CN102942617A - 一种猪链球菌密度感应***阻断多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种猪链球菌密度感应***阻断多肽及其应用。该多肽的氨基酸序列如序列号1所示，本发明的多肽能够与密度感应***中的LuxS作用，并特异性干扰LuxS/AI-2密度感应***，在体外能抑制信号分子AI-2的产生，起到显著降低猪链球菌感染动物的作用。本发明的阻断因子是一种蛋白质，有两种获得该蛋白的途径，可以人工合成，也可以通过原核表达获得。此外，本发明的阻断因子是一种分泌性小肽，可以对多种细菌中的密度感应***做出干扰，作用范围广泛。

Description

一种猪链球菌密度感应***阻断多肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种猪链球菌密度感应***阻断多肽及其应用。
背景技术
密度感应( quorum sensing，QS)是指微生物群体在其生长过程中，由于群体密度的增加，导致其生理和生化特性的变化，显示出少量菌体或单个菌体所不具备的特征（Fuqua WC, Winans SC, Greenberg EP (1994) Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. J Bacteriol 176: 269-275）。它是细菌彼此之间传递信号的一种特殊机制，利用一种激素样的化合物作为信号分子(autoinducer，AI)来调节细菌基因的表达（Lerat E, Moran NA (2004) The evolutionary history of quorum-sensing systems in bacteria. Mol Biol Evol 21: 903-913）。随着细菌密度的增加，信号分子浓度也随之增加，当信号分子的浓度也达到一定的水平，通过包括受体蛋白在内相关蛋白的信号传递，诱导或抑制信号最终传递到胞内，影响特定基因的表达，调控微生物群体的生理特征，如生物发光、抗生素合成、生物被膜形成等。利用 QS 机制进行“细胞对细胞的交流”，微生物能够在复杂的环境中协调一致，以“团队作战能力”使整个种群更好地存活下来（Swift S, Downie JA, Whitehead NA, Barnard AM, Salmond GP, et al. (2001) Quorum sensing as a population-density-dependent determinant of bacterial physiology. Adv Microb Physiol 45: 199-270.）。
近年来的研究发现了另一种新型的细菌群体感应机制，即由LuxS蛋白参与合成的AI-2型信号分子介导的种间群体感应。LuxS基因是产生AI-2分子所必需的，在许多革兰氏阴性和阳性菌中都存在高度保守的LuxS类似物。AI-2是唯一的细菌非特异性信号分子，细菌可以利用AI-2感知其它细菌数量来调节自身行为，参与对其他种属细菌的群体感应，从而在同一个生存环境中协调自身基因的表达。由于在革兰氏阴性菌与阳性菌中广泛存在，故被看作细菌种群间的***。目前细菌与细菌之间的信息交流已成为微生物研究的热点，现已发现细菌的许多生理功能都受LuxS/AI-2***的调节，包括细菌发光，抗生素的合成，质粒的转移，毒力的变化，基因的表达，生物被膜的形成等。在复杂的调控网络中LuxS所起的作用不仅有正调控还有负调控。
由于使用抗生素带来种种弊端，迫切需要找到一种能够替代抗生素的东西来控制致病菌。目前认为通过干扰致病菌的QS***是一种行之有效的新手段。因此QS已成为农业、医学和环境领域的研究热点之一。由于QS控制细菌许多病基因的表达, 因此任何能够阻止QS信号分子集聚或受体识别信号分子的过程都可以阻断依赖细菌QS的毒力基因表达。群体淬灭（Quenching quorum-sensing）是通过干扰微生物细胞间的QS***，阻止QS依赖型基因表达而防御病原菌感染的一种现象。目前已发现的群体淬灭主要有竞争性抑制和信号分子降解两种方式。由于QS介导的是微生物病原性，干扰QS体系不会对病原菌产生选择压力，因此，这使得对QS猝灭剂和抑制机制的研究具有潜在的意义。
猪链球菌(Streptococcus suis, SS)是猪的重要致病菌，可以引起脑膜炎、败血症、心内膜炎、关节炎、肺炎等疾病，也可导致生猪从业人员感染和死亡。猪群带菌率接近100%，而致死率能达到近20%。由猪链球菌引起的猪链球菌病给我国养殖业和生猪从业人员带来了极大的威胁。
发明内容
本发明目的在于提供一种猪链球菌密度感应***阻断多肽不仅能够抑制猪链球菌，而且能够消除抗生素所带来的种种弊端。
本发明采取的技术方案是：一种猪链球菌密度感应***阻断多肽及其应用，所述多肽具有用序列号1表示的氨基酸序列，序列号1表示的序列为：TTMHSIRTNRHN。
所述阻断多肽体外抑制猪链球菌AI-2分子产生的应用。
所述阻断多肽提高动物体内机体抵抗细菌感染的应用。
猪链球菌密度感应***阻断蛋白的表达：将质粒pCDNA3.1用HindIII/XhoI双酶切后与寡聚核苷酸P（5-AGCTT ACCACCATGCACCCAATCCGCACCGACCGCCACGACC-3）用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，得到携带有序列号1中氨基酸序列质粒的工程菌。
本发明具有以下优点：
1.本发明的阻断因子能够与密度感应***中的LuxS作用，并特异性干扰LuxS/AI-2密度感应***，在体外能抑制信号分子AI-2的产生，起到显著降低猪链球菌感染实验动物的作用。
2.本发明的阻断因子是一种蛋白质，有两种获得该蛋白的途径，可以人工合成，也可以通过原核表达高效获得。
3.本发明的阻断因子是一种分泌性小肽，可以对多种细菌中的密度感应***做出干扰，因而其作用范围广泛。
具体实施方式
下面对本发明的实施例做详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
载体pCDNA3.1（+）购自invitrogen公司；限制性内切酶、连接酶等试剂购自TAKARA公司；S腺苷同型半胱氨酸（SAM）购自sigma公司。质粒提取、DAN纯化、DNA回收试剂盒购自天根生物科技有限公司。
实施例1
一种猪链球菌密度感应***阻断多肽，其氨基酸序列为TTMHSIRTNRHN。
猪链球菌密度感应***阻断多肽的构建方法：表达猪链球菌密度感应***阻断多肽的质粒pCDNA-P构建：将质粒pCDNA3.1用HindIII/XhoI双酶切后与寡聚核苷酸P（5-AGCTT ACCACCATGCACCCAATCCGCACCGACCGCCACGACC-3）用T4DNA连接酶室温连接2-4小时，将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，并涂布于含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB固体培养基上培养30小时，挑取转化子，提取质粒，即为质粒pCDNA-P，具有序列号1中氨基酸序列。
实施例2 
多肽抑制猪链球菌信号分子AI-2实验。
SRH的制备：将1 mg/mL纯化的Pfs重组蛋白与1 mM SAM在10 mM磷酸钠（sodium phosphate buffer， pH 7.5）缓冲液中，37°C作用1小时，反应液用Millpore(10,000 Da cutoff)的超滤膜，进行超滤，去除反应液中的蛋白。滤液即为SRH，滤液冻存于-80°C。
将人工合成的多肽溶于10mM磷酸钠缓冲液中，同时加入纯化的重组蛋白LuxS，37℃作用1小时，加入1mM SRH, 37℃作用1小时，反应液用Millpore（100000Da cutoff）的超滤膜，进行超滤，去除反应液中的蛋白。取适量滤液用100mM磷酸钠，0.1mM EDTA，pH 7.2缓冲液作20倍稀释。取200ul上述稀释液，加入100ul的5mM Ellman’s试剂（DTNB,溶于100mM磷酸钠，0.1mM EDTA，pH 7.2缓冲液），37°C作用15min，在412nm的波长下测光吸收值。
表1多肽抑制性实验
Figure 2012104613265100002DEST_PATH_IMAGE001
符号“-” 表示在酶和底物SAH或者SRH作用时没有加入合成多肽。
符号“+”表示加入合成多肽到LuxS和SRH到反应体系中。
 实验结果：由表1结果表明，多肽能显著抑制LuxS催化SRH生成AI-2，加入多肽后，AI-2的浓度从200μmol降低到50μmol，抑制效率为75%（LuxS中不加多肽催化SRH形成AI-2的能力设定为100%）。
 实施例3 
猪链球菌密度感应***阻断因子的应用。
猪链球菌悬液的制备。在THB培养基（Oxioid）中培养猪链球菌至OD600为08，然后离心（5000g，4℃）10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为1×106 cfu/ml，即为猪链球菌悬液。
将10只CD1小鼠随机分为2组，每组5只，分布命名为A和B组。将A组的每只小鼠肌肉注射200μL含有15-20μg混有实施例1中的质粒pCDNA-P的PBS。将B组的每只小鼠同样肌肉注射200μl含有15-20μg的质粒pCDNA3.1的PBS。10天后将两组每只腹腔注射200μl上述步骤1）获得的猪链球菌悬液，48小时后取肝脏、脾脏和血液做倍比稀释后涂布于THB固体培养基上培养32-48小时，菌落计数。结果为B组菌落数量在肝脏、脾脏和血液中分别是A组的15、9和22倍。结果表明猪链球菌在表达LuxS/AI-2密度感应***阻断因子的小鼠体内的感染能力显著下降。
上述实施例结果表明，本发明的阻断因子能够与密度感应***中的LuxS作用，并特异性干扰LuxS/AI-2密度感应***，在体外能抑制信号分子AI-2的产生，起到显著降低猪链球菌感染实验动物的作用。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  河南科技大学
 
<120>  一种猪链球菌密度感应***阻断多肽及其应用
 
<130>  2012
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  Artificial Sequence
 
<400>  1
 
Thr Thr Met His Ser Ile Arg Thr Asn Arg His Asn
1                        5                           10 

Claims (3)

1.一种猪链球菌密度感应***阻断多肽，其特征在于：所述多肽具有用序列号1表示的氨基酸序列，序列号1表示的序列为：TTMHSIRTNRHN。
2.根据权利要求1所述的一种猪链球菌密度感应***阻断多肽的应用，其特征在于：所述阻断多肽用于在体外抑制猪链球菌AI-2分子的产生。
3.根据权利要求1所述的一种猪链球菌密度感应***阻断多肽的应用，其特征在于：所述阻断多肽用于提高动物体内机体抵抗细菌感染。
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CN106957353A (zh) * 2017-03-22 2017-07-18 河南科技大学 一种能够广谱抗菌的新型多肽及其应用

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朱松雷等: "铜绿假单胞菌密度感应***的研究进展", 《重庆医学》, vol. 40, no. 27, 30 September 2011 (2011-09-30), pages 2794 - 2796 *

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