CN102949345A - 重组人表皮生长因子阳离子脂质体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种重组人表皮生长因子阳离子脂质体及其制备方法，所述重组人表皮生长因子阳离子脂质体包括重组人表皮生长因子、阳离子脂质体及生长因子保护剂，部分的重组人表皮生长因子由所述阳离子脂质体包封住。所述制备方法包括：步骤S1：以无水乙醇溶解脂膜材料和阳离子附加剂，旋转蒸发，挥尽乙醇形成均匀脂膜，加入柠檬酸缓冲液并水化，得脂质体粗悬液；步骤S2：超声分散处理脂质体粗悬液，以微孔滤膜整粒，得空白脂质体；步骤S3：将重组人表皮生长因子溶液与生长因子保护剂溶液混合后加入空白脂质体溶液，调节pH至6.0~8.0，温育处理得重组人表皮生长因子阳离子脂质体。本发明以阳离子脂质体包封人表皮生长因子，可提高rhEGF的稳定性、组织相溶性和细胞亲和性。

Description

重组人表皮生长因子阳离子脂质体及其制备方法
技术领域
本发明涉及蛋白多肽的制剂和制备方法技术领域，具体涉及一种重组人表皮生长因子阳离子脂质体及其制备方法。 
背景技术
表皮细胞生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）是人体内的一种重要的活性蛋白多肽物质，是由53个氨基酸组成、分子量为6.2KD的活性多肽。美国科学家Cohen博士在人体中发现了EGF，并证明了EGF对皮肤的影响，揭开人体皮肤衰老的秘密。 
EGF在临床上的应用主要在：①加速烧伤、创伤、外科手术、溃疡等造成的创面愈合，尤其可促进难以治疗的糖尿病性溃疡的愈合；②加速角膜损伤、溃疡的愈合；③用于皮肤和角膜移植手术；④加速胃、十二指肠溃疡的愈合。另外，随着年龄增加人表皮细胞活性降低，逐渐引起皮肤的老化，而EGF可刺激表皮细胞生长起抗衰老作用，会明显使皮肤红润、光滑、细嫩、有弹性、帮助衰老表皮细胞脱落，加速新表皮细胞的合成。1992年，美国詹姆士药物实验室将EGF添加到化妆品中，开创运用EGF进行袪皱抗衰的生物美容新领域，标志着生物基因美容时代的到来。 
目前，市场上的EGF产品均存在着一定的缺陷，主要表现在以下几个方面：①EGF作为多肽、蛋白类药物，具有稳定性差、易于酶解、且药物体内半衰期短的缺点，为此，临床上常采用反复大剂量给药的方法来克服EGF的这些缺点，这不仅增加了患者的用药不便和痛苦，还增加用药成本；②EGF在常温下易失活性，需要在2-8℃条件下冷藏保存（rhEGF液体制剂即使在4℃下，也只能维持两个月），这也增加了药物的储运和使用成本；③做为皮肤外用的rhEGF常规制剂（如外用溶液剂）普遍存在易流失、生物利用度低、细胞及组织相溶性较差等缺点。 
发明内容
本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种重组人表皮生长因子阳离子脂质体及其制备方法，以获得稳定性好，药物体内半衰期长，生物利用度高且易储存的EGF产品。 
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种重组人表皮生长因子阳离子脂质体，包括重组人表皮生长因子、阳离子脂质体及生长因子保护剂，部分的重组人表皮生长因子由所述阳离子脂质体包封住。 
进一步地，所述生长因子保护剂为肝素钠、右旋糖酐或人血白蛋白。 
进一步地，所述重组人表皮生长因子阳离子脂质体包封率在40%以上。 
进一步地，所述重组人表皮生长因子阳离子脂质体的粒径为15-200nm。 
另一方面，本发明还提供一种制备上述重组人表皮生长因子阳离子脂质体的方法，制备步骤如下： 
步骤S1：以无水乙醇溶解脂膜材料和阳离子附加剂，然后旋转蒸发，挥尽乙醇，形成均匀脂膜，再加入柠檬酸缓冲液并水化处理，得到脂质体粗悬液；
步骤S2：超声分散处理脂质体粗悬液，再以微孔滤膜整粒，得到空白脂质体；
步骤S3：将重组人表皮生长因子溶液与生长因子保护剂溶液混合后加入空白脂质体溶液，调节pH至6.0~8.0，再温育处理得到重组人表皮生长因子阳离子脂质体。
进一步地，所述步骤S1中，所述脂膜材料为大豆卵磷脂和胆固醇的混合物，且大豆卵磷脂和胆固醇的质量比等于2:1-7:1；阳离子附加剂为十八烷胺，阳离子附加剂的用量为脂膜材料总质量的1%-6%；无水乙醇：脂膜材料等于1：40~1：10，单位为毫升：毫克；所述柠檬酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.05 moL/L，且脂膜材料：柠檬酸盐缓冲液等于10：1-40：1，单位为毫克：毫升；所述水化处理是在30~45℃水浴条件下水化处理0.5-4h。 
进一步地，所述步骤S2中，超声分散处理时间为2-10min。 
进一步地，所述步骤S3中，重组人表皮生长因子与生长因子保护剂的质量比为1：1-10：1。 
进一步地，所述步骤S3中，以浓度为0.05moL/L-0.2 moL/L的磷酸缓冲溶液调节pH。 
进一步地，所述步骤S3中，在25-45℃温度条件下温育10-40min。 
通过采用上述技术方案，本发明至少具有如下有益效果：本发明在制剂中加入了阳离子脂质体，利用脂质体的缓释作用，以脂质体作为经皮局部给药载体，rhEGF可以在表皮和真皮形成药物贮库，缓释药物，持久地对病变部位起作用。而且脂质体本身类似生物膜的凝脂双分子层结构可显著提高rhEGF的组织相溶性和细胞亲和性，降低毒副作用，提高疗效。 
rhEGF脂质体以脂质体作为rhEGF的载体，药物包裹在脂质小球中，可减少rhEGF与外界环境的直接接触，降低了温度、酸碱度、紫外线等因素的影响，也提高了rhEGF在使用时的稳定性。 
rhEGF在酸性环境下显负电荷，而阳离子脂质体还带有正电荷，通过静电作用可增加电性相反的药物离子的包封率及稳定性。同时，制备工艺上采用pH梯度主动载药法，可避免酸碱、温度及超声波等剧烈外界条件对表皮生长因子活性的影响。 
附图说明
图1是本发明重组人表皮生长因子阳离子脂质体的透射电镜照片。 
具体实施方式
本发明提供一种重组人表皮生长因子阳离子脂质体，包括重组人表皮生长因子、阳离子脂质体及生长因子保护剂，部分的重组人表皮生长因子由所述阳离子脂质体包封住。 
所述生长因子保护剂为肝素钠、右旋糖酐或人血白蛋白。 
所述重组人表皮生长因子阳离子脂质体包封率在40%以上。 
所述重组人表皮生长因子阳离子脂质体的粒径为15-200nm。重组人表皮生长因子阳离子的形状如图1所示。 
本发明还提供一种制备上述重组人表皮生长因子阳离子脂质体的方法，制备步骤如下： 
步骤S1：以无水乙醇溶解脂膜材料和阳离子附加剂，然后旋转蒸发，挥尽乙醇，再加入柠檬酸缓冲液并水化处理，得到脂质体粗悬液；
步骤S2：超声分散处理脂质体粗悬液，再以微孔滤膜整粒，得到空白脂质体；
步骤S3：将重组人表皮生长因子溶液与生长因子保护剂溶液混合后加入空白脂质体溶液，调节pH至6.0~8.0，再温育处理得到重组人表皮生长因子阳离子脂质体。
所述步骤S1中，所述脂膜材料优选为大豆卵磷脂和胆固醇的混合物，且大豆卵磷脂和胆固醇的质量比等于2:1-7:1；阳离子附加剂优选为十八烷胺，阳离子附加剂的用量为脂膜材料总质量的1%-6%；无水乙醇：脂膜材料等于1：40~1：10，单位为毫升：毫克；所述水化处理是在30~45℃水浴条件下水化处理0.5-4h。 
所述步骤S2中，超声分散处理时间优选为2-10min。 
所述步骤S3中，重组人表皮生长因子与生长因子保护剂的质量比为1：1-10：1。 
所述步骤S3中，优选以浓度为0.05moL/L-0.2 moL/L的磷酸缓冲溶液调节pH。 
所述步骤S3中，在25-45℃温度条件下温育10-40min。 
本发明，测定包封率的方法如下： 
采用超滤离心分离法分离rhEGF脂质体与游离药物：精密量取rhEGF脂质体样品溶液300μL，加PBS稀释至3.0mL，后加入超滤离心管中。待样品稳定平衡后，于离心机中离心分离，转速：5000 r/min，离心时间：20min。取1体积单位的下层超滤液测定其中的rhEGF含量，为游离rhEGF含量（C游离）。
取脂质体样品溶液30μL，PBS（pH=6.8）稀释至300μL，加入过量的NaCl，震摇。后加入氯仿900μL震摇混合均匀，离心分离，转速为8000rpm，时间10min，取1体积单位的上层清液，双蒸水稀释至浓度范围，测定其中的rhEGF含量，为脂质体中rhEGF总量（C总）。 
按如下公式计算脂质体包封率： 
脂质体包封率（En %）=（C总-C游离）/C总
C游离：未包入脂质体中rhEGF的量；
C总：制剂中rhEGF的总量。
下面结合几个实施例对本发明作进一步阐述，但本发明不局限于如下阐述的这些实施例。以下实施例中，所使用的人表皮生长因子购于广州暨鹏生物有限公司（纯度>95%）。 
实施例1
按处方量10mL单位计，处方如下：
人表皮细胞生长因子       0.5mg
大豆卵磷脂               300mg
胆固醇                   100mg
十八烷胺                  50mg
无水乙醇                  10mL
0.03moL/L柠檬酸缓冲液     7mL
0.1moL/L磷酸盐缓冲液      1mL
0.5mg/mL肝素钠溶液        1mL
制备过程如下：按照以上处方用量称取大豆卵磷脂、胆固醇和十八烷胺，溶于10mL无水乙醇中，于50℃水浴减压旋转蒸发，抽至无水乙醇挥尽，形成均匀薄膜；加入7mL 0.03moL/L的柠檬酸溶液，50℃恒温水浴温育，超声分散处理10min，以0.22μm微孔滤膜整粒；然后再将1.0mL的rhEGF原液（0.5mg/mL）与1.0mL肝素钠溶液混合后加入，并以磷酸盐缓冲溶液调节pH值至7.2，40℃孵育10min，即得为淡黄色均一液体的成品制剂。
经检测，包封率为50.42%；且4℃保存1个月后，包封率为50.21%。 
实施例2
按处方量10mL单位计，处方如下：
人表皮细胞生长因子       0.5mg
大豆卵磷脂               500mg
胆固醇                   100mg
十八烷胺                  50mg
无水乙醇                  10mL
0.03moL/L柠檬酸缓冲液     7mL
0.1moL/L磷酸盐缓冲液      3mL
0.5mg/mL肝素钠溶液        1mL
制备过程如下：按照以上处方用量称取大豆卵磷脂、胆固醇和十八烷胺，溶于10mL无水乙醇中，于50℃水浴减压旋转蒸发，抽至无水乙醇挥尽，形成均匀薄膜；加入7mL 0.03moL/L的柠檬酸溶液，50℃恒温水浴温育，超声分散处理10min，以0.22μm微孔滤膜整粒；然后再将1.0mL的rhEGF原液（0.5mg/mL）与1.0mL肝素钠溶液混合后加入，并以磷酸盐缓冲溶液调节pH值至6.8，40℃孵育20min，即得为淡黄色均一液体的成品制剂。
经检测，包封率为62.54%；且4℃保存1个月后，包封率为62.16%。 
实施例3
按处方量10mL单位计，处方如下：
人表皮细胞生长因子       0.5mg
大豆卵磷脂               400mg
胆固醇                   100mg
十八烷胺                  50mg
无水乙醇                  10mL
0.02moL/L柠檬酸缓冲液     7mL
0.1moL/L磷酸盐缓冲液      1mL
0.5mg/mL右旋糖酐溶液      1mL
制备过程如下：按照以上处方用量称取大豆卵磷脂、胆固醇和十八烷胺，溶于10mL无水乙醇中，于50℃水浴减压旋转蒸发，抽至无水乙醇挥尽，形成均匀薄膜；加入7mL 0.02moL/L的柠檬酸溶液，50℃恒温水浴温育，超声分散处理10min，过0.22μm微孔滤膜整粒；然后再将1.0mL的rhEGF原液（0.5mg/mL）与1.0mL右旋糖酐溶液混合后加入，并以磷酸盐缓冲溶液调节pH值至7.2，40℃孵育10min，即得为淡黄色均一液体的成品制剂。
经检测，包封率为55.13%；且4℃保存1个月后，包封率为50.14%。 
实施例4
按处方量10mL单位计，处方如下：
人表皮细胞生长因子       0.5mg
大豆卵磷脂               400mg
胆固醇                   100mg
十八烷胺                  50mg
无水乙醇                  10mL
0.02moL/L柠檬酸缓冲液     7mL
0.1moL/L磷酸盐缓冲液      1mL
20mg/L人血白蛋白溶液    50μL
制备过程如下：按照以上处方用量称取大豆卵磷脂、胆固醇和十八烷胺，溶于10mL无水乙醇中，于50℃水浴减压旋转蒸发，抽至无水乙醇挥尽，形成均匀薄膜；加入7mL 0.02moL/L的柠檬酸溶液，50℃恒温水浴温育，超声分散处理10min，过0.22μm微孔滤膜整粒；然后再将1.0mL的rhEGF原液（0.5mg/mL）与50μL人血白蛋白溶液混合后加入，并以磷酸盐缓冲溶液调节pH值至7.2，40℃孵育10min，即得为淡黄色均一液体的成品制剂。
经检测，包封率为58.66%；且4℃保存1个月后，包封率为58.25%。 

Claims (10)

1. 一种重组人表皮生长因子阳离子脂质体，其特征在于，其包括重组人表皮生长因子、阳离子脂质体及生长因子保护剂，部分的重组人表皮生长因子由所述阳离子脂质体包封住。
2. 根据权利要求1所述的重组人表皮生长因子阳离子脂质体，其特征在于：所述生长因子保护剂为肝素钠、右旋糖酐或人血白蛋白。
3. 根据权利要求1所述的重组人表皮生长因子阳离子脂质体，其特征在于：所述重组人表皮生长因子阳离子脂质体包封率在40%以上。
4. 根据权利要求1所述的重组人表皮生长因子阳离子脂质体，其特征在于：所述重组人表皮生长因子阳离子脂质体的粒径为15-200nm。
5. 一种制备如权利要求1~4任一项所述的重组人表皮生长因子阳离子脂质体的方法，其特征在于，制备步骤如下：
步骤S1：以无水乙醇溶解脂膜材料和阳离子附加剂，然后旋转蒸发，挥尽乙醇，形成均匀脂膜，再加入柠檬酸缓冲液并水化处理，得到脂质体粗悬液；
步骤S2：超声分散处理脂质体粗悬液，再以微孔滤膜整粒，得到空白脂质体；
步骤S3：将重组人表皮生长因子溶液与生长因子保护剂溶液混合后加入空白脂质体溶液，调节pH至6.0~8.0，再温育处理得到重组人表皮生长因子阳离子脂质体。
6. 根据权利要求5所述的制备重组人表皮生长因子阳离子脂质体的方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述脂膜材料为大豆卵磷脂和胆固醇的混合物，且大豆卵磷脂和胆固醇的质量比等于2:1-7:1；阳离子附加剂为十八烷胺，阳离子附加剂的用量为脂膜材料总质量的1%-6%；无水乙醇：脂膜材料等于1：40~1：10，单位为毫升：毫克；所述柠檬酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.05 moL/L，且脂膜材料：柠檬酸盐缓冲液等于10：1-40：1，单位为毫克：毫升；所述水化处理是在30~45℃水浴条件下水化处理0.5-4h。
7. 根据权利要求5所述的制备重组人表皮生长因子阳离子脂质体的方法，其特征在于：所述步骤S2中，超声分散处理时间为2-10min。
8. 根据权利要求5所述的制备重组人表皮生长因子阳离子脂质体的方法，其特征在于：所述步骤S3中，重组人表皮生长因子与生长因子保护剂的质量比为1：1-10：1。
9. 根据权利要求5所述的制备重组人表皮生长因子阳离子脂质体的方法，其特征在于：所述步骤S3中，以浓度为0.05moL/L-0.2 moL/L的磷酸缓冲溶液调节pH。
10. 根据权利要求5所述的制备重组人表皮生长因子阳离子脂质体的方法，其特征在于，所述步骤S3中，在25-45℃温度条件下温育10-40min。
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