CN102942516B - 一种生物碱类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物碱类化合物及其制备方法和应用，特点是该生物碱类化合物的结构如（I）所示，制备方法包括将假交替单胞菌保藏号为CGMCC No.6555划线接种到固体斜面培养基上，于30℃，培养1天后，接种1个菌落到EM培养基中，于30℃，150rpm下摇床培养7天，获得发酵产物的步骤；将发酵产物去除菌体，获得发酵液，取发酵液加入等体积的乙酸乙酯充分萃取3次，合并萃取液，用旋转蒸发仪将乙酸乙酯去除，获得粗浸膏的步骤；最后将粗浸膏用甲醇溶解后，用半制备反相高效液相色谱进行分离纯化得到生物碱类化合物的步骤，优点是该生物碱类化合物具有抑制细胞活性，抗肿瘤作用。

Description

一种生物碱类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种生物碱类化合物，尤其是涉及一种生物碱类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
吲哚生物碱类化合物是生物碱类化合物的最大的家族，可治疗呼吸、消化、心血管、中枢神经和肿瘤等广泛疾病。目前主要从植物中提取获得，很少从细菌中发现。本发明人研究得知，海洋细菌Pseudoalteromonas rubra.QD1-2（保藏于国家***第三海洋研究所，保藏编号为：CGMCC No.1k00044）液体发酵产物经乙酸乙酯提取，提取物有很好的细胞增殖抑制活性，于是对其活性成分进行了研究。目前尚未见该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有抑制肿瘤细胞增殖，具有抗肿瘤活性的生物碱类化合物及其制备方法和用途。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种生物碱类化合物，该生物碱类化合物的结构式如下所示，
一种生物碱类化合物的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）发酵生产
将假交替单胞菌（Pseudoal terommonaas rubra.QD1-2）保藏号为CGMCCNo.6555划线接种到Zobell2216E固体斜面培养基上，于30℃培养箱中培养1天后；将斜面培养获得的菌落接种1个菌落到400ml EM培养基中，于30℃，转速150rpm的条件下摇床培养7天，获得发酵产物；
（2）浸膏的获得
将发酵产物用离心机离心去除菌体，获得发酵液，取发酵液加入等体积的乙酸乙酯充分萃取1次，收集萃取液，再取萃余液加入等体积的乙酸乙酯重复萃取1次，收集萃取液，再将获得的萃余液加入等体积的乙酸乙酯重复萃取1次，合并三次萃取所得萃取液，用旋转蒸发仪将乙酸乙酯去除，获得粗浸膏；
（3）化合物的分离精制
将粗浸膏用甲醇溶解后，用半制备反相高效液相色谱进行分离纯化得到生物碱类化合物，其结构如下所示：
所述的Zobell2216E培养基的配制方法如下：蛋白胨5.0g,酵母膏1.0g,磷酸铁0.01g,琼脂16.0g，陈海水1000ml，调pH至7.6-7.8。
所述的EM培养基的配制方法如下：蛋白胨1g，酵母粉2g，葡萄糖0.1g，天然海水1000ml。
所述的半制备反相高效液相色谱的洗脱液为甲醇与水按体积55:45的比例混合而成。
一种生物碱类化合物的应用，所述的生物碱类化合物具有抑制肿瘤作用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种生物碱类化合物及其制备方法和用途，通过微生物发酵培养来获取吲哚生物碱类化合物的发酵物，然后将发酵产物用乙酸乙酯提取，得粗浸膏，将该提取物经反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，该生物碱类化合物具有抑制细胞活性，抗肿瘤作用。
上述假交替单胞菌（Pseudoalteromonaas rubra.QD1-2），该菌为QD1-2菌株，保藏编号为CGMCC No.6555，于2012年09月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种生物碱类化合物结构式如Ⅰ所示。
实施例2
如I式所示的生物碱类化合物的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）发酵生产
将假交替单胞菌（Pseudoalteromonas rubra.QD1-2）保藏号为CGMCCNo.6555划线接种到Zobell2216E固体斜面培养基上，于30℃培养箱中培养1天后；将斜面培养获得的菌落接种1个菌落到400ml EM培养基中，于30℃，转速150rpm的条件下摇床培养7天，获得发酵产物；
（2）浸膏的获得
将发酵产物用离心机离心去除菌体，获得发酵液，取发酵液加入等体积的乙酸乙酯充分萃取1次，收集萃取液，再取萃余液加入等体积的乙酸乙酯重复萃取1次，收集萃取液，再将获得的萃余液加入等体积的乙酸乙酯重复萃取1次，合并三次萃取所得萃取液，用旋转蒸发仪将乙酸乙酯去除，获得粗浸膏；
（3）化合物的分离精制
将粗浸膏用甲醇溶解后，用半制备反相高效液相色谱进行分离纯化得到生物碱类化合物，其结构如下所示：
所述的Zobell2216E培养基的配制方法如下：蛋白胨5.0g,酵母膏1.0g,磷酸铁0.01g,琼脂16.0g，陈海水1000ml，调pH至7.6-7.8。
所述的EM培养基的配制方法如下：蛋白胨1g，酵母粉2g，葡萄糖0.1g，天然海水1000ml。
所述的半制备反相高效液相色谱的洗脱液为甲醇与水按体积55:45的比例混合而成。
在此具体实施例中，Zobell 2216E培养基的配制方法如下：蛋白胨5.0g,酵母膏1.0g,磷酸铁0.01g,琼脂16.0g，陈海水1000ml,调pH至7.6-7.8；EM培养基的配制方法如下：蛋白胨1g，酵母粉2g，葡萄糖0.1g，天然海水1000ml；半制备反相高效液相色谱的洗脱液为甲醇与水按体积55:45的比例混合而成。
该化合物Ⅰ淡黄色粉末，分子式C13H15BrN2O，HR-ESI-MS m/z：295.0379[M+H]+，297.0357[M+H]+，计算值294.0368和296.0347，1H和13C-NMR数据见表1。
表1化合物Ⅰ的1H和13C NMR数据（400和100MHz，in CD3OD）
实施例3
体外抗肿瘤活性的测试（细胞增殖抑制活性测试）
（1）实验样品
被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离纯化的化合物Ⅰ纯品，精密称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供测活性。
细胞系及细胞的继代培养采用人胃腺癌BGC-823细胞、人***Hela细胞以及人肝癌HepG2细胞等癌细胞系，各种细胞均用10%BCS的1640培养基，在37℃于通入0.5%二氧化碳的培养箱中继代培养。
（2）实验方法
细胞增殖抑制活性测试方法：四氮唑盐（MTT）法取对数生长期的人胃腺癌BGC-823细胞、人***Hela细胞以及人肝癌HepG2细胞，将细胞用胰酶消化后，调节密度为2～3×104个/孔，添加于96孔板中，每孔195微升，置于37℃、0.5％CO2培养箱中培养24小时，然后加入不同浓度样品溶液到96孔板中，在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，以甲醇作为阴性对，37℃、0.5％CO2培养箱中培养48小时；取出96孔板，每孔加入20微升MTT(四甲基偶氮唑盐)（5mg/ml），继续培养4小时；弃培养液，每孔加入150微升DMSO(二甲基亚砜)，37℃振荡6min，492nm处测定各孔的光吸收，取三孔平均OD值按IR（%）＝（OD阴性对照－OD样品）/OD阴性对照×100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率（IR%）。
（3）实验结果
在MTT法测试中，不同浓度的化合物Ⅰ对人胃腺癌BGC-823细胞、人***Hela细胞以及人肝癌HepG2细胞的增殖抑制结果分别见表2。
表2不同浓度的化合物Ⅰ对癌细胞增殖的抑制率（%）
由上表可知化合物Ⅰ具有明显的肿瘤细胞增殖抑制作用，可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂用于抗肿瘤的研究。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种生物碱类化合物的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：
(1)发酵生产
将假交替单胞菌(Pseudoalteromonas rubra.QD1-2)保藏号为CGMCCNo.6555划线接种到Zobell2216E固体斜面培养基上，于30℃培养箱中培养1天后；将斜面培养获得的菌落接种1个菌落到400ml EM培养基中，于30℃，转速150rpm的条件下摇床培养7天，获得发酵产物；所述的EM培养基的配制方法如下：蛋白胨1g，酵母粉2g，葡萄糖0.1g，天然海水1000ml；
(2)浸膏的获得
将发酵产物用离心机离心去除菌体，获得发酵液，取发酵液加入等体积的乙酸乙酯充分萃取1次，收集萃取液，再取萃余液加入等体积的乙酸乙酯重复萃取1次，收集萃取液，再将获得的萃余液加入等体积的乙酸乙酯重复萃取1次，合并三次萃取所得萃取液，用旋转蒸发仪将乙酸乙酯去除，获得粗浸膏；
(3)化合物的分离精制
将粗浸膏用甲醇溶解后，用半制备反相高效液相色谱进行分离纯化得到生物碱类化合物，其结构如下所示：
2.根据权利要求1所述的一种生物碱类化合物的制备方法，其特征在于所述的Zobell2216E培养基的配制方法如下：蛋白胨5.0g,酵母膏1.0g,磷酸铁0.O1g,琼脂16.0g，陈海水1000ml，调pH至7.6-7.8。
3.根据权利要求1所述的一种生物碱类化合物的制备方法，其特征在于：所述的半制备反相高效液相色谱的洗脱液为甲醇与水按体积55:45的比例混合而成。
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