CN102933223B - 用于治疗子宫感染的酪蛋白肽 - Google Patents

Abstract

本披露涉及用于治疗雌性哺乳动物中的子宫感染的一种酪蛋白肽，涉及向雌性哺乳动物给予至少一种酪蛋白肽治疗此类感染的方法，涉及酪蛋白肽用于制备治疗子宫感染的药物组合物的用途，并且涉及用于所述治疗的药盒。该酪蛋白肽优选地是一种酪蛋白水解物，例如通过酪蛋白的胰蛋白酶水解作用获得。根据一些实施例，该雌性哺乳动物是一种授乳动物，该感染是一种产后感染。

Description

用于治疗子宫感染的酪蛋白肽

本发明的领域

本发明涉及酪蛋白肽并且涉及其治疗用途。

本发明的背景

根据它们的电泳迁移率，酪蛋白包括三个部分，α、β和γ。酪蛋白水解物是酪蛋白的水解形式，其中包括β-酪蛋白衍生的活性多肽。已经确立的是，酪蛋白水解物在针对微生物和病毒性感染的免疫应答中起作用。

例如，美国专利号3,764,670描述了酪蛋白片段（通过蛋白水解活性获得）的抗细菌活性并且披露了具有针对微生物的抗微生物特性的蛋白水解酪蛋白消化物。

美国专利号5,506,209、5,538,952和5,707,968（都授予穆可伊（Mukerji）等人）、以及授予安德森（Andersson）等人的5,968,901描述了呈液体肠内配方的仅仅人β-酪蛋白、重组人β-酪蛋白、以及两者的水解物的给药，用于治疗在婴儿中的呼吸道合胞病毒感染、中耳炎、流感嗜血杆菌（H.influenza）和其他感染。

美国专利号5,330,975描述了用于中和细菌内毒素（例如霍乱毒素）的结合唾液酸的κ-酪蛋白和κ-酪蛋白肽的用途。

美国专利申请公开号2009/0305947描述了用于管理家畜和农场动物生殖周期的酪蛋白肽以及尤其是酪蛋白水解物的用途。美国专利申请公开号2009/0069218描述了酪蛋白肽以及尤其是酪蛋白水解物作为用于缩短泌乳家畜动物的干乳期的长度、用于增加其产后产乳量和乳汁卫生、以及用于改善家畜福利的一种方法的用途。

本发明概述

根据其第一个方面，本披露提供了一种用于治疗雌性哺乳动物中的子宫感染的酪蛋白肽。这样的治疗尤其促进了哺乳动物的良好的产后管理。

根据其第二个方面，本披露还提供了一种治疗子宫感染的方法，该方法包括对需要治疗子宫感染的雌性哺乳动物给予一定量的至少一种酪蛋白肽，该量对于治疗哺乳动物中的子宫感染是有效的。

根据其第三个方面，本披露还提供了至少一种酪蛋白肽用于制备用于治疗需要治疗子宫感染的雌性哺乳动物中的子宫感染的一种药物组合物的用途。

另外，根据一个另外的方面，本披露还提供了一种用于治疗子宫感染的药物组合物，该组合物包含作为一种活性组分的一定量的至少一种酪蛋白肽，该量对于治疗雌性哺乳动物中的子宫感染是有效的。

最后，根据一个另外的方面，本披露提供了一个药盒，该药盒包括至少一种酪蛋白肽以及使用该酪蛋白肽用于治疗雌性哺乳动物中的子宫感染的说明书。

本发明的详细说明

本发明是基于发现酪蛋白肽，并且尤其是酪蛋白肽水解物可以用于子宫感染的治疗。特别发现的是，对产后奶牛给予酪蛋白水解物在临床型子宫炎的治疗中是有效的。

哺乳动物（比如牛科动物）的子宫在产犊之前是无菌的。在怀孕期间，子宫颈提供了一个针对病原菌子宫内入侵的屏障。在产犊时，范围广泛的细菌通过此时开放的子宫颈进入子宫，引起（offset）以子宫感染、炎症、以及最终子宫清理而告终的级联事件。然而，病原菌在一些奶牛中存留，通过防止生理性子宫复旧而引起子宫疾病，导致低生育力。由于繁殖性能对于可行的乳品生产以及哺乳动物的繁殖是至关重要的，产后期的子宫卫生需要广泛的兽医关注。

分娩受孕间隔以及由此怀孕率是来自家畜和农场管理的经济观点的关键因素。维持一个大约12至14个月的分娩-受孕间隔的最适宜周期的能力取决于许多因素，尤其是动物的子宫的临床状态，所述临床状态应当完全没有任何产后相关性感染。

子宫炎、子***和子宫积脓是常见的子宫炎性疾病，发生在家畜和农场动物的产后期期间，主要是产后期早期，并且主要与生殖道（即，子宫）的污染有关。

由于治疗费用、回奶、繁殖性能降低以及过早淘汰（prematureculling），子宫感染、以及延迟的子宫与宫颈复旧会引起经济损失。

已经报道了各种各样的子***的疗法，包括以给予抗生素为主，通过***素F2α(PGF2α)或***的全身或局部给药。

本披露提供了一种用于子宫感染的替代治疗。因此根据第一方面，本发明提供了一种用于治疗雌性哺乳动物中的子宫感染的酪蛋白肽。正如所理解的，虽然在下面的详细说明中关于用于治疗雌性哺乳动物（如一种授乳动物）中的酪蛋白肽描述了本发明，应当理解的是在本披露之内还包括，对雌性哺乳动物给予酪蛋白肽以及包含作为一种活性组分的一定量的至少一种酪蛋白肽的药物组合物的治疗方法（该量对于治疗子宫感染是有效的）、以及一种酪蛋白肽用于制备治疗所述动物中的子宫感染的一种药物组合物的用途。

酪蛋白是非人类哺乳动物的乳汁中的主要蛋白，也发现于人类哺乳动物的乳汁中，已知包括亚型αS1、αS2、β和κ。酪蛋白是根据各亚型αS1、αS2、β和κ的氨基酸序列而定义的(Farrell,Jr.H.M.,Jimenez-FloresR.,BleckG.T.,BrownE.M.,ButlerJ.E.,CreamerL.K.,HicksC.L.,HollarC.M.,Ng-Kwai-HangK.F.,SwaisgoodH.E.牛奶中的蛋白质的命名法-第六次修订（NomenclatureoftheProteinsofCows‘Milk-SixthRevision.），《乳品科学期刊》（J.DairySci.）,87:1641-1674(2004))。

适合在本发明中使用的酪蛋白可以获自多种来源中的任何一种，例如但不限于，包括人类和非人类动物的任何哺乳动物来源的奶的αS1、αS2和β-酪蛋白。

在本披露的背景下，当提及酪蛋白时，应当理解为也包括酸性酪蛋白、酪蛋白盐、含磷酪蛋白以及酶凝酪蛋白。此外，应当理解包含植物酪蛋白类似物。[例如，如描述在美国专利号3,930,058中；Kumar,Surinder和Ramachandran,KolarS.修饰的植物蛋白模拟酪蛋白]。

术语“酪蛋白肽”在其广泛的意义上是指获自或相应于酪蛋白的一个或更多个部分的肽片段或拟肽物（peptido-mimeticproduct）。该肽可以包括但不限于一种酪蛋白分解产物（当酪蛋白被酶或酸裂解为肽片段时出现该分解产物（在该领域中也被已知为术语“酪蛋白水解物”））、或可以是指一种合成产生的产物，其中该酪蛋白肽在治疗子宫感染中展示出至少一种治疗有益的效果。

该酪蛋白肽可以是单个肽或独立地天然存在的肽、半合成肽、合成肽、磷酸肽（phosphor-peptide）基因改造的酪蛋白肽、以及酪蛋白肽的拟肽物的不同肽的混合物。

当最佳地比对两个序列时，修饰的、合成的、半合成的酪蛋白肽、或天然存在的酪蛋白肽的其他类型的类似物的至少75%，有时85%、90%、95%并且甚至99%（在序列上）与天然发生的酪蛋白肽一致。此外，根据本发明，任何使用的非天然存在的酪蛋白肽应当保留天然存在的酪蛋白的至少一部分生物活性。

根据本发明的一种酪蛋白肽的特征为在大约100至10,000道尔顿之间（例如，在2至100个氨基酸之间）并且优选地在大约100至7,000道尔顿之间的分子量。

在本披露的背景下，一种酪蛋白肽还包括一种酪蛋白水解物。一种酪蛋白水解物被理解为酪蛋白（蛋白质）的水解形式，其中包括那些精通本领域的人员已知的活性β-酪蛋白衍生的肽。

典型地在酶水解之后获得天然存在的酪蛋白肽，该酶可以是任何哺乳动物肽酶，例如但不限于纤溶酶、胰酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、羧肽酶、组织蛋白酶、以及植物肽酶（例如但不限于木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶）、以及微生物来源的酶。例如，一种天然存在的酪蛋白肽可以是对酪蛋白亚基β-酪蛋白、αs1-和αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白的纤溶酶活性的结果。

在一些实施方案中，通过用胰蛋白酶裂解酪蛋白而获得一种酪蛋白水解物。

该酪蛋白肽也可以是一个合成的或半合成的肽。可以通过肽合成领域已知的任何方法获得一种合成肽，包括固相肽合成（R.B.Merrifield(1963)）。“固相肽合成.I.一种四肽的合成”。_{0＞ J.Am.Chem.Soc.85(14):_<}0{>美国化学学会期刊（J.Am.Chem.Soc.）85(14):2149–2154).

可以通过酪蛋白的化学水解而获得一种半合成的酪蛋白肽，例如通过在强酸（酸-HVP）或强碱中延长的沸腾或使用一种化学试剂如溴化氰（CNBr）。

还可以通过本领域已知的分子技术中的分子工程获得酪蛋白肽，例如使用重组DNA。

酪蛋白肽还可以包括一种天然存在的肽的化学修饰，例如在一个或多个氨基酸被缺失、置换或修饰的地方，例如通过一个侧基的移除、一个侧基的置换或一个化学基团的引入。化学修饰可以包括但不限于下列非排他性实例：乙酰化、酰化、酰胺化、ADP-核糖基化、糖基化、GPI锚点形成（GPIanchorformation）、脂质或脂质衍生物的共价连接、甲基化、十四烷基化、聚乙二醇化、异戊烯化、磷酸化、泛素化、或任何相似的过程。当提及一个氨基酸序列被另一个置换时，优选该置换是保守置换。例如，酪蛋白序列中的一个或多个氨基酸残基被具有相似极性或电荷的另一个氨基酸置换。例如，非极性（疏水性）氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺.带正电荷的（碱性的）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的（酸性的）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。虽然如此，只要不显著改变产生的酪蛋白肽类似物的所希望的（酪蛋白样）生物活性，也可以发生非保守置换。

酪蛋白肽也可以是一种拟肽类肽，如类肽或半类肽，它们是肽衍生物，具有例如修饰，例如但不限于环化、N末端修饰、C末端修饰、肽键修饰，包括但不限于CH₂-NH、CH₂-S、CH₂-S-O、O-C-NH、CH₂-O、CH₂-CH₂、S-C-NH、CH-CH或CF-CH、主链修饰和残基修饰（制备拟肽化合物的方法可以在定量药物设计（QuantitativeDrugDesign）中找到，C.A.RamsdenGd.,Chapter17.2,F.ChoplinPergamon出版社(1992),犹如在此充分陈述一样通过引用进行结合）。

根据本发明的酪蛋白肽可以包含“L”以及“D”形式的残基。

在一个实施方案中，该酪蛋白肽是单一的肽或磷酸肽混合物，即，含有单一含磷基团或是一种富含磷的肽。在一个实施方案中，该酪蛋白肽是富含任何磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、磷酸苏氨酸和/或磷酸组氨酸的酪蛋白肽（酪蛋白磷酸肽，CPP）和一价阳离子磷酸酪蛋白，如磷酸酪蛋白钠、钾、钙或铵盐。在一个实施方案中，富含磷基团的酪蛋白肽是一种酪蛋白水解物。在一个实施方案中，该酪蛋白肽包含一个由氨基酸序列Ser-Ser-Ser-Glu-Glu（序列IDNO:1）定义的基序，其中一个或更多的Ser残基是任选地被磷酸化的。包含磷酸化基序的酪蛋白肽的一个非限制性基团由SEQIDNOs:2-6提供。以下提供了SEQIDNO:2-6，它们在酪蛋白多肽中的来源和定位（残基数量）：

SEQIDNO:2-RELEELNVPGEIVES(p)LS(p)S(p)S(p)EESITR(在β-酪蛋白中的1-25位)

SEQIDNO:3-QMEAESIS(p)S(p)S(p)EEIVPDSVEQK(在αS1-酪蛋白中的59-79位)

SEQIDNO:4-KNTMEHVS(p)S(p)S(p)EESIISNETYK(在αS2-酪蛋白中的1-21位)

SEQIDNO:5-KVNELSKNIGS(p)ES(p)TEDQ(在αS1-酪蛋白中的36-52位)

SEQIDNO:6-PTLNREQLS(p)TS(p)EENSKKTVD(在αS2-酪蛋白中的12-140位).

虽然在SEQIDNOs:1-6中提出的肽序列的氨基酸残基都是"L"异构形式，"D"异构形式中的残基可以置换任何L氨基酸残基，只要产生的肽类似物保留相应的“L”同分异构体的至少部分生物活性。设计包含至少一个D氨基酸的酪蛋白肽一个原因是增加肽对蛋白质降解的稳定性。

如上面指出，酪蛋白肽用于治疗子宫感染。术语"子宫感染″在此是用来表示一种由病原体大量进入（influx）哺乳动物的子宫以及因此的子宫壁炎症引起的一种病理状态。在一个实施方案中，子宫感染是一种病原体诱导的炎症，也称为术语非无菌性炎症（non-sterileinflammation）。

子宫炎，‘产后型’或‘临床型’；子***，临床型或亚临床型；以及子宫积脓是常见的子宫炎症性感染性疾病，主要发生在家畜和农场动物的产后期期间（主要在产后期的早期），并且主要与生殖道（即，子宫）的污染相关。

子宫炎是一种涉及子宫所有层（子宫内膜粘膜和粘膜下层、肌层、以及浆膜）的炎症反应。具有子宫炎（或子宫外膜炎）的动物有异常增大的子宫、可在***中检测到的脓性子宫排出物（更为普遍地在产后21天之内），通常没有全身败血症，具有明显的疾病征象（发热、抑郁、虚弱、食欲不振）。

产后子宫炎（也称为毒性产后子宫炎或毒性子宫炎）以异常增大的松弛的子宫和恶臭的水样棕红色***排出物为特征，与全身性败血症的急性疾病征象（主要是产乳量降低、迟钝或毒血症征象）相关并且通常在产后10天发热>39.4°C。

子***涉及子宫的临床（急性）或亚临床炎症。临床型子***是仅仅子宫内膜的炎症，延伸不深于子宫海绵层，以脓性***排出物为特征（典型地一直到产后42天），没有全身性疾病征象。亚临床型子***可以通过产后21-33天收集的子宫细胞学样品中多于18%的多形核白细胞的存在和/或通过子宫腔内液体的超声影像，或产后34-47天子宫细胞学样品中多于10%的多形核白细胞的存在而被诊断[SheldonIM,(2006)ibid.]。

子宫积脓是在持久黄体和宫颈闭合的情况下，在子宫腔中的大量液体的积聚。

以上任何情况可以由许多种病原菌引起。在奶牛中，子宫炎和子***的致病生物最经常是单独的化脓隐秘杆菌（放线菌)或与坏死梭杆菌或其他革兰氏阴性厌氧生物联合。在一些形式的子***中，致病因子是猪葡萄球菌或大肠杆菌。在其他动物中，如母马，子***最常见的的致病因子是兽疫链球菌，但是可以涉及几种其他生物，包括大肠杆菌、绿脓假单胞菌和肺炎克雷伯杆菌。

此外，术语“子宫感染”包含子宫颈和***感染，例如但不限于***（一种子宫颈的炎症，可能由沙眼衣原体、细菌淋病奈瑟菌（也称为***)引起）；或***炎（***炎症，可能由酵母白色念珠菌，加德纳菌属或寄生原生生物***毛滴虫引起）；以及外阴炎（外阴的炎症，有时被称为外阴***炎（因为在有***炎症时，外阴也经常发炎）。

在一些奶牛群中，40%的产后动物被诊断为子宫感染，因此需要兽医治疗（LewisG.S.,子宫卫生和失调，《乳品科学期刊》（J.DairySci.）,80:984-994(1997)）。

被诊断具有子宫感染，例如像，子宫炎或子***以及延迟性子宫与子宫颈复旧的奶牛，具有显著降低的受孕率、延长的距离第一次受精的天数、以及增加的从产犊到育种的间隔，这已经通过降低的怀孕数量例证。例如，子宫感染可以增加产犊到产犊之间的周期，该周期最佳地应当不超过大约12至14个月的最适宜周期，即，每头奶牛每年大约产犊一次。保持这样一个最适宜周期的能力取决于许多因素，尤其是动物的子宫的临床状态，所述临床状态应当完全没有任何产后相关性感染。

因此，子宫感染引起经济损失，例如兽群健康相关的成本增加，经常饲料消耗降低，引起很大的奶产量降低，并且迫使饲养员和奶供应商淘汰家畜动物（如奶牛），否则这些家畜动物是多产的并留在兽群中。

子***和子宫炎可以自愈，通常对于繁殖性能或任何其他生产力量度没有很大的影响。

应当理解的是，当子宫变得被感染时，它可能显著影响奶产量。

本发明可以适用于许多种雌性哺乳动物，可以在授乳期之前（例如小母牛），也可以是授乳动物。

在一些优选的实施方案中，该雌性哺乳动物是非人类的哺乳动物。在本发明的背景下，可能的非人类的哺乳动物可以选自下列非限制性组，该组由以下各项组成：狗、绵羊、山羊、母猪、奶牛、瘤牛、斑马、猫、驴子（donkey）、驴（ass）、水牛、牛（oxen）、母马（包括小雌马）、驯鹿、牦牛、骆驼、美洲驼（lama）、羊驼、大象、猪、野猪和疣猪。在一个实施方案中，本发明适用于授乳动物。

在另一个实施方案中，本发明涉及家畜授乳动物，包括但不限于奶牛、水牛、山羊、绵羊、母马、瘤牛、母猪和牛。一个特别感兴趣的授乳动物是奶牛。

该哺乳动物可以是任何未经产的、初产的或多产的授乳动物。“未经产的”（未生育者“nullipara”或“para”）应当被理解为是指一个从未完成一个妊娠周期的动物；“初产的”（初产者“primipara”或“primip”）应当被理解为是指一个已经生产了至少一个后代的动物（单次分娩）；以及“多产的”（“多产者”“multip”）应当被理解为是指一个已经经历了两次或更多次分娩的动物。

仍然在一个另外的实施方案中，该子宫感染是一种产后感染。在本发明的背景下，术语产后感染是指发生在分娩后任何时间的感染，例如在两次连续分娩的时间间隔中，以及在一些实施方案中是在分娩之后直到发情期开始的时间。在一些实施方案中，产后期被看作是在分娩之后前7周期间。

该酪蛋白肽被用来治疗任何上述子宫感染。“治疗”（"treatment″)或“治疗”（"treating）等术语在此用来是指对具有或倾向产生子宫感染（例如在产后期）的雌性哺乳动物获得所希望的药理和生理作用。这样，在一个倾向于产生子宫感染的授乳动物中，在“预防”或部分预防感染、症状或其病症方面，该作用可以是预防性的，和/或在部分或完全治愈已经存在的感染、病症、症状或归因于感染的副作用方面，该作用是是治疗性的。因此，在此使用的术语“治疗”覆盖了任何以下内容(a)在可能易受感染的（例如产犊之前和之后）但是尚未被诊断为感染（例如感染的临床症状还没有发展到一个可检测水平）的雌性哺乳动物中预防感染发生；(b)抑制感染，即，阻止或减少感染的发生或其临床症状（如炎症和/或发热）；或(c)减轻感染，即，引起感染和/或其症状或病症的消退。

在一些实施方案中，治疗包括所述至少一种酪蛋白肽的肠胃外给药（例如注射，输注，等等）和/或局部给药。给药可以是子宫内的和/或***给药。在一个实施方案中，给药是经子宫颈子宫内给药。

取决于给药途径，该至少一种酪蛋白肽可以与一种适合的可接受的载体配制形成一种药物组合物。一种可接受的载体是一种药学上和生理学上可接受的载体，被理解为一种通常安全的、无毒性的以及在生物学上或其他领域都没有所不希望的作用的载体或赋形剂。如在说明书和权利要求中所使用的药学上可接受的载体包括一种或一种以上这样的载体。载体可以是那些任何常规使用的载体，并仅仅受限于化学物理考虑因素（如溶解度以及与至少一种酪蛋白肽的反应性的缺乏）以及给药途径。

如精通本领域的人员所理解的，治疗也可以包括与其他药物联合给药，例如抗生素。

该药物组合物也可以包括其他添加剂，以产生与该组合物相容的形式或增加稳定性、无菌性和等渗性或增强该酪蛋白肽的跨膜摄取。例如，添加剂可以包括一种pH调节剂，例如用来维持该组合物的pH在6至8的范围内，或有时甚至在6.7至6.9的范围内，这是发现用于酪蛋白肽的局部或肠胃外给药的最适合pH。

在一个实施方案中，实现有效治疗子宫感染的至少一种酪蛋白肽的量是每次给药剂量在10ng/ml至500mg/ml之间，有时，每次给药剂量在10ng/ml至200mg/ml之间，甚至有时每次给药剂量在10ng/ml至100mg/ml之间。在一些实施方案中，该酪蛋白肽是一种包含酪蛋白肽混合物的酪蛋白水解物，至少它的一部分用来治疗子宫感染是治疗有效的。有时，该酪蛋白肽可以以一种非溶液形式给予（例如乳膏），在这种情况下，每次给药剂量的量将在大约10ng/kg体重至200mg/kg体重之间，有时，每次给药剂量在大约10ng/kg体重至100mg/kg体重之间。一个给药剂量是指单次给药事件，即，一个动物可以每天或在两天或更多天期间接受单个给药剂量或几个给药剂量。

在一个实施方案中，该至少一种酪蛋白肽被给予一次（单次剂量给药）。在另一些实施方案中，典型地以2个至6个之间的剂量执行所述至少一种酪蛋白肽的两次或更多次给药。当该至少一种酪蛋白肽以一次以上的剂量被给予时，典型地（即使不限于此）在两次连续给药之间使用从2小时至14天的时间间隔。虽然给药的数量如此，根据一个实施方案，单次或首次给药是在产犊之后，典型地一直到产犊后120天，更具体地，一直到产犊后70天，另外有时一直到产犊后30天，并且有时在产犊后即刻（即，产犊之后几分钟或几小时），以及一直到产犊后26天。

如在此使用的，除非上下文中另有明确指示，形式“一个/一种”（"a","an"）和“该”（"the"）包括单数和复数指代。例如，术语“一种酪蛋白肽”包括一种或更多种这样的肽，例如有效治疗子宫感染的肽的混合物。

此外，如在此使用的，术语“包含”旨在表示该组合物包含所述的一种或更种肽，即，该至少一种酪蛋白肽（可以单独地涉及一种包含这些肽的混合物的制剂），但是不排除其他要素，如生理学可接受的载体和赋形剂以及其他活性剂。术语“主要由......组成”用来定义包含所述要素但是排除可能对于治疗子宫感染具有重要意义其他要素的组合物。因此“由......组成”应当表示排除超过微量要素的其他要素。由每一个这些过渡术语定义的实施方案在本发明的范围之内。

此外，所有数值（例如当提及构成包含至少一种酪蛋白肽作为一种活性成分的组合物的要素的量或范围时）是近似值，为在规定值的20%（有时达到10%）(+)或(-)变化的近似值。应当理解的是，即使不总是明确地规定，所有数值标识的前面是术语“大约”。

现在将在以下的根据本发明进行的实验的描述中例证本发明。应当理解的是这些实例在性质上旨在是说明性的而不是限制性的。显然，这些实例的许多修改和变化可能考虑到以上教导。因此，应当理解的是，在所附的权利要求书的范围之内，本发明可以按照大量的可能的方式实施，而不是如在下文中特别说明的。

提出以下实施例是为了更充分地说明本发明的优选实施方案。然而，它们绝不是以任何方式被解释为限制本发明的广泛范围，因为其中的很多修改和改变对于本领域的技术人员将是显而易见的。

一些非限制性实例的说明

材料

碘化丙啶(荧光溶液，CAS25535-16-4,西格玛奥德里奇目录号70335,西格玛奥德里奇公司,3300南二街,圣路易斯,MO63118)。

重组人IL-8(rhIL-8)(ProSpec-TanyTechnoGene有限公司,雷霍沃特科技园,邮政信箱398,雷霍沃特76103,以色列)。

等渗Percoll(基础西格玛奥德里奇目录号P4937,西格玛奥德里奇公司,3300南二街,圣路易斯,MO63118)。

灭活的兽疫链球菌悬浮液(Omnisorbin,Calbiochem,巴德索登,德国)。

脱水土霉素（Oxytetracyclinedehydrate）200mg/mL(NorbrookLaboratory有限公司,英国)。

灌洗水(治愈医学（CureMedical）,Teva医学,以色列)。

在下文，奶牛也是以色列的荷斯坦-弗里生奶牛。

十四酰佛波乙酸酯(PMA,西格玛奥德里奇目录号P8139,西格玛奥德里奇公司,3300南二街,圣路易斯,MO63118)。

非荧光染料二氢罗丹明123(DHR123,Morbitec,哥廷根,德国)。

实例1-酪蛋白水解物的制备

储存液的制备：25mMTrisHClpH=8.0(20升)和25mMTrisHClpH=7.0(5升)。

称量Tris碱（ApplichemGmBH，达姆施塔特，德国）（75.687gr）溶解于包含24升灌洗水（WFI，治愈医学，由Teva医学制造，以色列）的装备有磁性搅拌棒的玻璃瓶中，直至溶液完全澄清，最终pH约11.5。

对于19升溶液，使用10NHCl（西格玛奥德里奇,以色列）调整pH至大约7.5-8.5（优选地大约为8），并且通过加入WFI将体积定至20升。对于4.75升溶液，调整pH至大约6.75-7.25之间，（优选地为7.0），并且通过加入WFI将体积定至5升。在室温下储存这些溶液直到进一步使用。

酪蛋白衍生肽的制备：

根据以下内容，通过以色列生物工业公司（BiologicalIndustriesIsrael）（BeitHaemekLtd.,以色列）制备酪蛋白水解物:

玻璃瓶中加入TrisHCl25mM,pH=8.0（20升），并且将温度调整至大约40°C至48°C之间，优选45°C。

总共4,000gr酪蛋白酸钠（DMV国际菲仕兰坎皮纳总公司,阿默斯福特，荷兰）加入TrisHCl溶液中，获得20%(w/v)的溶液。轻轻搅拌该混合物达到充分溶解。保持溶液的pH在大约8.0，温度在大约45°C。溶液中加入4g猪胰蛋白酶粉末（西格玛奥德里奇，以色列）。在磁力搅拌器或反絮凝（优选）搅拌器上在大约45°C的轻微搅动下，轻轻搅拌该混合物。允许水解进行持续总共大约1小时。使用10NNaOH(JTBaker,AvantorPerformanceMaterials，菲利普斯堡，新泽西州，美国)调整pH至大约8.0，并且将温度保持在大约45°C。

通过将温度升高至90°C-95°C持续一小时将粗制水解物中的胰蛋白酶灭活。通过使用冰在外部浴中将上清液冷却至室温。使用10NHCl调整pH至4.7。在15-30分钟之后，通过在2°C-8°C在4500rpm离心20分钟去除不溶物。

将上清液转移至一个新的无菌玻璃瓶中，使用10NNaOH调整pH至7.0。

通过加入pH7.0的25mMTrisHCl溶液调整溶液体积至20升。

最终体积按顺序通过1.2μm/0.65μm预滤器以及通过两个0.45/0.22μm无菌CA囊式膜过滤器而被过滤。在无菌工作台中，通过无菌灌装将过滤的溶液转移至一个玻璃血清瓶（分别是100ml和200ml）中。将样品储存在-20°C（冷冻）直至进一步使用。

产品（原料）包含20%酪蛋白酸钠、25mMTris-HCl和0.02%胰蛋白酶.

实例2:临床研究1–酪蛋白水解物在急性牛产后临床型子宫炎中的作用的低剂量研究

研究了牛酪蛋白水解物相比于抗生素药物在患有急性产后子宫炎的奶牛中的作用(Sheldon等人,ibid2006)。

总的研究信息：

本研究纳入的奶牛是授乳的荷斯坦弗里生奶牛，位于以色列的大奶牛群中（经度34°40'E-35°30′E；纬度30°30'N-33°01'N）。奶牛每天挤奶三次。所用的兽群在没有畜栏的畜棚中，规模范围从300至350头产奶牛。

在奶牛场中，由临床研究组织（CRO）(Hachaklait-IsraeliCattleBreedersAssociation，撒利亚工业园区，以色列)选择并任命一个管理兽医师，以便进行研究职能，确切地说该管理兽医师负责治疗管理、临床评定、亲自训练奶牛群、适当储存、针对不良事件进行必要的临床观察并填写报表。以擦不掉的黑/蓝墨水字迹清楚地填写所有研究文件。将原始数据发送给主办方。

身体观察:

所有奶牛在产后的前5至10天进行常规检查，并且使用以下量度评定它们的身体状况：

(i)通过经直肠触诊的子宫的情况;

(ii)用于近似重量确定的胸围测量值;

(iii)根据EdmonsonA.J.,等人，基于奶牛的身高和身体各个部分的脂肪组成，由兽医师提供的身体状况评分。[EdmonsonA.J.,LeanI.J.,WeaverL.D.,FarverT.,WebsterG.，荷斯坦奶牛的身体状况评分表，《乳品科学期刊》（J.DairySci.）,(1989);72:68–78]。

奶牛被纳入本研究，条件是它们的身体状况符合以下入选标准：

患有临床型产后子宫炎的奶牛，

非双胎分娩的奶牛，

在过去的4周期间没有子宫内或全身性生殖激素疗法的奶牛。

没有诊断为患病的奶牛，这些疾病可能影响研究者对治疗结果的判断。

在检查用于本试验的奶牛之前，兽群管理者同意不给予任何子宫内或生殖激素疗法。

另外，奶牛被纳入本临床研究的条件是它们没有任何以下特征（在此的“排除标准”）：

具有异常的***官（包括粘连）的奶牛

纳入时，在当前产犊后期间具有严重的***炎、跛行、乳腺炎-酮症、消化不良、或需要全身治疗的任何其他临床疾病的诊断和/或治疗的奶牛,

在产犊之后经鉴定被淘汰（将不授精）的奶牛

在进入研究前的3周之内被给予免疫疗法的奶牛，

在进入研究前2周，全身性地或通过饲喂给予抗炎药和/或合成代谢疗法的奶牛。

在当前产犊之时，疑似或诊断为胎膜滞留的奶牛。

疑似或临床确证为具有全身影响的急性产后子宫炎的奶牛。

因当前位置的农场的任何原因将要剔除的奶牛。

被诊断为确认的临床型子宫炎的具有适合的身体状况（如上文在入选标准和排除标准中所定义的）的奶牛被纳入本临床研究，正如通过以下临床标准的任何之一所确定的：

1)奶牛必须是发热的（即，早晨直肠温度高于39.4°C）和/或

2)奶牛必须具有位于腹腔中的松弛的、非伸缩自如的子宫，子宫颈直径>7.5cm，以及水样的、粘液脓性的、或恶臭的***排出物。

研究细节：

在日期"0"（本研究的第一天），由研究者使用预先准备的表格，将来自同一兽群并且处于相同哺乳期和年龄的乳用小母牛或初产的或多产的奶牛进行随机分组，以便接受一种治疗或其他治疗。在每个表格之内，成对地将奶牛分配于治疗，每组一头奶牛。

治疗：

病例研究组（"组1″）–以150ml的溶液给予450mg牛酪蛋白水解物（批号B100），直至完成该组的样本大小。

对照组（"组2"）–25ml脱水土霉素（总共5,000mg，200mg/ml）（NorbrookLaboratory，英国）。

对测试奶牛不提供其他的子宫内治疗（包括但不限于子宫内抗微生物剂、内部或外部治疗全身性抗微生物剂）。

治疗在日期"0"处开始，通过使用无菌子宫导管经子宫颈子宫内输注而对奶牛给予治疗。

所有实验是盲法病例（blindcase）-对照研究，因为所有未辨别的有待给予的产品被标记在牛酪蛋白水解物小瓶上，并且总是以与治疗相同的途径向奶牛给予阴性对照，因此研究者或牧人（herdsperson）或兽医师不能辨别出研究病例或对照。

研究终点：

本研究的终点是安全和有效的，如以下详细说明：

安全性：

确定与具有当前剂量的牛酪蛋白水解物很可能相关的任何毒性的最大严重度。

确定与具有当前剂量的牛酪蛋白水解物很可能相关的任何毒性的最大严重度。

安全性是通过监测在治疗后0.3、1、2、3、7和14天的不良事件（在下面详细介绍）或任何毒性征象的出现而确定的。

另外，根据表1的说明，对每头奶牛的总的整体印象进行评定和分级。

表1-奶牛整体印象分级

评分	说明
		0	正常
1	轻微抑郁
		2	抑郁(独处，头倾斜向下)

本项目的管理者/监督者/主办者负责即时通知不良事件（AEs）的任何可能征象。适当的行动可以涉及定位并打破盲法编码，以便能够给予适当的医学治疗，将不良事件记录在本研究文件中，并向主办者报告不良事件。

根据兽医标准，如果遇到不良事件（包括在第一次治疗后随访的推移时间内）或在治疗后7天观察到临床产后子宫炎的显著体征和症状，对奶牛给予与在第0天提供的相同的治疗。

记录所有严重的和/或意外的不良事件。

疗效：

通过以下两个参数的平均减少来度量治疗成功：

与在第0天期间测量的平均温度相比，如果动物组在治疗后14天具有平均直肠温度降低，和/或;

如果在治疗后14天，该动物组具有排出物参数的平均降低。

通过在治疗之前、在治疗后6-8小时而且在治疗后第1、2、3、7和14天在早晨观察和挤奶之后的初访时测量直肠温度、生殖***形态和生殖器分泌物而评定疗效。总之，在治疗后总共14天之后评定治疗成功。

基于提供在表2中的说明，管理兽医师检查所有奶牛并且负责对生殖器分泌物进行分级（从1至4）。

表2-生殖***分泌物的分级

评分	说明
		0	无。
1	透明稀薄的分泌物
		2	稀薄的血性的(serosanguinotic)分泌物
3	粘液脓性分泌物
		4	脓性分泌物伴有恶臭味

根据在表3中的说明对生殖***形态学进行评定和分级。

表3生殖***形态学分级

治疗后奶牛的管理

通常，根据特定机构的实践，随后是治疗后动物管理和观察方案。治疗之后，已经将研究奶牛与非研究奶牛混杂，并且将根据每个站点的标准实践而收容。所有奶牛已经经受相同的基础管理（包括收容和给养、收容和给养的定期变化、以及除了针对子宫炎病原体的疫苗接种之外的任何疫苗接种方案，如果这些方案是可获得的话）。

本研究材料的制备和储存：

牛酪蛋白水解物：

在制造之后，将牛酪蛋白水解物立刻冷冻至达到-15°C至-20°C之间的温度。这个过程在从制造过程起在少于16小时之内完成。如上所述，将155ml酪蛋白水解物灌装入200ml的小瓶中，其中150ml被注射（保留其余5ml以继续使用）。

通过冷运输递送（ColdTransportDelivery）（冷冻）将含有牛酪蛋白水解物的包装小瓶从制造机构运输到参与的奶牛群，并储存在指定的在每个奶牛群处的冷冻库（-20°C）中。

在计划的治疗日期之前的一天（24-36小时）（在早晨挤奶之后），从冷冻库中取出含有生物制品的小瓶，并且保持在冷藏冰箱（coolingrefrigerator）的温度（4°C-8°C）直到给药时间。

无论如何，不给予含有牛酪蛋白水解物的一个小瓶的内容物，将该小瓶储存在初始包装中，标记为000，并且在任何时候都不被给予。

将抗生素保持冷藏（4°C-8°C），以避免在水分和直射阳光下的延长的暴露。

结果-临床研究1-低剂量研究

对总共16头奶牛实施了随机盲法安全性研究，对8头奶牛给予酪蛋白水解物（治疗，组1），并且对8头奶牛给予抗生素（对照，组2）

所有测试奶牛在治疗后14天期间具有正常的行为，在给予治疗之后将来自每头奶牛的整体印象在表1中特别地分级为“0”，其中没有任何奶牛表现出任何抑郁、摄食减少的征象。

在给予治疗之后指定的时间，通过测量每头奶牛的发热并且通过监测生殖***分泌物和形态学来量度治疗效果。分别根据在表2和表3中的说明将每头奶牛的分泌物和形态学分级。

从用酪蛋白水解物（150ml）治疗的奶牛和用抗生素治疗的奶牛所获得的结果的比较表明用酪蛋白治疗能够保持与用抗生素治疗的相同的体温(表4)。

表4–酪蛋白对奶牛发热的作用

发现所有治疗的奶牛的生殖***形态是正常的，并且将其分级为“0”，其中没有如在表3中所说明的发红或肿胀的出现，表明没有局部不良事件。

另外，观察到用酪蛋白水解物治疗奶牛持续14天使生殖器分泌物减少了大约50%，与抗生素相似（表5）。

表5–酪蛋白对生殖器分泌物的作用

上面描述的以及涉及表1至5的结果清楚地表明如下：

以450mg的剂量向奶牛给予牛酪蛋白水解物是没有毒性的，并且没有引起任何局部副作用和全身性副作用，因此对于奶牛可以安全地子宫内给予。

在疗效方面，正如在发热测量值方面以及在生殖器形态学和生殖器分泌物测量值方面所表明的，发现给予450mg牛酪蛋白水解物在治疗产后临床型子宫炎中与普通的子宫炎治疗（抗生素）是一样有效的。

以上结果提供了使用酪蛋白肽胜过标准抗生素的有益治疗优势的证据，至少因为以下原因。酪蛋白是一种天然材料，通常不会产生对它的抗性（与抗生素相反），此外，由于酪蛋白是一种天然材料，在酪蛋白肽治疗期间从动物挤奶所得的乳汁可以被使用（而不是如进行抗生素治疗的授乳动物一样被丢弃）。

实例3临床研究2-酪蛋白水解物对急性牛产后临床型子宫炎的作用的高剂量研究

纳入本研究的奶牛是位于以色列大奶牛群中的以色列荷斯坦-弗里生授乳奶牛（经度34°40'E-35°30'E;纬度30°30'N-33°01′N）。

纳入本研究的奶牛关于其身体状况、入选标准和排除标准正如上文的临床研究-1关于总的身体状况以及关于诊断为临床产后子宫炎的详细说明。另外，奶牛的随机化如上文的详细说明。

在日期"0"（本研究的第一天），由研究者使用预先准备的表格，将来自同一兽群并且处于相同哺乳期和年龄的乳用小母牛或初产的或多产的奶牛进行随机分组，以便接受一种治疗或其他治疗。在每个表格之内，成对地将奶牛分配于治疗，每组一头奶牛。

治疗：

病例研究组（"组1″）-以150ml的溶液给予1350mg牛酪蛋白水解物（批号B100）3次。

对照组（"组2"）–25ml脱水土霉素（总共5,000mg，200mg/ml）（NorbrookLaboratory，英国）。

对测试奶牛不提供其他的子宫内治疗（包括但不限于子宫内抗微生物剂、内部或外部治疗全身性抗微生物剂）。

治疗在日期"0"处开始，通过使用无菌子宫导管经子宫颈子宫内输注而对奶牛给予治疗。

所有实验是盲法病例（blindcase）-对照研究，因为所有未辨别有待给予的产品被标记在牛酪蛋白水解物小瓶上，并且总是以与治疗相同的途径向奶牛给予阴性对照，因此研究者或牧人（herdsperson）或兽医师不能辨别出研究病例或对照。

研究终点：

安全和疗效标准如上文临床研究1的详细描述（实例2）

管理兽医师检查所有奶牛并且基于提供在临床研究1的表2中的说明、以及根据临床研究1的在表3中的说明的生殖***形态学、以及来自根据临床研究1的在表3中的说明的每头奶牛的总的整体印象而负责对生殖器分泌物进行分级（从1至4）。

另外，兽医师将以无菌的方式准备生殖器区域（确切地说，外阴）以便从指定的奶牛制作子宫拭子样品并获得子宫细胞学样品。从子宫体取得子宫拭子样品，并且通过使用防护获得无菌子宫拭子。

用于子宫细胞学样品的子宫拭子样品是在治疗之前和治疗后第7天和第14天获得的。

在拭子采样之前，完成样品载玻片的标记，包括奶牛ID和指示、日期指示以及样品的部位ID、日期和时间。

在洁净环境中，将采样后的拭子滚涂（rolled）在指定的玻璃载玻片上。滚涂过程从标签的一端（白色）开始至载玻片的末端，并且重复二次或三次。载玻片的两个末端部分不应该包括生物样品。每个样品载玻片立刻被分开放置在一种输送介质中，并且在收集之后三（3）小时之内在4°C-8°C转移至实验室。一经收到，将子宫拭子重悬于2ml巯基肉汤（thioglycolicbroth）中，通过加入更多的肉汤在一定程度上稀释100倍。

对所有子宫样品进行病理学分析，例如，分析中性粒细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞的存在。

而且，在第14天，监测在预治疗和治疗后（第14天）期间在制作子宫拭子样品之后感染的存在。

另外，如上文所述，在第7天和第14天之后制作子宫拭子样品，并且在第14天如上文的详细说明进行任何不良事件的评定。

通过下列参数测量本实验的效果，这些参数与预防在非滞留胎膜动物中的子宫感染的能力相关：

(i)微生物参数：与对照相比的在治疗之后的临床和细菌学转阴率（主要参数）。通常，根据在子宫之内的已知致病性将细菌分类（SheldonI.M.,NoakesD.E.,RycroftA.N.,DobsonsH，***的子宫内给药在牛体内对产后子宫细菌感染的作用（Effectofintrauterineadministrationofoestradiolonpostpartumuterinebacterialinfectionincattle））。《动物生殖科学》（AnimalReproductionScience），81:13–23(2004)）。其类别基于临床型子***从1到3而变化，相应于：

第1类-频繁引起子宫炎的细菌

第2类-不常引起子宫炎的细菌；以及

第3类-未被认为是子宫病原体的细菌。

针对所有细菌或每个病原体类别（1–3）将细菌生长评分合计（总细菌评分）。

(ii)生物学状态：通过测量人工授精性能、怀孕风险以及奶产量（主要参数）而获得。

根据兽医标准，如果遇到不良事件（包括在第一次治疗后随访的推移时间内）或临床型产后子宫炎的显著体征和症状，则对奶牛给予相同的治疗（对病例给予牛酪蛋白水解物，对对照给予抗生素）。以擦不掉的黑/蓝墨水字迹清楚地填写所有研究文件。将原始数据发送给主办方。

治疗后管理如上文的临床研究1中详细描述。

如上文在临床研究1中的详细描述准备和储存材料。

结果-临床研究2-效果研究

对总共7头奶牛实施了随机盲法安全性研究，对4头奶牛给予酪蛋白水解物（治疗，组1），并且对3头奶牛给予抗生素（对照，组2）。

在治疗给药之后，在用酪蛋白水解物治疗14天的任何奶牛中没有观察到不良反应，每头奶牛的整体印象明确地表明奶牛行为在治疗后14天期间是正常的，每头奶牛的整体印象在表1中特别地分级为“0”，其中没有任何奶牛表现出任何抑郁或摄食减少的征象。

发现所有治疗的奶牛的生殖***形态是正常的，并且将其分级为“0”，其中没有如在表3中所说明的发红或肿胀的出现，表明没有局部不良事件。

来自用酪蛋白水解物（450ml）治疗的奶牛和来自用抗生素治疗的奶牛的结果的比较表明酪蛋白能够阻止体温增加，其程度与抗生素所得到的结果相似（表6）。

表6–酪蛋白对奶牛发热的作用

测量时间	酪蛋白水解物(℃)	抗生素(℃)
			治疗之前（天数=0）	38.9	38.4
治疗之后6-8h	38.6	39.1
			第1天(治疗之后22-32h)	38.7	38.6
第2天	38.1	38.4
			第3天	38.4	38.9
第7天	38.6	38.3
			第14天	38.8	38.7

结果表明酪蛋白水解物的治疗是有效的，与抗生素相似，并且即使在高剂量治疗下没有观察到不良事件。

实例4-8的检查、纳入和排除标准

奶牛的常规检查

在产犊之后立即对奶牛进行常规检查，以评定它们的身体状况，使用的量度为：

(i)通过经直肠触诊和超声检查的子宫的状态；

(ii)用于近似重量确定的胸围测量值；

(iii)根据EdmonsonA.J.,等人，基于奶牛的身高和身体各个部分的脂肪组成，由兽医师提供的身体状况评分。[EdmonsonA.J.,LeanI.J.,WeaverL.D.,FarverT.,WebsterG.，荷斯坦奶牛的身体状况评分表，《乳品科学期刊》（J.DairySci.）,(1989);72:6878]。

对被诊断为产后健康异常（例如酮症、滞留胎盘、左侧显示皱胃、跛行）的奶牛提供适当的医学治疗并且将其从任何未来的研究试验中排除。

一般检查方案(实例4-8)：

在下文描述的所有体内实验中，测试群体包括大约25%的乳用小母牛或初产奶牛以及大约75%的多产奶牛（在产后期期间）。将来自同一兽群并且具有相同哺乳期和年龄的奶牛随机分配到进不同的研究组中。另外，所有实验是盲法病例-对照研究，因为所有未辨别的有待给予的产品被标记在牛酪蛋白水解物小瓶中，并且总是以与治疗相同的途径向奶牛给予阴性对照，因此研究者或牧人或兽医师不能辨别出研究病例或对照。除非另有说明，所有治疗（包括生理盐水）是通过经子宫颈子宫内输注而被给予的。

在研究期间产犊的奶牛和小母牛将被纳入本试验。所有奶牛就以下纳入标准和排除标准将被检查。

参加本研究的纳入标准是:

具有正常健康子宫的奶牛（仅仅对于实例4和5）,

患有子宫感染的奶牛（对于实例6、7和8）,

非双胎分娩的奶牛,

在当前的哺乳期中没有子宫内或全身性生殖激素疗法的奶牛,

没有诊断为患病的奶牛，这些疾病可以被考虑为可能影响研究者对治疗结果的判断。

□在检查用于本试验的奶牛之前，兽群管理者同意不给予任何子宫内或生殖激素疗法。

不能参与本研究的排除标准是:

具有异常的***官（包括粘连）的奶牛,

纳入时，在当前产犊后期间具有严重的***炎、跛行、乳腺炎-酮症、消化不良、或需要全身治疗的任何其他临床疾病的诊断和/或治疗的奶牛，

在产犊之后经鉴定被淘汰（将不授精）的奶牛，

在进入研究前的3周之内被给予免疫疗法的奶牛，

在进入研究前2周，全身性地或通过饲喂给予抗炎药和/或合成代谢疗法的奶牛。

实例4–临床研究3–牛酪蛋白水解物对奶牛的生殖性能的影响的研究。

本研究的目标是评估产后牛酪蛋白水解物治疗对奶牛生殖性能的影响；相比于对照组的酪蛋白水解物的子宫内输注对奶牛生殖性能的影响。

如果在产后49-70天的平均周期中，在牛酪蛋白水解物治疗的奶牛中实现了以下标准的一个或两个，则认为研究是成功的。

(1)与对照组相比，人工授精成功率至少高于5%，优选地高于10%，最优选地高于20%；和/或

(2)与对照组相比，开放天数（产犊至繁殖）缩短大约5-9天，优选地10天或更长，或在病例和对照之间的开放天数的差异方面达到统计学显著的结果。临床检查后，在产犊之后按盲法将纳入的奶牛分配到不同的研究组的兽群中，即，牛酪蛋白水解物治疗的奶牛和对照奶牛。将奶牛随机分配到两个组。

治疗：

治疗的奶牛-将通过子宫内输注牛酪蛋白水解物而给药。

对照奶牛–将通过子宫内输注对照溶液而给药

在纳入之后，每两周一次重新检查每个动物，类似于在产犊后一直到40-60天的纳入。

在大约42天的主动等待期之后，奶牛将经受第一次***同步和定时授精方案。在授精之后大约42至49天，通过经直肠子宫触诊及其内容物进行怀孕诊断。

使用场内数据记录的形式和数据记录来收集授精日期。在纳入之后最少2个月，将收集个体动物的生殖性能。审查到妊娠的时间的观察值。

将测量以下描述性结果来评定生殖性能。

从产犊到第一次授精的间隔（到第一次受精的时间）,

第一次怀孕（%）,

从产犊到怀孕的间隔（开放天数）,

怀孕奶牛的人工授精数,

生殖失败风险的去除（%）,

产奶量（升/每天）,

将审查在怀孕之前的试验期间被淘汰的奶牛的到怀孕的时间的观察值。对于在数据收集终止时将不会怀孕的奶牛，在最后的日期审查观察值。

实例5：奶牛产后子宫感染的体内预防

评估在奶牛中牛酪蛋白水解物对子宫炎和子***（临床型和亚临床性）的全身预防性治疗的效果（SheldonI.M.,LewisG.S.,LeBlancS.,GilbertR.O.牛的产后子宫疾病的定义（Definingpostpartumuterinediseaseincattle）。《兽医产科学》,65:1516–1530(2006)）。

本研究的目标是评估向子宫感染的奶牛给予牛酪蛋白水解物的预防性治疗的效果。确切地说，为了预防子宫炎和子***（临床型和亚临床型），无论奶牛的体温如何，都要在它们产犊之后给予子宫内输注牛酪蛋白水解物。

本研究的目的是，与对照组相比，通过对没有胎膜滞留的奶牛和小母牛的子宫内输注牛酪蛋白水解物来预防子宫感染的发生或使其已经发生之后的影响在产后有待进行的全面预防性治疗（blanketpreventivetreatment）之后降低至最低限度。

在纳入期间将进行以下检查:

(i)通过经直肠触诊和直肠发热测量值、呼吸评估以及心搏测量值，对生殖道进行一般体格检查和临床检查。

(ii)子宫的细菌学检查-获得子宫细菌学样品细胞，用于通过微生物（感染）的存在确定子宫内膜细菌学状态。在产犊之后，将奶牛分配到两个研究组中，牛酪蛋白水解物（通过子宫内输注给予）（组I）和对照（组II）。

另外，对于所有的临床评价，无论其体温如何，也对没有胎膜滞留的奶牛进行治疗。

每两周进行一次治疗随访基本检查，包括与纳入-治疗阶段相似的检查。最后，在治疗后第42天，进行子宫内膜（细菌学）检查以及临床检查以评估子宫感染的存在或缺乏。

通过下列参数测量本实验的效果，这些参数与预防在非滞留胎膜动物中的子宫感染的能力相关:

(i)微生物参数：与对照相比的在治疗之后的临床和细菌学转阴率（主要参数）。通常，根据在子宫之内的已知致病性将细菌分类（SheldonI.M.,NoakesD.E.,RycroftA.N.,DobsonsH，***的子宫内给药在牛体内对产后子宫细菌感染的作用（Effectofintrauterineadministrationofoestradiolonpostpartumuterinebacterialinfectionincattle））。其类别基于临床型子***从1到3而变化，相应于：

第1类-频繁引起子宫炎的细菌；

第2类-不常引起子宫炎的细菌；以及

第3类-未被认为是子宫病原体的细菌。

针对所有细菌或每个病原体类别（1–3）将细菌生长评分合计（总细菌评分）。

(ii)生物学状态：通过测量人工授精性能、怀孕风险以及奶产量（主要参数）而获得

实例6:酪蛋白水解物对临床型子***的体内效果

评估了牛酪蛋白水解物与对照相比的在其产后期患有临床型子***的奶牛中的效果。

在产后大约26至33天之内的兽群中的所有奶牛的常规检查包括全身体格检查、通过经直肠触诊和直肠发热测量值对生殖道进行的临床检查、呼吸评估以及心搏测量值。基于包括发热（典型地，高热）、臭味、子宫内膜中存在多形核中性粒细胞和微生物/细菌的临床和细菌学标准（Sheldon等人，ibid2006），被诊断为临床型子***但是先前没有被诊断为产后子宫炎的奶牛和小母牛被纳入本研究。

将被研究的奶牛和/或小母牛分配到两个研究组中，牛酪蛋白水解物（通过子宫内输注给予）（组I）和对照（组II）。

治疗后七天（在产后大大约33天与40天之间）对每头奶牛如在纳入时进行临床、细胞学和细菌学检查。仍然被诊断为临床型子***并且没有因此临床治愈的动物接受第二剂量的与初始给予的相同的治疗。然后在另外的14天之后（在产后大约47天与54天之间；在初始纳入21天之后），对这些动物进行第三次检查和最终检查。

疗效可以被认为是在病例组中具有高于60%的临床治愈率或统计学显著性结果。主要通过在细菌学试验结果方面的变化确定对治愈率的影响-即，在治疗后7至9天期间的至少一次细菌学试验之后，根据Sheldon等人的标准，没有微生物的存在（Sheldon等人ibid2004）并且在***内没有可检测的分泌物。

可以基于以下培养结果对临床细菌学治愈进行分类（(Sheldon等人bid2004）。

(i)治疗成功=对于来自频繁引起子宫炎的相同微生物，在临床型子***诊断时培养物呈阳性，而在治疗后7天之后培养物呈阴性,

(ii)治疗失败=对于频繁引起子宫炎的相同的生物，在临床型子***诊断之日和治疗后7天的培养物呈阳性，

(iii)不一致的结果=在临床型子***诊断之日和治疗后7天，培养物呈阳性，但是伴有频繁引起子宫炎的不同的生物。

实例7:酪蛋白水解物对亚临床型子***的体内效果

评估了牛酪蛋白水解物在患有亚临床型子***的奶牛中的效果（Sheldon等人，ibid2006）。

在产后大约26至33天之内的兽群中的所有奶牛的常规检查包括全身体格检查、通过经直肠触诊和直肠发热测量值对生殖道进行的临床检查、呼吸评估以及心搏测量值。基于包括产后大约26-33天收集的子宫细胞学样品中存在>18%的多形核中性粒细胞的临床和细胞学标准，被诊断为亚临床型子***的奶牛和小母牛被纳入本研究。

将被研究的奶牛和/或小母牛分配到两个研究组中，牛酪蛋白水解物（通过子宫内输注给予）（组I）和对照（组II）。在治疗后14天之后（在产后大约40天与47天之间），对每头奶牛、病例、以及对照如在纳入时进行临床和细胞学检查。仍然被诊断为亚临床型子***并且没有因此临床治愈的动物接受如最初给予的或如由兽医师规定的第二剂量的牛酪蛋白水解物。

疗效可以被认为是在病例组中的高于60%的临床治愈率或统计学显著性结果、和/或少于15%的多形核中性粒细胞测量值、或在病例与对照之间在子宫内膜细胞学检查上的统计学显著性差异、和/或通过测量人工授精性能的生物学状态和/或怀孕风险。主要通过细胞学参数确定临床和细胞学治愈率。

实例8:酪蛋白水解物对急性产后子宫炎的体内效果

研究了牛酪蛋白水解物与对照相比的在患有急性产后子宫炎的奶牛中的效果（Sheldon等人,ibid2006）。

所有牛在通过在产犊之后大约7至14天的常规检查之后，根据以下临床标准被诊断为确认的产后子宫炎的牛被纳入本研究：

1)奶牛必须是发热的（即，早晨直肠温度高于39.5°C-103.10°华氏温度），并且

2)奶牛必须具有位于腹腔中的松弛的、非伸缩自如的子宫，以及水样的恶臭的***排出物。

在诊断之日，将受试奶牛分配到两个研究组中。通过一个48小时的间隔，每组用以下牛酪蛋白水解物（组I）或苄星头孢匹林（组II）治疗，每周给药两次。

通过比较在纳入之后、在治疗第一天、以及在连续的产后大约7至14天的每一天的临床症状、细菌学结果和直肠温度的检查来评定疗效。用在观察动物之后取得的直肠温度来观察奶牛。

根据治疗之后7至14天的研究来评定治疗成功。如果其直肠温度低于39.5°C、细菌学阴性并且没有恶臭的外***排出物，则将动物归类为成功治疗的治疗。

实例9:牛酪蛋白水解物的药物代谢动力学

体内细菌活性、迁移和吞噬细胞活性

在对患有确认的子宫感染（子宫拭子的临床、细菌学检查）的奶牛子宫内输注牛酪蛋白水解物之后，进行与对照相比的剂量反应对细菌活性、迁移和吞噬细胞活性的初步测量。

评定了在三个研究组或病例组中的剂量依赖性反应，每组由三头奶牛组成。每组在产后大约24天接受以下子宫内剂量的牛酪蛋白水解物：0.5mg/kg（组I）、2.5mg/kg（组II）和4.4mg/kg（组III）。对照组（组IIII）由接受一种溶液（与研究组同时进行）的奶牛组成，该溶液通过如在方案中所说明经由子宫内给药。

在给药之后0、以及大约12和24小时之后，收集用于确定子宫内膜多形核中性粒细胞和吞噬活性的子宫内膜细胞学样品。在第2、5和7天，对子宫内膜细胞学样品进行进一步的跟踪测定。

收获来自子宫内腔的细胞，并且使用荧光显微镜计数。为了评定细胞活力，根据HendrickA等人的方法，采用碘化丙啶用于细胞活力的评估，用定量流式细胞术标准细胞稀释测定法，确定与细菌产物共培养之后有活力的多形核中性粒细胞的总数。（HendricksA.,LeiboldW.,KaeverV.,SchuberthH.-J.，***素E2是由牛单核细胞中的细菌超抗原诱导可变的并且对T细胞增殖反应具有调节作用（ProstaglandinE2isvariablyinducedbybacterialsuperantigensinbovinemononuclearcellsandhasaregulatoryrolefortheTcellproliferativeresponse），《免疫生物学》，201:493-505(2000)）。对于培养的细菌，例如大肠杆菌和化脓隐秘杆菌，在15,000g在4°C离心20分钟之后将其上清液去除，无菌过滤（0.5μm），并且以等分部分在-80°C储存。在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中将细菌沉淀物洗涤两次，并且通过法国压力细胞压机（FrenchPressureCellsandPress）将其破碎成碎片。通过在血琼脂上培养（24小时,37°C，空气中含5%CO₂）来判断细菌的完全杀死。上清液的浓度和细菌碎片以在制备之前的悬浮液中存在的集落形成单位（CFU）的等同物来表示。例如，大肠杆菌制剂含有3μg/ml的脂多糖（LPS）（相当于2x10⁸CFU/ml）。包含在化脓隐秘杆菌中的脂多糖低于检测限(<0.001μg/ml)。

体外趋化作用

使用3mm孔径的聚碳酸酯过滤器，还研究了多形核中性粒细胞在丙烯酸迁移室中（一式三份）的趋化作用。每个迁移室的下层孔用大约30mL的不同肽浓度的牛酪蛋白水解物、以及300μL的0、10、25、50、100、150、200rhIL-8ng/mL介质浓度的趋化因子rhIL-8充盈，随后每个孔用115mL未稀释的等渗Percoll(100%)分层。在测定结束时，从每个上层孔收集剩余的未迁移的多形核中性粒细胞.在膜移除后，从每个室的下层孔收集迁移的细胞，并且使用标准细胞稀释测定法（SCDA）通过流式细胞术将来自下层孔和上层孔的细胞定量，该测定法使用FAC扫描流式细胞仪（FACScanflowcytometer）定量在异质细胞群体中的表型可定义的活细胞的任何子集(（PechholdK.,PohlT.,KabelitzD.，通过流式细胞术的在异质细胞群体中的淋巴细胞子集的快速定量（Rapidquantificationoflymphocytesubsetsinheterogeneouscellpopulationsbyflowcytometry），《细胞计量术》,16:152-159(1994)）。

对于随后的体外实验，将迁移的多形核中性粒细胞（功能和表型特性的评价）、收获的细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤一次（100xg，在4°C，8min）并且将其以2x10⁶个细胞/毫升重悬于细胞培养基（rhIL-8ng/ml培养基和未稀释的等渗Percoll-(100%)）中，其中多形核中性粒细胞将具有>95%的纯度和>95%的活力)。

体外吞噬活性

针对吞噬活性，用异硫氰酸荧光素标记可商购的非存活兽疫链球菌（Streptococcuszooepidemicus）悬浮液。将具有摄入的异硫氰酸荧光素标记的链球菌的多形核中性粒细胞通过在流式细胞仪采集和分析之后的增加的绿色荧光而从非吞噬细胞性多形核中性粒细胞而区分出来。

实例10：活性氧产生的体外模型

用十四酰佛波乙酸酯（PMA，300nmoL/l）刺激从子宫刮术获得的多形核中性粒细胞。PMA充当蛋白激酶C的一种非受体依赖性活化剂（receptor-independentactivator）的作用，因此用作活性氧（ROS）形成的刺激剂。磷酸盐缓冲盐水（PBS）代替PMA作为阴性对照。在白细胞的PMA诱导性活化15min（37°C，空气中含5%CO₂）之后，将载有非荧光染料二氢罗丹明123（DHR123，15μg/mL）的细胞加入到各个孔中。取决于产生的ROS的量，短暂搅动和15min的第三孵育阶段（37°C，空气中含5%CO₂）允许DHR123经由细胞髓过氧化物酶催化的氧化而氧化转化成绿色荧光罗丹明123。随后，将所有样品置于冰上并且保持在黑暗中，直到通过确定相对（平均）荧光强度用流式细胞术（2000PMN）进行分析（A.,HechtM.,Lohmann-MatthesM.L.,RoeslerJ.，一种使用二氢罗丹明123通过人和鼠的吞噬细胞确定活性氧中间物的产生的快速且简单的方法（Afastandeasymethodtodeterminetheproductionofreactiveoxygenintermediatesbyhumanandmurinephagocytesusingdihydrorhodamin123），《免疫学方法期刊》（J.Immunol.Method）.131:269-275(1990)）。

Claims (19)

1.至少一种酪蛋白肽在制备用于治疗雌性哺乳动物中的子宫感染的药物中的用途，其中所述药物被以有效治疗所述哺乳动物中的子宫感染的量给药至所述哺乳动物，并且其中该至少一种酪蛋白肽包含选自下组的一种氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。

2.如权利要求1所述的用途，其中子宫感染选自下组，该组由以下各项组成：产后毒血性子宫炎、临床型子宫炎、子宫外膜炎、临床型子***、亚临床型子***、子宫积脓、***、***炎和外阴炎。

3.如权利要求2所述的用途，其中子宫感染选自下组，该组由以下各项组成：产后毒血性子宫炎、临床型子宫炎、临床型子***和亚临床型子***。

4.如权利要求1所述的用途，其中子宫感染是一种产后感染。

5.如权利要求1所述的用途，其中该雌性哺乳动物是一种授乳动物。

6.如权利要求5所述的用途，其中该雌性哺乳动物选自下组，该组由以下各项组成：未经产的、初产的或多产的授乳动物。

7.如权利要求1所述的用途，其中该雌性哺乳动物是奶牛。

8.如权利要求1所述的用途，其中该药物用于与一种药物载体结合而用于肠胃外给药或用于局部给药。

9.如权利要求8所述的用途，其中给药包括子宫内给药或***给药。

10.如权利要求9所述的用途，其中给药是通过经子宫颈子宫内。

11.如权利要求8至10中任一项所述的用途，其中肠胃外给药是通过注射或输注。

12.如权利要求1所述的用途，其中该药物在产犊之间的一个时期被给予。

13.如权利要求12所述的用途，其中该时期包括一直到产犊之后120天。

14.如权利要求13所述的用途，其中该时期包括一直到产犊之后70天。

15.如权利要求13所述的用途，其中该时期是从产犊日一直到产犊之后33天。

16.如权利要求1所述的用途，其中给药包括一种单剂量给药。

17.如权利要求1所述的用途，其中给药包括该药物的两次或更多次给药，该两次或更多次给药包括从1小时到14天的一个时间间隔。

18.如权利要求17所述的用途，其中给药包括该药物的两次至六次给药。

19.如权利要求1所述的用途，其中有效治疗所述子宫感染的所述至少一种酪蛋白肽的量是在10ng/ml至500mg/ml之间。