CN102925582B

CN102925582B - β-Catenin基因突变的快速检测方法

Info

Publication number: CN102925582B
Application number: CN201210462255.0A
Authority: CN
Inventors: 王明; 范少安
Original assignee: Shanghai Saian Biological Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Saian Biological Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2012-11-16
Filing date: 2012-11-16
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2032-11-16
Also published as: CN102925582A

Abstract

本发明提供了一种β-Catenin基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤：在β-Catenin基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；分别设计了β-Catenin的Cat-F和Cat-R的野生型引物和突变型，引物分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段；不同比例混合这两种片段，用HRM方法进行区分；与其它方法相比，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。

Description

β-Catenin基因突变的快速检测方法

技术领域：

本发明涉及生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。

背景技术：

β-链蛋白(β-Catenin；CTNNB1)是一种具有介导细胞粘附及信号传导双重活性的多功能的蛋白质(Bauer and Willert,2012)，除少数游离存在于细胞浆中外，主要位于细胞膜。β-catenin蛋白的分子量约为90kDa，由约800个氨基酸组成；其分子结构主要分三个区域：氨基端可使得β-Catenin在翻译后能保持分子稳定，羧基端则负责激活靶基因的转录，而另一个ARM区域因结构紧密可防止蛋白水解，是β-Catenin与其配体相互作用的基础。β-链蛋白在细胞连接处与钙粘素相互作用，参与形成粘合带，发挥细胞粘附分子和细胞骨架成分的作用；而胞浆中游离的β-Catenin则进入细胞核而调节基因表达(Barker et a.,2001)，即作为Wnt/β-Catenin信号通路的关键成员介导信号转导过程中调控细胞的增殖和凋亡(Masielloet al.,2004)，其异常表达或激活则能引起肿瘤发生(Chitalia et al.,2008)。

现有研究成果提示，β-Catenin基因发生突变时可能导致其获得额外的功能而活化，进而引起肿瘤发生；如约85％的硬纤维瘤患者被查有β-Catenin基因突变(Lazar et al.,2008)，其它肿瘤如结直肠癌(Morin et al.,1997)、卵巢癌(Sagae et al.,1999)、肝细胞癌(Legoix et al.,1999)等也都发现与β-Catenin基因体细胞突变相关。

高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸:它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR与专门的分析算法。使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs,mutations)。

SYBR^TMGreen I对PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应扩增有毒性，因此必需使用低浓度的染料，又因为它是非饱和态结合，染料在熔解过程中可重新结合，使其无法适用于HRM。

罗氏开发了一种新的适用于HRM的染料ResoLight或LC Green，它有三个优点：饱和染料毒性低；高浓度可以使DNA达到饱和；降低了染料位置重组的可能。

而PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应产物的高分辨率熔解曲线HRM的要求包括:

仪器:高分辨率高均一性的仪器，确保结果差异仅受DNA模板的影响

试剂:稳定可靠的PCR与HRM染料，确保获取高分辨率熔解曲线

软件:高分辨率熔解曲线分析专用软件

罗氏荧光定量PCR***LightCycler Nano System具有光源好、温控好、检测好、加热快的优点，完全能满足检测的要求，这台仪器也于近期通过了国家药监局的审批，适用于临床诊断检测。

LightCycler Nano System是LightCycler480System的缩小版，480在HRM领域发表的文献是当前发表文献最多的实时定量PCR***：应用领域包括人类疾病、植物、微生物、病毒、药理、毒理、生理、诊断等；影响因子10分以上5篇，包括Nature,Nature Methods,NatureGenetics，影响因子5－10分10篇，5分以上文章占总数的18％逐年上升趋势明显，已经成为当前qPCR扩展应用的热点目前常常使用测序法来检测是否存在突变，但是总结下来，现有的测序法有三个缺点：

第一：灵敏度不高，低比例突变(<20％)无法检测；

第二：耗时长，一般需要2-3天；

第三：成本高。

鉴于以上的问题，一种灵敏度高、耗时短、成本低、可操作性能更高的实Β-CATENIN基因突变的快速检测方法的发明是势在必行的。

发明内容：

本发明要解决的技术问题主要是：现有的测序法有三个缺点：

第一：灵敏度不高，低比例突变(<20％)无法检测；

第二：耗时长，一般需要2-3天；

第三：成本高。

为了解决以上问题，本发明提供了一种β-Catenin基因突变的快速检测方法，本发明技术在突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物，两者分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型(Tm的不同)：PCR产物的Tm取决于GC含量.

高Tm G:C>A:T>G:G>G:T＝G:A>T:T＝A:A>T:C>A:C>C:C低Tm

将纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线分析，得到相似峰形的熔解曲线；当然，包括野生型纯合子或突变纯合子。

将杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线分析，得到不同峰形的熔解曲线.

本发明分别设计了β-CATENIN的野生型引物和突变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/100，最后用HRM方法进行区分。

即，为解决上述技术问题，本发明提供了一种β-CATENIN基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤：

一种β-CATENIN基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤：

在β-CATENIN基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；

分别设计了β-CATENIN的Cat-F和Cat-R的野生型引物和突变型，引物分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段；

不同比例混合这两种片段，用HRM方法进行区分。

所述PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的Tm取决于GC含量。

所述纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线.

所述不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/100最后用HRM方法进行区分。

所述的一种Β-CATENIN基因突变的快速检测方法，其包括如下步骤：

样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；

DNA提取：取200μL抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；

qPCR-HRM检测，包括：对照孔的设立和检测重复孔；10μL反应体系构成；在八连管中依照次序加入各试剂，混合均匀；所有样本混合完后，将八连管置于罗氏荧光定量PCR***仪器中进行程序性检测；

结果分析及判定：在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。

所述qPCR-HRM检测的程序包括：95℃变性10分钟；95℃变性10秒钟；退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10秒钟；72℃延伸30秒钟；重复第2步到第四步45个循环；95℃变性60秒钟；40℃变性60秒钟；设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s。

所述Cat-45突变型目的片段的获取包括：

利用带有突变位点的突变引物(Cat-F,Cat-45R；Cat-45F,Cat-R)获得突变位点前后两段突变片段；

将这两段突变片段连接起来，构成Cat-45突变型目的片段。

所述Cat-45突变型目的片段的获取包括：

突变第一步PCR：以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以Cat-F,Cat-45R；以及Cat-45F,Cat-R为引物进行两组实验，获得两个条带单一的片段；

突变第一步产物稀释：将突变第一步获得的两段PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL；

突变第二步PCR：以稀释后的第一步两段产物为模板，以Cat-F+Cat-R为引物进行第二步PCR，获得条带单一的片段；

突变第二步产物稀释：将突变第二步获得的PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL。

所述M/W＝1/100阳性对照模板的获取包括：混合99μL野生型模板和1μL突变型模板，配制100μL突变型/野生型(M/W)＝1％的混合模板，作为检测用1％阳性对照模板。

所述野生型目的片段的获取包括：以已知未突变基因组为模板，Cat-F和Cat-R为引物进行实验，获得条带单一的特异性野生型目的片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL，作为检测野生型阴性对照模板用。

本发明的有益效果是：本发明分别设计了Cat-F和Cat-R野生型引物和突变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/100，最后用HRM方法进行区分，采用了高分辨率熔解曲线法(HRM法)；与其它方法相比，本发明的HRM法能检出0.1％的突变、检测时间只需要1小时、每样品试剂耗材成本<￥7.00，即，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。

附图说明：

图1为本发明Β-CATENIN基因HRM检测分析结果示意图。

具体实施方式：

本发明应用于生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。

设计一对引物将包括待突变位点在内的基因序列扩增出来作为野生型模板(wt)；再设计引物在将待突变位点改变成所需碱基的同时，将上述DNA片段在待突变分为两段，且在待突变位点附近有少量重复序列；最后利用部分重复的两个DNA片段混和起来作为模板，而利用最开始的那对引物将两个小片段连接起来，其产物尽管与wt大小完全相同，但却含有所期望的突变点。

下面以Cat-F和Cat-R为例，说明具体的操作。

1样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存。

2DNA提取：取200μL抗凝血用QIAmp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取DNA。采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测。

3、qPCR-HRM检测的体系

1)对照的设立和检测重复孔

每个样本的检测必须同时设有对照实验，包括野生型阴性对照和m/w(突变/野生)＝1％阳性对照。对照和样本均采用复孔。

2)10μL反应体系构成(引物序列见附表)如下(以4管反应为例)：

A先按下表配制MasterMix,混匀后短暂离心，然后吸取4.5μL加至每管8联管中，计4管：

MasterMix组成：	(1x)	(5x)
			25mM MgCl₂	1.2μl	6μl
2μM Cat-F primer	1μl	5μl
			2μM Cat-R primer	1μl	5μl
H₂O	1.3μl	6.5μl
			Σ＝	4.5μl	22.5μl

B向每管中加入0.5μL(约5-10ng)模板DNA。

C向每管中加入5μL2x HRM荧光Master(罗氏Cat#04909631001)；Σ＝10μL。

3)混合均匀，盖上8联管盖。

4)将8联管置于LightCycler Nano仪器中，注意仪器中A组与D组平衡，合上仪器盖子。

4、qPCR-HRM检测的程序：

1)95℃变性10分钟；

2)95℃变性10秒钟；

3)退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10秒钟；

4)72℃延伸30秒钟；

5)重复第2步到第四步45个循环；

6)95℃变性60秒钟；

7)40℃变性60秒钟；

8)设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s)。

5、结果分析：

1)设置好样本名称、检测靶点和所使用的荧光染料。

2)通过各孔的熔解曲线图可以查看各孔PCR条带特异性；以野生型样

品孔为基线，通过高分辨率熔解曲线，可以查看阳性对照孔与样本孔图谱。

3)结果判定

在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。

4)获取结果图。

6、野生型目的片段的获取：

以已知未突变基因组为模板，Cat-F和Cat-R为引物进行实验，参照步骤3及步骤4的反应体系及程序，获得条带单一的特异性野生型目的片段。

将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL，作为检测野生型阴性对照模板用。

7、Cat-45突变型目的片段的获取

突变型目的片段的获取分为两步，第一步利用带有突变位点的突变引物(Cat-F,Cat-45R；Cat-45F,Cat-R)获得突变位点前后两段突变片段；第二步将这两段突变片段连接起来，构成Cat-45突变型目的片段。

1)突变第一步PCR

以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以Cat-F,Cat-45R；以及Cat-45F,Cat-R为引物进行两组实验，实验体系及程序参照步骤3及步骤4，获得两个条带单一的片段。

2)突变第一步产物稀释

将突变第一步获得的两段PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL。

3)突变第二步PCR

以稀释后的第一步两段产物为模板，以Cat-F+Cat-R为引物进行第二步PCR，实验体系及程序参照步骤3及步骤4，获得条带单一的片段。

4)突变第二步产物稀释

将突变第二步获得的PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL。

M/W＝1％阳性对照模板的获取

混合99μL野生型模板和1μL突变型模板，配制100μL突变型/野生型(M/W)＝1％的混合模板，作为检测用1％阳性对照模板。

8、结果分析

通过HRM方法，我们能区分含1/100突变型的模板，证明了这个方法的高特异性和高灵敏度，而且，整个操作时间只需要1小时。

附表：Cat-45_TCT>TTT检测引物序列：

引物名称	引物序列(5’-3’)
		Cat F	TCACTGGCAGCAACAGTCTT
Cat R	ACTCTTACCAGCTACTTGTTCTTGA
		Cat-45F	ACC ACA GCT CCT TTT CTG AGT GGT
Cat-45R	ACCACTCAGAAAAGGAGCTGTGGT

与其它方法相比，本发明技术具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低！

上述优选实施例的描述使本领域的技术人员能制造或使用本发明。这些实施例的各种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的，这里定义的一般原理可以被应用于其它实施例中而不背离本发明的精神或范围。因此，本发明并不限于这里示出的实施例，而要符合与这里揭示的原理和新颖特征一致的最宽泛的范围。

Claims

1.一种β-Cat eni n基因突变的快速检测方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：

DNA提取:取200μL抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；

qPCR-HRM检测，包括：

1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括野生型阴性对照和突变M/野生W＝1％阳性对照；对照和样本均采用复孔；

在β-Cat eni n基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；

所述野生型引物是Cat-F和Cat-R，所述突变型引物是Cat-45R和Cat-45F；

所述野生型引物Cat-F的核苷酸序列为：TCACTGGCAGCAACAGTCTT，

所述野生型引物Cat-R的核苷酸序列为：ACTCTTACCAGCTACTTGTTCTTGA，

所述突变型引物Cat-45R的核苷酸序列为：ACCACTCAGAAAAGGAGCTGTGGT，

所述突变型引物Cat-45F的核苷酸序列：ACCACAGCTCCTTTTCTGAGTGGT；

所述野生型引物和突变型引物分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段；

所述突变型目的片段的获取包括：利用引物Cat-F和Cat-45R，以及引物Cat-45F和Cat-R获得突变位点前后两段突变片段；将这两段突变片段连接起来，构成突变型目的片段；

所述突变型目的片段的获取步骤包括：突变第一步PCR：以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以Cat-F,Cat-45R；以及Cat-45F,Cat-R为引物进行两组实验，获得两个条带单一的片段；突变第一步产物稀释：将突变第一步获得的两段PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL；

突变第二步PCR：以稀释后的第一步两段产物为模板，以Cat-F和Cat-R为引物进行第二步PCR，获得条带单一的片段；

突变第二步产物稀释：将突变第二步获得的PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL；

所述野生型目的片段的获取包括：以已知未突变基因组为模板，Cat-F和Cat-R为引物进行实验，获得条带单一的特异性野生型目的片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测野生型阴性对照模板用；

所述M/W＝1/100阳性对照模板的获取包括：混合99μL野生型目的片段和1μL突变型目的片段，配制100μL突变型M/野生型W＝1％的混合模板，作为检测用1％阳性对照模板；

2)10μL反应体系检测：

在八连管中依照次序加入各试剂：25Mm MgCl₂1.2μl，引物2μM Cat-Fpri mer 1μl，引物2μM Cat-R pri mer 1μl，H₂O 1.3μl，模板0.5μl，2×HRM荧光mast er 5μl，混合均匀；所有样本混合完后，将八连管置于罗氏荧光定量PCR***仪器中进行程序性检测；

结果分析及判定：在高分辨率熔解曲线分析方法中，以1％阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述qPCR-HRM检测的程序包括：1)95℃变性10分钟；2)95℃变性10秒钟；3)退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10秒钟；4)72℃延伸30秒钟；5)重复第2步到第4步45个循环；6)95℃变性60秒钟；7)40℃变性60秒钟；8)设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s。