优点：1.采用大孔吸附树脂对目的产物进行富集和纯化，进一步摒弃了发酵次级代谢产物的干扰，提高了目的产物的质量。2.Fraclite800树脂的应用，可以得到高纯度的EchinocandinB产品，且交叉部分所占比例很小。3.工艺简单，样品回收率高，全程总收率达到65％以上。4.全程所用溶剂均为常规溶剂，毒性小，适宜于工业化生产。

附图说明

图1实施例1EchinocandinB浸提液HPLC图谱

图2实施例1EchinocandinB粗提物HPLC图谱

图3实施例1EchinocandinB精粉HPLC图谱

具体实施方式

下述实施例仅用于阐述实现本发明的方法，不应理解为对本发明的限制。

本发明所使用的发酵液均为华药股份公司研发中心用微生物培养手段，得到的EchinocandinB发酵液。HZ816、HZ830、DA201树脂为上海华震科技有限公司生产，Fraclite800树脂为上海安澜德公司生产。甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、异丙醇、石油醚等试剂均为市售。本发明使用的高效液相色谱仪为996型检测器，515泵(Waters公司)。

实施例1

取EchinocandinB发酵液10.0L，发酵单位795μg/mL。发酵液经真空抽滤，得到3.2kg发酵培养物。在发酵培养物中加入6.4L浓度约70％的乙醇，机械搅拌1小时后真空抽滤，收集浸提液(见附图1)，将乙醇浓度调至30％，导入径高比为1∶6的HZ816树脂柱吸附，树脂装量为450mL，流速为0.5L/h。饱和树脂用30％-50％的乙醇梯度洗涤，然后用70％的乙醇解吸，解吸流速为500mL/h。解吸液中加入18g活性炭搅拌30min。过滤后的脱色液浓缩，用乙酸乙酯萃取，丙酮结晶，得到EchinocandinB粗提物9.6g(见附图2)。粗提物用Fraclite800树脂层析分离，甲醇-水梯度洗脱。洗脱液分段浓缩、萃取、结晶、干燥(温度45℃，真空度大于0.08Mpa)，最后得到EchinocandinB5.3g。提取总收率为65.7％，精粉HPLC含量为98.6％(见附图3)。

实施例2

取EchinocandinB发酵液20.0L，发酵单位811μg/mL。发酵液经真空抽滤，得到4.9kg发酵培养物。在发酵培养物中加入19.6L浓度约80％的甲醇，机械搅拌1小时后真空抽滤，收集浸提液(与附图1峰形相似)，将甲醇浓度调至35％，导入径高比为1∶6的HZ830树脂柱吸附，树脂装量为1.4L，流速为2L/h。饱和树脂用30％-50％的乙醇梯度洗涤，然后用80％的乙醇解吸，解吸流速为1.4L/h。解吸液中加入280g活性炭搅拌30min。过滤后的脱色液浓缩，用乙酸乙酯萃取，异丙醇结晶，得到EchinocandinB粗提物21.2g(与附图2峰形相似)。粗提物用Fraclite800树脂层析分离，乙醇-水梯度洗脱，最后得到EchinocandinB11.4g。提取总收率为69.2％，精粉HPLC含量为98.5％(与附图3峰形相似)。

实施例3

取EchinocandinB发酵液50.0L，发酵液单位736μg/mL。发酵液经真空抽滤，得到13.3kg发酵培养物。在发酵培养物中加入79.8L浓度约90％的乙醇，机械搅拌1小时后真空抽滤，收集浸提液(与附图1峰形相似)，将乙醇浓度调至40％，导入径高比为1∶6的DA201树脂柱吸附，树脂装量为18L，流速为25L/h。饱和树脂用30％-50％的乙醇梯度洗涤，然后用90％的乙醇解吸，解吸流速为18L/h。解吸液中加入720g活性炭搅拌30min。过滤后的脱色液浓缩，用乙酸乙酯萃取，石油醚结晶，得到EchinocandinB粗提物46g(与附图2峰形相似)。粗提物用Fraclite800树脂层析分离，丙酮-水梯度洗脱。最后得到EchinocandinB25.4g。提取总收率为67.7％，精粉HPLC含量为98.1％(与附图3峰形相似)。

Claims (5)

1.一种高纯度棘白菌素B的制备方法，包括下述步骤：

1)棘白菌素B发酵液固液分离，得到固形发酵培养物；

2)在固形发酵培养物中加入极性溶剂浸泡，其中极性溶剂为乙醇或甲醇；所述极性溶剂的浓度为70-90％；

3)浸泡液固液分离，得到棘白菌素B提取液；

4)将提取液极性溶剂浓度调低，导入大孔吸附树脂进行富集，所述大孔吸附树脂为HZ816、HZ830、DA201树脂中的一种；所述极性溶剂浓度调低至30-40％；

5)吸附完毕，用极性溶剂洗涤树脂，然后用解吸剂进行解吸；所述极性溶剂为30-50％的乙醇，所述解吸剂为70-90％的乙醇；

6)加入脱色物质对解吸液脱色，搅拌均匀后过滤；

7)脱色液浓缩、加入极性溶剂萃取、结晶得棘白菌素B粗提物；萃取所用极性溶剂为乙酸乙酯，结晶用极性溶剂为丙酮、异丙醇或石油醚中的一种；

8)粗提物经Fraclite800层析分离，利用层析溶剂洗脱，得到棘白菌素B湿粉；层析溶剂为甲醇-水、乙醇-水或丙酮-水中的一种；

9)棘白菌素B湿粉经真空干燥，得到高纯度的棘白菌素B产品。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)极性溶剂的加入量为每千克固形发酵培养物2-6升。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤4)大孔吸附树脂的用量为棘白菌素B提取液体积的1/10-1/33。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤6)中脱色物质为活性炭，加入量为解吸液体积的0.5-2％。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤9)中真空干燥条件为在40-50℃条件下干燥24小时。