CN102935068B - 一种包载水溶性药物的脂质体制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包载水溶性药物的脂质体制备方法，将水溶性药物溶于明胶、胶原或白蛋白等含氨基酸结构的高分子亲水胶体中，加入泊洛沙姆混匀后，形成W/W型胶体溶液，冷冻干燥，形成的冻干粉转入含有脂质材料的叔丁醇溶液中，分散均匀后再次冷冻干燥，形成高包封率的包载水溶性药物的脂质体。该脂质体制备方法利用W/W型胶体结合二次冻干的制剂技术解决已有包载水溶性药物的脂质体制备方法对于水溶性药物载药量小、包封率低和稳定性差的问题。该方法适用制备包载水溶性药物的脂质体，尤其适用于制备包载热稳定性差或大分子药物的脂质体，也可以用于掩盖药物的苦味或臭味、与其他组分相隔离。

Description

一种包载水溶性药物的脂质体制备方法

【技术领域】

本发明属于药物制剂学领域，更具体地说，本发明涉及一种脂质体及其制备方法。

【背景技术】

脂质体(1iposomes)是一种由排列有序的脂质双分子层组成的单层或多层微囊。脂质体属于胶体***，具有类似细胞的结构，与细胞膜亲和力强，可以增加被包封药物透过细胞膜的能力。脂质体生物相容性好，可实现药物体内靶向递送，具有延长药物作用时间、增加药物的体内外稳定性、降低药物毒性，增强药理作用等诸多优点。

理想的脂质体需要达到以下要求：（1）脂质体形态圆整且不聚集，可以通过制备方法有效控制粒径范围，实现药物的缓控释作用和靶向递送的目的；（2）脂质体稳定性高，可以长期放置；（3）脂质体具有较高的包封率和载药量，尤其对于热稳定性差药物或水溶性生物大分子药物；（4）脂质体容易实现灭菌或无菌操作。

脂质体的制备方法有多种，如机械分散法、薄膜分散法、逆相蒸发法、复乳法、熔融法、注入法、冷冻干燥法、表面活性剂处理法、钙融合法、载体沉积法等。其中，逆相蒸发法、结合反复融冻法技术的冷冻干燥法是包载水溶性药物的较好方法。但是，已有的包载水溶性药物的脂质体制备方法尚存在不足，例如逆相蒸发法需要长时间的热处理过程，不适于热稳定性差的蛋白多肽类药物，并且制备过程中有机溶剂容易残留，潜在危害性大。结合反复融冻法技术冷冻干燥方法容易实现无菌化操作，得到的脂质体冻干粉稳定性好，但结合反复融冻法技术的冷冻干燥方法制备出来的脂质体冻干粉遇水形成脂质体溶液时，粒径通常增大数倍，形态不圆整且容易聚集，无法有效控制粒径范围，存在安全性问题。

发明专利“一种制备脂质体的新方法”（申请号03111470.9）公开了一种制备脂质体的新方法，其权利要求项1为：“一种制备脂质体的新方法，其特征在于:a.制备一单相溶液，其溶质为：(1)用于形成脂质体的脂质、待包封的物质，或(2)用于形成脂质体的脂质、待包封的物质和水溶性载体，所述水溶性载体为蔗糖、乳糖或甘露醇;其溶剂由叔丁醇和水组成，叔丁醇和水的体积比大于1:3。b.冷冻单相溶液除去溶媒，得到冻干产物，将得到的冻干产物水化得到脂质体”。

发明专利“一种制备脂质体的新方法”（申请号03111470.9）虽然利用了叔丁醇为溶液的冷冻干燥工艺，但明确强调：(1)水溶性载体为蔗糖、乳糖或甘露醇；(2)冷冻干燥前必须得到单相溶液体系。该发明专利制备得到的脂质体冻干粉溶解于水中形成的脂质体粒径虽然小，但结构依然是传统的单室脂质体，因为蔗糖、乳糖或甘露醇等小分子水溶性物质容易透过脂质膜溶解到溶出介质中。此外该发明制备的脂质体由于内部的小分子水溶性载体溶解后产生高渗透压，因此存在水溶性药物快速渗漏的问题，并且该发明药物包封率较低（实施例5为21%，实施例6为40%），无法满足中国药典2010版对于脂质体包封率（大于85%）的要求。

发明专利CN201210022488.9公开一种胶核脂质体冻干粉和制备方法，该脂质体具有本发明类似的结构，但是制备方法是将1份高分子亲水胶体材料溶解在10-200份水中，加入0.05-50份水溶性药物，混匀形成水相；将0.5-50份脂质材料、2-100份乳化剂和10-1000份冻干支持剂溶解在50-4000份叔丁醇中，形成油相；将水相分散到油相中形成W/O型乳液，超声、高速搅拌或高压均质处理形成W/O型微乳溶液，采用超低温速冻工艺形成固体分散体，冷冻干燥除去叔丁醇，形成脂质体冻干粉。发明专利CN201010131339.7公开了一种包载药物脂质体的制备方法：将水溶性药物与两亲性高分子材料溶解于水相体系中，进行第一次冷冻干燥处理，然后将包含水溶性药物的冻干粉与脂质体成膜材料均匀分散于有机相体系中，进行第二次冷冻干燥方法，制成包载水溶性药物的脂质体。发明专利CN201010131244.5公开了一种包载药物脂质体的制备方法：将药物分散于溶解或熔融状态的两亲性高分子材料体系中，急速降温处理得到药物固体分散体，然后将药物固体分散体与脂质体成膜材料均匀分散于有机相体系中，按照脂质体制备方法，制成包载药物的脂质体。以上三个发明专利，部分解决了脂质体包载药物的制备工艺中存在的稳定性差或操作复杂等问题，但是操作时间控制要求较高、或需要加热熔融处理等，增加了对大分子药物的破坏，同时增加了批量制备的操作控制难度。

总之，已有包载水溶性药物的脂质体制备方法大多采用乳剂体系或复乳剂体系，并需要经过长时间的热处理过程，由于大分子水溶性药物耐热性差、油水界面的易聚集等特点，应用的这类方法制备的包载水溶性药物的脂质体不能保证药物的活性，特别是大分子药物的活性。此外，这类方法制备的包载水溶性药物的脂质体存在微粒易聚集、药物载药量低、包封率低，突释效应明显等问题，采用主动载药技术可以适度提高药物的包封率，但是主动载药技术需要透析除盐等步骤，操作时间长且重现性差，也不适于水溶性药物的脂质体的大规模制备。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是针对现有的脂质体制备方法的不足之处，提供一种适于包载水溶性药物的脂质体制备技术，将水溶性药物溶于明胶、胶原或白蛋白等含氨基酸结构的高分子亲水胶体中，加入泊洛沙姆（Poloxamer）混匀后形成W/W型胶体溶液,冷冻干燥，形成的冻干粉转入含有脂质材料的叔丁醇溶液中，分散均匀后再次冷冻干燥，形成高包封率的包载水溶性药物的脂质体。该脂质体制备方法利用二次冻干技术解决已有包载水溶性药物的脂质体制备方法对于水溶性药物载药量小、包封率低和稳定性差的问题，制备得到的载药脂质体粒径处于纳米级、分散均匀、载药量大、药物包封率高、药物释放缓慢。该方法适用制备包载水溶性药物的脂质体，尤其适用于制备包载热稳定性差的药物和蛋白、多肽、多糖等大分子药物的脂质体，达到缓控释给药或靶向递送给药的目的，也可以用于掩盖苦味或臭味、与其他组分隔离、减少药物刺激作用、液体药物转换为固体形式等制剂目的，可应用于注射、口服、黏膜、皮肤、创面、腔道的局部或全身治疗的多种剂型。

发明人在长期试验中发现：①明胶、胶原或白蛋白等含氨基酸结构的高分子亲水胶体溶液对于水溶性药物具有较好的吸纳能力，但很难长期保存，当含氨基酸结构的高分子亲水胶体与泊洛沙姆（Poloxamer）混匀后可以形成W/W型胶体溶液，大分子药物容易分散于含氨基酸结构的高分子亲水胶体溶液组成的内水相；②利用冷冻干燥将W/W型胶体溶液制成的冻干粉有利于药物的稳定；③泊洛沙姆（Poloxamer）是很好的冷冻干燥支持剂，冻干工艺得到的脂质体稳定性高；④W/W型胶体溶液制成的冻干粉再次分散于磷脂溶液中形成的脂质体粒径小且稳定性高。发明人经过大量实验，创新性地将“W/W型胶体溶液技术”和“二次冷冻干燥工艺”有机融合成一体，集成了胶体的高载药量、冷冻干燥工艺的高稳定性等特点，探索出一种适于包载水溶性药物的脂质体制备技术，克服传统脂质体包载水溶性药物存在的载药量低、药物包封率低、突释效应明显等问题。

本发明的脂质体制备方法的关键技术组合为：①制备含氨基酸结构的高分子亲水胶体与泊洛沙姆（Poloxamer）混匀后形成W/W型胶体溶液，大分子药物容易分散于含氨基酸结构的高分子亲水胶体溶液的内水相；②采用冷冻干燥工艺将内相容纳大分子药物的W/W型高分子胶体溶液制成冻干粉，有利于保持药物的高度分散状态并维持稳定性；③容纳水溶性药物的亲水胶体冻干粉转入含有脂质材料的叔丁醇溶液中，利用超声技术使磷脂材料充分包裹亲水胶体为核心的微粒，形成混悬溶液体系，并通过调节超声强度或叔丁醇用量控制粒子大小；⑤二次冷冻干燥，形成高包封率的包载水溶性药物的脂质体冻干粉，临用前注入注射用溶媒，形成包载水溶性药物的脂质体溶液，解决大分子药物稳定性差的问题。

以牛血清白蛋白为例，实验组：按照质量计算，将1份明胶溶解在1000份水中，加入5份牛血清白蛋白和100份Poloxamer 188，混匀形成亲水胶体溶液I，冷冻干燥，形成冻干粉I。将5份氢化蛋黄磷脂、10份聚氧乙烯氢化蓖麻油溶解在200份叔丁醇中，形成叔丁醇溶液I。将冻干粉I加入到叔丁醇溶液I中，超声（60KHz）处理1min，分散均匀，液氮中冻结形成固体，冷冻干燥形成包载牛血清白蛋白的脂质体冻干粉。

发明人设置了对照试验进行观察，对照试验组如下：

对照试验组1（不加明胶）：按照质量计算，将5份牛血清白蛋白和200份Poloxamer188溶解于1000份水，混匀，形成亲水胶体溶液I，冷冻干燥，形成冻干粉I。将5份氢化蛋黄磷脂、10份聚氧乙烯氢化蓖麻油溶解在200份叔丁醇中，形成叔丁醇溶液I。将冻干粉I加入到叔丁醇溶液I中，超声（60KHz）处理1min，分散均匀，液氮中冻结形成固体，冷冻干燥形成包载牛血清白蛋白的脂质体冻干粉。

对照试验组2（亲水胶体中不加泊洛沙姆）：按照质量计算，将1份明胶溶解在1000份水中，加入5份牛血清白蛋白，混匀形成亲水胶体溶液I，冷冻干燥，形成冻干粉I。将5份氢化蛋黄磷脂、10份聚氧乙烯氢化蓖麻油溶解在200份叔丁醇中，形成叔丁醇溶液I。将冻干粉I加入到叔丁醇溶液I中，超声（60KHz）处理1min，分散均匀，液氮中冻结形成固体，冷冻干燥形成包载牛血清白蛋白的脂质体冻干粉。

对照试验组3（仅一次冷冻干燥处理）：按照质量计算，将1份明胶溶解在1000份水中，加入5份牛血清白蛋白和200份Poloxamer 188，混匀形成亲水胶体溶液I。将5份氢化蛋黄磷脂、10份聚氧乙烯氢化蓖麻油溶解在200份叔丁醇中，形成叔丁醇溶液I。将亲水胶体溶液I加入到叔丁醇溶液I中，超声（60KHz）处理1min，分散均匀，液氮中冻结形成固体，冷冻干燥形成包载牛血清白蛋白的脂质体冻干粉。

对照试验组4，依据发明专利CN201210022488.9方法制备脂质体，具体方法：按照质量计算，将1份明胶溶解在1000份水中，加入5份牛血清白蛋白混匀形成水相；将5份氢化蛋黄磷脂、10份聚氧乙烯氢化蓖麻油和200份Poloxamer 188溶解在500份叔丁醇中，形成油相；将水相分散到油相中形成W/O型乳液，80KHz超声处理2min形成W/O型微乳溶液，采用液氮速冻工艺形成固体分散体，冷冻干燥除去叔丁醇，形成脂质体冻干粉。

对照试验组5，依据发明专利CN201010131339.7方法制备脂质体，具体方法：按照质量计算，200份聚维酮溶解于1000份水中，加入5份牛血清白蛋白溶解，-30℃冷冻5小时，冷冻干燥得到固态冻干品；将5份氢化蛋黄磷脂、2份胆固醇、0.5份吐温80溶解在500份叔丁醇中，形成油相；将上述的固态冻干品分散到油相中，加入200份甘露醇，超声（80KHz）处理2min使分散均匀，冷冻干燥得到脂质体冻干粉。

对照试验组6，依据发明专利CN201010131244.5方法制备脂质体，具体方法：按照质量计算，200份聚维酮在65℃水浴中熔融，加入5份牛血清白蛋白分散均匀，转至0℃冰浴中骤冷处理，形成固体分散体；将5份氢化蛋黄磷脂、2份胆固醇、0.5份吐温80溶解在500份叔丁醇中，形成油相；将上述的固体分散体分散到油相中，加入200份甘露醇，超声（80KHz）处理2min使分散均匀，冷冻干燥得到脂质体冻干粉。

结果发现，实验组的牛血清白蛋白脂质体冻干粉溶解于2000份注射用水中，脂质体粒径较小（平均粒径=810nm），微观形态圆整，分散均匀，放置24小时没有明显变化（图1）。采用葡聚糖凝胶分离法结合牛血清白蛋白特异性检测试剂盒测定包封率，实验组的牛血清白蛋白脂质体包封率达到95.4%，并且放置30min后测定，牛血清白蛋白脂质体没有突释效应。

对照试验组1（不加高分子亲水胶体）的牛血清白蛋白脂质体冻干粉溶解于2000份注射用水中，脂质体初始粒径较小，但聚集速度快，容易形成大粒子（>2μm），初始包封率达到86.2%，但药物渗漏严重，存在明显突释效应。

对照试验组2（亲水胶体中不加泊洛沙姆）的牛血清白蛋白脂质体冻干粉溶解于2000份注射用水中，粒径较大（>2μm），形状不圆整，且分布不均匀，脂质体包封率为89.6%。

对照试验组3（仅一次冷冻干燥处理）的牛血清白蛋白脂质体冻干粉溶解于2000份注射用水中，脂质体粒径大（>2μm），形状不圆整，脂质体包封率为70.2%。

对照试验组4（发明专利CN201210022488.9方法）在将水相分散到油相中形成W/O型乳液的制备操作中，必须采用较高功率的超声处理才能形成W/O型微乳溶液。制备得到的牛血清白蛋白脂质体冻干粉溶解于2000份注射用水中，脂质体粒径较大（平均粒径=980nm），微观形状不十分圆整，脂质体包封率为88.2%。

对照试验组5（发明专利CN201010131339.7方法）在将固态冻干品分散到油相中的制备操作中，必须采用较高功率的超声处理才能使溶液分散均匀。制备得到的牛血清白蛋白脂质体冻干粉溶解于2000份注射用水中，脂质体粒径较大（平均粒径=1.1μm），微观形状不十分圆整，脂质体包封率为86.1%。

对照试验组6（发明专利CN201010131244.5方法）在将固体分散体分散到油相中的制备操作中，必须采用较高功率的超声处理才能使溶液分散均匀，制备得到的牛血清白蛋白脂质体冻干粉溶解于2000份注射用水中，脂质体粒径分布范围较宽，平均粒径较大（平均粒径=1.5μm），微观形状呈不规则形状，脂质体包封率为85.7%。

实验结果表明，本发明的脂质体制备方法的关键技术组合缺一不可。对比现有技术，本发明创新采用的“W/W型胶体溶液技术”和“二次冷冻干燥工艺”结合技术，更好地保证大分子蛋白类药物的活性，提高了操作的可控性，降低了处理过程的难度，尤其降低了形成W/O型微乳溶液所需的机械处理强度（如超声时间和功率），也提高了载药脂质体圆整性和包封率。

此外，发明人将实验组的亲水胶体溶液I中的泊洛沙姆用量和水量、叔丁醇溶液I中的叔丁醇量都增加1倍，其余步骤不变，得到的包载牛血清白蛋白的脂质体平均粒径为550nm，表明通过制备过程中泊洛沙姆用量或溶液体积的调节，可以控制脂质体的粒径。

此外，实验组的一些组分的不同型号或用量对实验结果不产生影响，例如磷脂材料采用氢化磷脂或合成磷脂，形成的载药脂质体的粒径和包封率保持一致；泊洛沙姆原料采用Poloxamer 188或Poloxamer 407等不同型号，形成的载药脂质体的粒径和包封率保持一致；实验组制备的牛血清白蛋白脂质体冻干粉溶解于1000份-50000份注射用水中，形成的载药脂质体的粒径和包封率保持一致。因此，可以根据临床实际需要，选择合适的磷脂材料、泊洛沙姆型号或注射用水量。

实验中还发现，传统脂质体需要大量磷脂材料才能包载一定的药物，药物：磷脂的质量比例最低不少于1:5，而本发明的药物：磷脂的质量比例可以达到1:1甚至更低，节约了磷脂的用量，显著提高脂质体的载药能力。此外，本发明制备工艺简便，不需要采用pH梯度或硫酸铵梯度法即可制备高包封率载药脂质体，省去除盐和高压均质等复杂的操作过程，容易实现无菌化操作。

由此，一种包载水溶性药物的脂质体制备方法，其制备过程包含以下过程：

a.以质量配比计算，将1份含氨基酸结构的高分子亲水胶材料加入500-5000份水形成溶液，加入0.5-50份水溶性药物和20-500份泊洛沙姆溶解，形成含有药物的W/W型亲水胶体溶液，冷冻干燥，形成冻干粉I；

b.以质量配比计算，将1-50份脂质材料，5-500份聚氧乙烯氢化蓖麻油，溶解在500-10000份叔丁醇中，采用超声或水浴加热的处理方法加速溶解，形成叔丁醇溶液I；

c.将冻干粉I加入到叔丁醇溶液I中，分散均匀，形成叔丁醇溶液II，液氮或冰箱中冻结形成固体，冷冻干燥形成包载水溶性药物的脂质体冻干粉II，灌装于西林瓶中密封保存，临用前注入1000-50000份药学公知的注射用溶媒，形成包载水溶性药物的脂质体溶液。

上述的含氨基酸结构的高分子亲水胶材料包括明胶、胶原和人血白蛋白。

上述的水溶性药物是指单独应用、配合增溶剂应用或在特定pH值范围内药物溶解度大于0.01mg/ml的生物大分子药物、化学药物、中药有效提取物、医学或生物学领域应用的诊断试剂。

上述的生物大分子药物是指蛋白质、多肽、多糖、酶、辅酶、核酸结构的药物及它们的生物降解或衍生产物，包括生长因子、激素、刺激因子、抗体、疫苗、干扰素、白介素、动植物来源的多糖。

上述的水溶性药物包括：胰岛素、水蛭素、血管内皮生长抑制因子、神经营养因子、细胞生长因子、成骨生长因子、乳铁转运蛋白、干扰素、荧光蛋白、奥沙利铂，卡铂，奈达铂、阿柔比星、多柔比星、表柔比星、米托蒽醌、博莱霉素、平阳霉素、丝裂霉素、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、达沙替尼、阿立必利、阿扎司琼、昂丹司琼、氯磷酸、美司钠、利妥昔单抗、替伊莫单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、阿那曲唑，氨鲁米特，福美坦，依西美坦、替尼泊苷、依托泊苷，喷司他丁、伊立替康、白消安、氮芥、卡莫斯丁、罗莫司丁、高三尖杉酯碱、门冬酰胺酶、培门冬酶、阿糖胞苷、氟脲苷、吉西他滨、西地尼布、阿伦膦酸钠、瑞舒伐他汀、抗凝血酶、卡莫氟、多西他赛、长春地辛、长春新碱、紫杉醇、索拉菲尼、地西他滨、丙卡巴肼、尼莫地平、硝苯地平、尼群地平、非洛地平、双氯灭痛、萘普生、***马多、***、***、可乐定、单硝酸异山梨醇酯、盐酸噻氯匹啶、乙酰唑胺、对乙酰氨基酚、氨茶碱、阿米替林、氨苄西林、羟氨苄青霉素、阿司匹林、贝克拉胺、咖啡因、西咪替丁、***、樟脑、氯霉素、氯非那敏、盐酸氯丙嗪、氯贝特、氯唑西林、磷酸可待因、***、右美沙芬、布洛芬、盐酸苯海拉明、盐酸多西环素、依普拉酮、芬氟拉明、柠檬酸亚铁、富马酸亚铁、硫酸亚铁、东莨菪碱、伪麻黄碱、黄连素、吲哚美辛、左旋多巴、碳酸锂、盐酸甲氯芬酯、甲喹酮、甲基安非太明、乙酰螺旋霉素、呋喃妥因、去甲替林、那可丁、盐酸帕努拉明、非那西丁、保泰松、盐酸苯福明、盐酸***醇、***龙、普鲁卡因胺、溴丙胺太林、盐酸右丙氧芬、***、硫酸奎尼尔、硫利达嗪、葡萄糖酸锌、磺胺托嘧啶、四环素、链霉素、庆大霉素、三氟美嗪、阿利马嗪、维生素、核磁造影剂、同位素。

上述的脂质材料是指药学公知的磷脂和类脂材料，包括天然卵磷脂、氢化磷脂、合成磷脂及其聚乙二醇修饰衍生物、饱和脂肪酸甘油酯、甾体。

上述的制备过程a的含有药物的亲水胶体溶液中还可以加入0.1-50份药学公认的水溶性抗氧剂、稳定剂、pH调节剂，其中稳定剂包括：人血清白蛋白、酒石酸、琥珀酸、胆酸、脱氧胆酸、富马酸、枸橼酸、棕榈酸、氨基酸。

上述的制备过程b的叔丁醇溶液I中还可以加入0.1-50份药学公认的油溶性抗氧剂、有机酸及其酯，其中有机酸包括：甲酸、乙酸、酒石酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸。

上述的一种包载水溶性药物的脂质体制备方法，其特征在于：制备的载药脂质体冻干粉临用前根据需要注入1000-50000份药学公知的注射用溶媒，形成粒径在100nm-1000nm范围内的载药脂质体。

上述的脂质体通过选用不同类型的磷脂或类脂材料组合，制成PEG修饰的长循环脂质体、pH敏感脂质体、温度敏感脂质体、表面带正电荷的脂质体，更好地发挥胃肠道内定位释药或体内血循环靶向释药作用。

上述的脂质体是单独使用或组合到制剂处方中应用，通过注射、口服、黏膜、皮肤、创面、腔道途径给药，发挥治疗、诊断、预防、免疫、清洗、消毒、美容、保健的应用。

本发明的一种包载水溶性药物的脂质体制备方法，具有下述优点：（1）该脂质体制备工艺创新性地将“W/W胶体技术”和“二次冷冻干燥工艺”有机融合成一体，集成了胶体的高载药量和高分散性、冷冻干燥工艺的高稳定性等特点，避免药物受热，实现了包载药物的脂质体的高度分散和粒径均匀性；（2）该脂质体制备工艺有效提高了传统脂质体冷冻干燥制备工艺的效率，减少冻干操作复杂性。（3）本发明脂质体的药物：磷脂的质量比例可以达到1:1甚至更低，节约了磷脂的用量，显著提高脂质体的载药能力；（4）本发明制备工艺简便，不需要采用pH梯度或硫酸铵梯度法即可制备高包封率脂质体，省去透析除盐等复杂操作过程，容易实现无菌化操作；（5）可以通过调节亲水胶体配比、叔丁醇用量等控制脂质体粒径；（6）本发明制备的脂质体粒径在纳米范围内，并可以有效控制粒径，有利于药物穿透皮肤、黏膜或体内生物膜屏障，适用范围广，可应用于多种剂型，满足注射、口服、黏膜、皮肤、创面、腔道的局部或全身治疗的需要。（7）本发明的脂质体可作为缓控释给药体系或靶向递送给药***，也可以用于掩盖苦味或臭味、与其他组分隔离、减少药物刺激作用、液体药物转换为固体形式等制剂目的。

【附图说明】

图1：包载牛血清白蛋白脂质体的微观形态（平均粒径=810nm）

图2：包载水溶性药物脂质体制备流程示意图

【具体实施方式】

现结合下列实例来进一步描述本发明。

实施例1：胰岛素脂质体

本实施例制备胰岛素脂质体，胰岛素脂质体组成如表1。

表1胰岛素脂质体组分配比

胰岛素脂质体冻干粉制备方法：如图2流程所示所示，按照以上各组分的质量配比，分别称取组分，将高分子亲水胶体材料加入水中形成溶液，加入胰岛素、泊洛沙姆（Poloxamer）、附加剂I溶解，形成含有药物的亲水胶体溶液，冷冻干燥，形成冻干粉I。将脂质材料、聚氧乙烯氢化蓖麻油、附加剂II溶解在60℃叔丁醇中，混匀形成叔丁醇溶液I。将冻干粉I加入到叔丁醇溶液I中，20KHz超声2min，形成叔丁醇溶液II，液氮中速冻形成固体，冷冻干燥25h形成包载水溶性药物的脂质体冻干粉II，灌装于西林瓶中密封保存。

粒径分析：取各处方得到的脂质体冻干粉100mg，加入2ml注射用水形成脂质体溶液，应用库尔特粒径分析仪测定平均粒径。

结果：所制备的脂质体，处方1的胰岛素脂质体平均粒径为915nm，处方2的胰岛素脂质体平均粒径为742nm，处方3的胰岛素脂质体平均粒径为286nm，处方4的胰岛素脂质体平均粒径为220nm，处方5的胰岛素脂质体平均粒径为120nm，处方6-11的胰岛素脂质体粒径分别为：970nm，290nm，950nm，265nm，890nm和280nm。结果表明调节叔丁醇和冻干支持剂的用量可以控制脂质体粒径。叔丁醇和冻干支持剂的用量越大，脂质体的粒径越小。

实施例2：生长激素脂质体

本实施例制备生长激素脂质体，生长激素脂质体组成如表2。

表2生长激素脂质体组分配比

生长激素脂质体冻干粉制备方法：按照以上各组分的质量配比，分别称取组分，将高分子亲水胶体材料加入水中形成溶液，加入生长激素、泊洛沙姆、附加剂I溶解，形成含有生长激素的亲水胶体溶液，冷冻干燥，形成冻干粉I。将脂质材料、聚氧乙烯氢化蓖麻油、附加剂II溶解在叔丁醇中，55℃水浴加热，形成叔丁醇溶液I。将冻干粉I加入到叔丁醇溶液I中，超声（60KHz）1min，形成叔丁醇溶液II，液氮中速冻形成固体，冷冻干燥25h形成包载生长激素的脂质体冻干粉II，灌装于西林瓶中密封保存。

实施例3：生长激素脂质体的质量评价

本实施例利用实施例2制备的生长激素脂质体进行质量评价。

微观形态和粒径分析：取100mg脂质体冻干粉加入2ml水形成脂质体溶液，分别吸取一定量的脂质体混悬液并用1%磷钨酸染色，置于扫描电镜下观察脂质体的形态特征，应用库尔特粒径分析仪测定脂质体粒径。

包封率测定：取1ml脂质体溶液，上样于Sephadex G-50凝胶柱，以蒸馏水为洗脱液，接取不同体积的洗脱部分，分离接收游离的生长激素洗脱部分，利用HPLC法分析含量，采用“包封率（%）=[（生长激素总量-游离的生长激素量）/生长激素总量]×100”公式计算生长激素脂质体的包封率。

实验结果见表3，可见本发明制备的生长激素脂质体具有较好的粒径分布和微观形态，包封率高（均超过90%），且无突释效应。此外，处方3制备的生长激素脂质体表面带明显的正电荷（表面电位约+42mv），其它处方的脂质体表面带微弱的负电荷（表面电位约-16mv）。

表3生长激素脂质体的质量评价

注：根据中华人民共和国药典（2010版）规定，脂质体、微球等微粒在开始0.5h内的释放量大于40％，则存在突释效应。

实施例4:盐酸阿霉素脂质体的制备

本实施例制备盐酸阿霉素脂质体，盐酸阿霉素脂质体组成如表4。

表4盐酸阿霉素脂质体组分配比

注：DPPC为二棕榈酰磷脂酰胆碱；DSPC为磷酯二硬脂酰磷脂酰胆碱；MSPC为肉豆蔻酰硬脂酰卵磷脂；DSPE-PEG2000为PEG2000修饰的磷酯二硬脂酰磷脂酰胆碱。

盐酸阿霉素脂质体冻干粉制备方法：按照以上各组分的质量配比，分别称取组分，将高分子亲水胶体材料加入水中形成溶液，加入盐酸阿霉素、Poloxamer、附加剂I溶解，形成含有盐酸阿霉素的亲水胶体溶液，冷冻干燥，形成冻干粉I。将脂质材料、聚氧乙烯氢化蓖麻油、附加剂II溶解在叔丁醇中，90KHz超声30s，形成叔丁醇溶液I。将冻干粉I加入到叔丁醇溶液I中，50KHz超声1min，形成叔丁醇溶液II，液氮中速冻形成固体，冷冻干燥25h形成包载盐酸阿霉素的脂质体冻干粉II，灌装于西林瓶中密封保存。

处方2和3制备的是长循环脂质体，处方4和5制备的是温敏脂质体。

对照组1--薄膜分散法制备盐酸阿霉素脂质体：称取氢化蛋黄磷脂400mg，胆固醇100mg，用20ml***溶解转移至梨形瓶中，旋转蒸发成膜，并继续减压旋转蒸发15min至***除尽，加入1mg/ml盐酸阿霉素溶液10ml，水化1h后，于探头超声下超声15min，过0.22μm滤膜4次，整粒，得到盐酸阿霉素脂质体溶液，加入甘露醇1g，冷冻干燥，得到盐酸阿霉素脂质体冻干粉。

对照组2--硫酸铵梯度法制备盐酸阿霉素脂质体冻干粉：称取氢化蛋黄磷脂400mg，胆固醇100mg，用20ml***溶解转移至梨形瓶中，加入250mmol/L的硫酸铵溶液10ml，超声3min成初乳，减压旋转蒸发20min至***除尽，于探头超声下超声15min，过0.22μm滤膜4次,整粒，得空白脂质体液10ml，除去此空白脂质体外水相中的盐，再向其中加入盐酸阿霉素药物粉末10mg，搅拌2min后，静置20min，得到盐酸阿霉素脂质体溶液，加入甘露醇1g，冷冻干燥，得到盐酸阿霉素脂质体冻干粉。

对照组3--逆相蒸发法制备盐酸阿霉素脂质体冻干粉：称取氢化蛋黄磷脂400mg，胆固醇100mg，用20ml***溶解转移至梨形瓶中，加入1mg/ml盐酸阿霉素水溶液10ml，超声3min成初乳，减压旋转蒸发20min至***除尽，于探头超声下超声15min，挤压通过0.22μm滤膜4次，得到盐酸阿霉素脂质体溶液，加入甘露醇1g，冷冻干燥，得到阿霉素脂质体冻干粉。

实施例5:盐酸阿霉素脂质体的质量评价

本实施例利用实施例4的处方和对照组制备的盐酸阿霉素脂质体进行质量对比。

微观形态和粒径分析：同实施例3。

包封率测定：取100mg脂质体冻干粉加入2ml水形成脂质体溶液，上样于SephadexG-50凝胶柱，以蒸馏水为洗脱液，接取不同体积的洗脱部分，分离接收包载盐酸阿霉素的脂质体洗脱部分，加入Triton-100破坏盐酸阿霉素脂质体，提取阿霉素制成阿霉素溶液，利用HPLC方法检测阿霉素含量（色谱条件：Venusil MP C18柱(416mm×250mm,5μm)，流动相为乙腈-甲醇-10mmol·L^-1磷酸盐缓冲液(36∶32∶32)，UV检测波长为230nm，流速为1.0mL/min）。采用“包封率（%）=[（包载的盐酸阿霉素量）/盐酸阿霉素总量]×100”公式计算盐酸阿霉素脂质体的包封率。

释药行为测定：取200mg脂质体冻干粉加入2ml水形成脂质体溶液，装入截留分子量3500的透析袋内，两端扎牢，应用溶出仪按照2010版药典规定的方法测定释放度。溶出介质为0.25%十二烷基硫酸钠和10%的乙醇溶液800ml，温度为37±0.5℃，搅拌速度为100r/min，定时取样5ml，并及时补充等温等体积空白介质，样品0.22μm微孔滤膜过滤后HPLC测定峰面积。计算样品各时间点盐酸阿霉素脂质体累计释放量。处方4和5为温度敏感脂质体，释药行为测定方法同上，但是溶出介质温度设定为37℃、40℃和43℃三个水平，并以处方1为对照。

实验结果见表5：本发明的7个处方制备的盐酸阿霉素脂质体形态圆整，无聚团现象，平均粒径小且粒径分布较窄，实验组包封率达到90%以上，远高于对照组，处方1-3所制备的长循环脂质体，处方4和5为温度敏感脂质体。药物释放实验表明，处方1、2、3、6和7比对照组具有较好的缓释作用，释放时间大于8h，处方4和5的温度敏感脂质体在37℃时24h累积释放量在80-100%之间，当温度提高到40℃或43℃时释放速率明显加快，43℃4h时释放量接近100%，因此处方4和处方5制备得到的温度敏感脂质体具有良好的热敏性能，适用于结合热疗的肿瘤靶向给药。

表5盐酸阿霉素脂质体的质量评价

实施例6:盐酸拓扑替康脂质体的制备和释药行为测定

盐酸拓扑替康脂质体冻干粉制备方法：盐酸拓扑替康脂质体的处方组成和制备方法同实施例4的处方2，只是将包载的药物阿霉素换为盐酸拓扑替康。

释药行为测定：同实施例5。

实验结果：盐酸拓扑替康脂质体形态圆整，无聚团现象，平均粒径为905nm，粒径分布窄，包封率达到93.2%。药物释放实验表明，盐酸拓扑替康脂质体具有和实施例5处方2的阿霉素脂质体相似的释药行为，具有较好的缓释作用。

实施例7:灵芝多糖脂质体

本实施例制备灵芝多糖脂质体，灵芝多糖脂质体组成如表6。

灵芝多糖脂质体冻干粉制备方法：按照以上各组分的质量配比，分别称取组分，将高分子亲水胶体材料加入水中形成溶液，加入灵芝多糖、Poloxamer、附加剂I溶解，形成含有灵芝多糖的亲水胶体溶液，冷冻干燥，形成冻干粉I。将脂质材料、聚氧乙烯氢化蓖麻油、附加剂II溶解在叔丁醇中，50℃水浴加热，形成叔丁醇溶液I。将冻干粉I加入到叔丁醇溶液I中，超声（50KHz）1min，形成叔丁醇溶液II，液氮中速冻形成固体，冷冻干燥25h形成包载灵芝多糖的脂质体冻干粉II，灌装于西林瓶中密封保存。

微观形态和粒径分析：方法同实施例3。

包封率测定：取100mg脂质体冻干粉加入1ml水形成脂质体溶液，上样于SephadexG-50凝胶柱，以蒸馏水为洗脱液，接取不同体积的洗脱部分，分离接收游离的灵芝多糖洗脱部分，利用硫酸蒽酮比色法测定游离的灵芝多糖含量，采用“包封率（%）=[（灵芝多糖总量-游离的灵芝多糖量）/灵芝多糖总量]×100”公式计算灵芝多糖脂质体的包封率。

结果：三个处方制备的灵芝多糖脂质体具有较好的粒径，平均粒径小于1000nm，无聚团现象，三个处方制备的灵芝多糖脂质体的包封率均超过90%。

表6灵芝多糖脂质体组分配比

实施例8:bFGF脂质体

本实施例制备碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）脂质体，bFGF脂质体组成如表7。

表7bFGF脂质体组分配比

bFGF脂质体冻干粉制备方法：按照以上各组分的质量配比，分别称取组分，将高分子亲水胶体材料加入水中形成溶液，加入bFGF、Poloxamer、附加剂I溶解，形成含有bFGF的亲水胶体溶液，冷冻干燥，形成冻干粉I。将脂质材料、聚氧乙烯氢化蓖麻油、附加剂II溶解在叔丁醇中，超声（70KHz）1min，形成叔丁醇溶液I。将冻干粉I加入到叔丁醇溶液I中，超声（50KHz）1min，形成叔丁醇溶液II，液氮中速冻形成固体，冷冻干燥25h形成包载bFGF的脂质体冻干粉II，灌装于西林瓶中密封保存。

微观形态和粒径分析：取200mg脂质体冻干粉加入2ml水形成脂质体溶液，微观形态和粒径分析方法同实施例3，各处方制备的bFGF脂质体具有较好的粒径，平均粒径小于950nm，无聚团现象。此外，处方8制备的bFGF脂质体表面带明显的正电荷（表面电位约+32mv），其它处方的脂质体表面带微弱的负电荷（表面电位约-15mv）。

实施例9:重组人血管内皮抑制素脂质体

本实施例制备重组人血管内皮抑制素脂质体，重组人血管内皮抑制素脂质体组成同如表8。

表8重组人血管内皮抑制素脂质体组分配比

重组人血管内皮抑制素脂质体冻干粉制备方法：重组人血管内皮抑制素脂质体冻干粉制备方法：按照以上各组分的质量配比，分别称取组分，将高分子亲水胶体材料加入水中形成溶液，加入重组人血管内皮抑制素、Poloxamer、附加剂I溶解，形成含有重组人血管内皮抑制素的亲水胶体溶液，冷冻干燥，形成冻干粉I。将脂质材料、聚氧乙烯氢化蓖麻油、附加剂II溶解在叔丁醇中，形成叔丁醇溶液I。将冻干粉I加入到叔丁醇溶液I中，超声（50KHz）1min，形成叔丁醇溶液II，液氮中速冻形成固体，冷冻干燥25h形成包载重组人血管内皮抑制素的脂质体冻干粉II，灌装于西林瓶中密封保存。

微观形态和粒径分析：取200mg脂质体冻干粉加入2ml水形成脂质体溶液，微观形态和粒径分析方法同实施例3，各处方制备的重组人血管内皮抑制素脂质体具有较好的粒径，平均粒径小于900nm，无聚团现象。

实施例10:转化生长因子β（TGF-β）脂质体

本实施例制备转化生长因子β（TGF-β）脂质体，TGF-β脂质体组成如表9。

表9TGF-β脂质体组分配比

TGF-β脂质体冻干粉制备方法：按照以上各组分的质量配比，分别称取组分，将高分子亲水胶体材料加入水中形成溶液，加入TGF-β、Poloxamer、附加剂I溶解，形成含有TGF-β的亲水胶体溶液，冷冻干燥，形成冻干粉I。将脂质材料、聚氧乙烯氢化蓖麻油、附加剂II溶解在叔丁醇中，形成叔丁醇溶液I。将冻干粉I加入到叔丁醇溶液I中，超声（50KHz）1min，形成叔丁醇溶液II，液氮中速冻形成固体，冷冻干燥25h形成包载TGF-β的脂质体冻干粉II，灌装于西林瓶中密封保存。

微观形态和粒径分析：取200mg脂质体冻干粉加入2ml水形成脂质体溶液，微观形态和粒径分析方法同实施例3，各处方制备的TGF-β脂质体具有较好的粒径，无聚团现象，处方1和处方2制备的TGF-β脂质体平均粒径为768nm，处方3制备的TGF-β脂质体平均粒径418nm。。

实施例11:人干扰素α2b脂质体

本实施例制备人干扰素α2b脂质体，人干扰素α2b脂质体组成如表10。

表10人干扰素α2b脂质体组分配比

人干扰素α2b脂质体冻干粉制备方法：按照以上各组分的质量配比，分别称取组分，将高分子亲水胶体材料加入水中形成溶液，加入人干扰素α2b、Poloxamer、附加剂I溶解，形成含有人干扰素α2b的亲水胶体溶液，冷冻干燥，形成冻干粉I。将脂质材料、聚氧乙烯氢化蓖麻油、附加剂II溶解在叔丁醇中，形成叔丁醇溶液I。将冻干粉I加入到叔丁醇溶液I中，超声（50KHz）1min，形成叔丁醇溶液II，液氮中速冻形成固体，冷冻干燥25h形成包载人干扰素α2b的脂质体冻干粉II，灌装于西林瓶中密封保存。

微观形态和粒径分析：取200mg脂质体冻干粉加入2ml水形成脂质体溶液，微观形态和粒径分析方法同实施例3，各处方制备的人干扰素α2b脂质体具有较好的粒径，无聚团现象，处方1和处方2制备的人干扰素α2b脂质体平均粒径为863nm和802nm，处方3制备的人干扰素α2b脂质体平均粒径874nm。

实施例12:伪麻黄碱脂质体的制备

本实施例以中药有效成分伪麻黄碱为对象，制备伪麻黄碱脂质体，制剂组成如表11。

表11伪麻黄碱脂质体组分配比

伪麻黄碱脂质体冻干粉制备方法：按照以上各组分的质量配比，分别称取组分，将高分子亲水胶体材料加入水中形成溶液，加入伪麻黄碱、Poloxamer、附加剂I溶解，形成含有伪麻黄碱的亲水胶体溶液，冷冻干燥，形成冻干粉I。将脂质材料、聚氧乙烯氢化蓖麻油、附加剂II溶解在叔丁醇中，形成叔丁醇溶液I。将冻干粉I加入到叔丁醇溶液I中，超声（50KHz）1min，形成叔丁醇溶液II，液氮中速冻形成固体，冷冻干燥25h形成包载伪麻黄碱的脂质体冻干粉II，灌装于西林瓶中密封保存。

微观形态和粒径分析：取200mg脂质体冻干粉加入2ml水形成脂质体溶液，微观形态和粒径分析方法同实施例3，各处方制备的伪麻黄碱脂质体具有较好的粒径，无聚团现象，处方1制备的伪麻黄碱脂质体平均粒径为887nm，处方2和处方3制备的伪麻黄碱脂质体平均粒径386nm。

在上述实施例中，仅对本发明进行了示范性描述，但是本领域技术人员在阅读本专利申请后可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本发明进行各种修改。

Claims (2)

1.一种包载水溶性药物的脂质体制备方法，其特征在于：其制备过程包含以下过程：

a.以质量配比计算，将1份含氨基酸结构的高分子亲水胶材料加入500-5000份水形成溶液，加入0.5-50份水溶性药物和20-500份泊洛沙姆溶解，形成含有药物的W/W型亲水胶体溶液，冷冻干燥，形成冻干粉I；

b.以质量配比计算，将1-50份脂质材料，5-500份聚氧乙烯氢化蓖麻油，溶解在500-10000份叔丁醇中，采用超声或水浴加热的处理方法加速溶解，形成叔丁醇溶液I；

c.将冻干粉I加入到叔丁醇溶液I中，分散均匀，形成叔丁醇溶液II，液氮或冰箱中冻结形成固体，冷冻干燥形成包载水溶性药物的脂质体冻干粉II，灌装于西林瓶中密封保存，临用前注入1000-50000份药学公知的注射用溶媒，形成包载水溶性药物的脂质体溶液。

2.如权利要求1所述的一种包载水溶性药物的脂质体制备方法，其特征在于：所述的含氨基酸结构的高分子亲水胶材料选自明胶、胶原和人血白蛋白。

3.如权利要求1所述的一种包载水溶性药物的脂质体制备方法，其特征在于：所述的水溶性药物是指单独应用、配合增溶剂应用或在特定pH值范围内药物溶解度大于0.01mg/ml的生物大分子药物、化学药物、中药有效提取物、医学或生物学领域应用的诊断试剂。

4.如权利要求3所述的一种包载水溶性药物的脂质体制备方法，其特征在于：所述的生物大分子药物是指蛋白质、多肽、多糖、酶、辅酶、核酸结构的药物及它们的生物降解或衍生产物，选自生长因子、激素、刺激因子、抗体、疫苗、干扰素、白介素、动植物来源的多糖。

5.如权利要求1所述的一种包载水溶性药物的脂质体制备方法，其特征在于：所述的水溶性药物选自：胰岛素、水蛭素、血管内皮生长抑制因子、神经营养因子、细胞生长因子、成骨生长因子、乳铁转运蛋白、干扰素、荧光蛋白、奥沙利铂，卡铂，奈达铂、阿柔比星、多柔比星、表柔比星、米托蒽醌、博莱霉素、平阳霉素、丝裂霉素、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、达沙替尼、阿立必利、阿扎司琼、昂丹司琼、氯磷酸、美司钠、利妥昔单抗、替伊莫单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、阿那曲唑，氨鲁米特，福美坦，依西美坦、替尼泊苷、依托泊苷，喷司他丁、伊立替康、白消安、氮芥、卡莫斯丁、罗莫司丁、高三尖杉酯碱、门冬酰胺酶、培门冬酶、阿糖胞苷、氟脲苷、吉西他滨、西地尼布、阿伦膦酸钠、瑞舒伐他汀、抗凝血酶、卡莫氟、多西他赛、长春地辛、长春新碱、紫杉醇、索拉菲尼、地西他滨、丙卡巴肼、尼莫地平、硝苯地平、尼群地平、非洛地平、双氯灭痛、萘普生、***马多、***、***、可乐定、单硝酸异山梨醇酯、盐酸噻氯匹啶、乙酰唑胺、对乙酰氨基酚、氨茶碱、阿米替林、氨苄西林、羟氨苄青霉素、阿司匹林、贝克拉胺、咖啡因、西咪替丁、***、樟脑、氯霉素、氯非那敏、盐酸氯丙嗪、氯贝特、氯唑西林、磷酸可待因、***、右美沙芬、布洛芬、盐酸苯海拉明、盐酸多西环素、依普拉酮、芬氟拉明、柠檬酸亚铁、富马酸亚铁、硫酸亚铁、东莨菪碱、伪麻黄碱、黄连素、吲哚美辛、左旋多巴、碳酸锂、盐酸甲氯芬酯、甲喹酮、甲基安非太明、乙酰螺旋霉素、呋喃妥因、去甲替林、那可丁、盐酸帕努拉明、非那西丁、保泰松、盐酸苯福明、盐酸***醇、***龙、普鲁卡因胺、溴丙胺太林、盐酸右丙氧芬、***、硫酸奎尼尔、硫利达嗪、葡萄糖酸锌、磺胺托嘧啶、四环素、链霉素、庆大霉素、三氟美嗪、阿利马嗪、维生素、核磁造影剂、同位素。

6.如权利要求1所述的一种包载水溶性药物的脂质体制备方法，其特征在于：所述的脂质材料是指药学公知的磷脂和类脂材料，选自天然卵磷脂、氢化磷脂、合成磷脂及其聚乙二醇修饰衍生物、饱和脂肪酸甘油酯、甾体。

7.如权利要求1所述的一种包载水溶性药物的脂质体制备方法，其特征在于：所述的制备过程a的含有药物的亲水胶体溶液中还可以加入0.1-50份药学公认的水溶性抗氧剂、稳定剂、pH调节剂，其中稳定剂选自：人血清白蛋白、酒石酸、琥珀酸、胆酸、脱氧胆酸、富马酸、枸橼酸、棕榈酸、氨基酸。

8.如权利要求1所述的一种包载水溶性药物的脂质体制备方法，其特征在于：所述的制备过程b的叔丁醇溶液I中还可以加入0.1-50份药学公认的油溶性抗氧剂、有机酸及其酯，其中有机酸选自：甲酸、乙酸、酒石酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸。

9.如权利要求1所述的一种包载水溶性药物的脂质体制备方法，其特征在于：制备的载药脂质体冻干粉临用前根据需要注入1000-50000份药学公知的注射用溶媒，形成粒径在100nm-1000nm范围内的载药脂质体。

10.如权利要求1所述的一种包载水溶性药物的脂质体制备方法，其特征在于：所述的脂质体通过选用不同类型的磷脂或类脂材料组合，制成PEG修饰的长循环脂质体、pH敏感脂质体、温度敏感脂质体、表面带正电荷的脂质体，更好地发挥胃肠道内定位释药或体内血循环靶向释药作用。

11.如权利要求1所述的一种包载水溶性药物的脂质体制备方法，其特征在于：所述的脂质体是单独使用或组合到制剂处方中应用，通过注射、口服、黏膜、皮肤、创面、腔道途径给药，发挥治疗、诊断、预防、免疫、清洗、消毒、美容、保健的应用。