CN102925413B - 抗t-PSA单克隆抗体产生的杂交瘤及检测t-PSA试剂盒的制备 - Google Patents

Abstract

抗t-PSA单克隆抗体产生的杂交瘤及检测t-PSA试剂盒的制备，属于免疫分析医学领域。本发明提供了一种特异性识别t-PSA的单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤，以及使用该单克隆抗体检测t-PSA的高灵敏度的方法；还提供了***特异性抗原t-PSA化学发光免疫分析检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括：t-PSA检测反应板、酶结合物、发光底物、标准品、质控品、浓缩洗涤液。本发明用细胞融合和杂交瘤技术研发出灵敏度高、特异性好的抗体；同时用自主研发抗体将免疫学与化学发光技术相结合，研制出检测范围宽、灵敏度高、操作方便、生产成本低的试剂盒。临床检测人血清中t-PSA的含量，用于***癌早期筛查、制定治疗方案和评估预后提供重要参考依据。

Description

抗t-PSA单克隆抗体产生的杂交瘤及检测t-PSA试剂盒的制备

【技术领域】

本发明涉及总***特异性抗原(t-PSA)单克隆抗体产生的杂交瘤及检测血清中t-PSA含量的试剂盒，可广泛应用在医学和及生物化学技术领域。

【背景知识】

总***特异抗原(Prostate specific antigen，t-PSA)是与***癌相关的一种抗原，是一种由***上皮细胞合成和分泌的单链糖蛋白，分子量34KD，由237个氨基酸残基组成，具有丝氨酸蛋白酶活性，是诊断***癌较好的肿瘤标记物，其特异性达到85％-90％。***癌是50岁以上的男性常见的癌症，发展缓慢，随年龄而增长，在我国，随着居民生活的日益改善、环境污染的严重以及饮食结构的改变，其发病率逐渐上升；在美国，已经将t-PSA的检测作为男性的普查指标。t-PSA的检测有利于***癌的早期发现、监视病情的进展、治疗效果检测，同时t-PSA在原发性***癌和继发性***癌的鉴别诊断中起着重要的作用。

***特异抗原是***疾病价值很高的肿瘤标志，在临床上被广泛应用，t-PSA主要用在***癌的诊断及分期，还可以追踪治疗效果。***特异抗原并不是***癌所特有的，许多***肥大症或***发炎也会使t-PSA上升，因此，判断是否患有***癌十分的重要，需要做进一步的检查，比如做***切片，以证实患有***癌。目前还没有发现***癌晚期的治疗方法，减少***癌的死亡率，唯有依赖早期的诊断发现并给与适当治疗，从而减少***癌的死亡率。

目前在临床实验室检测PSA的方法主要是放射免疫分析(RIA)、免疫比浊法和酶联免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必须用放射性元素标记，检测设备复杂昂贵，其放射性元素的半衰期短，不能长期保存，检测结果不稳定，同时存在放射性污染也给实验操作人员带来了伤害；酶免疫分析法灵敏度低，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性。本发明采用的化学发光免疫分析方法(CLIA)灵敏度比较高，可以达到10-18mol/L，快速，发光信号在几秒钟就能产生，操作方便，且不使用有害的试剂，与国内的同类试剂相比，具有灵敏度很高，操作简便，更重要的是其需要的血清量少、检测范围广、发光液持续时间长的优点，更能满足临床的需要，本发明的试剂与国外同类试剂相比，达到国外同类产品水平。

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种抗***特异性抗原单克隆抗体以及建立一种简单且具高灵敏度的检测t-PSA的方法，并将该方法应用于***癌的检测。以解决现有的单克隆抗体检测t-PSA的灵敏度不够或价格昂贵，不适合临床大规模的应用的缺点。

本发明的另一目的在于提供一种***特异性抗原化学发光免疫分析测定试剂盒以及该试剂盒的制备方法。利用该试剂盒分析检测灵敏度高、特异性强。

本发明获得了能够产生特异性识别t-PSA的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株3-20-1与杂交瘤细胞株3-26-1，该细胞株已于2012年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC C201202与CCTCCC201208。此外，经过鉴定，两株单克隆抗体分别识别t-PSA的两个不同表位，通过3-20-1与3-26-1的结合建立了双抗体夹心酶联免疫反应方法，其是一种高灵敏度及高通量的检测***。

因此，本发明提供了下面所述的(1)至(8)的内容：

1.抗***特异性抗原的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCC C201202和CCTCCC201208。

2.抗***特异性抗原的单克隆抗体，分别由保藏号CCTCC C201202和CCTCCC201208杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为3-20-1和3-26-1。

3.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：将Balb/c小鼠免疫3次后，在细胞融合前3天作最后一次加强免疫，采用ELISA法分2步进行筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗***特异性抗原PSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，选择吸光度和灵敏度较高的阳性孔，采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复3次后，最后筛选出2株杂交瘤细胞系。

4.如权利要求2所述的抗***特异性抗原单克隆抗体的应用，即利用所述的单克隆抗体的双抗体夹心法ELISA检测t-PSA，夹心法两两配对的抗体来源于细胞株3-20-1和3-26-1，其步骤包括：

(1)以所述的两两配对的单克隆抗体之一包被；

(2)加入待测样品孵育；

(3)以所述的两两配对的HRP标记的另一株单克隆抗体作为二抗，加入反应体系；

(4)洗涤后加入酶反应底物，以450nm读取OD值；

(5)结果表明检测的灵敏度很高。

5.一种检测血清中t-PSA含量的试剂盒，包括：包被有抗***特异性抗原抗体的不透明聚苯乙烯板；***特异性抗原系列标准品；酶标记的***特异性抗原另一株单克隆抗体；上述酶所作用的化学发光底物A液和B液以及洗涤液。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：不透明聚苯乙烯板采用直接物理吸附法包被单克隆抗体，包被液是磷酸盐缓冲液中；另一株***特异性抗原单克隆抗体和辣根过氧化酶偶联形成酶标记抗体，采用的是改良的过碘酸钠法进行标记；***特异性抗原系列标准品以小牛血清为基质，加入***特异性抗原纯品配置而成；发光底物A、B为HRP-Luminol发光体系。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：标记抗体所用的标记酶是辣根过氧化酶，用的是高碘酸钠氧化法，所得酶标记抗体最佳的工作浓度是1∶2000；包被有抗***抗原抗体的不透明聚苯乙烯板采用的是直接物理吸附法包被；发光液A液用硼砂7.99g，硼酸3.46g，鲁米诺0.28g，对碘苯酚0.07g，加工艺用水定容至700mL，避光保存；发光底物B液由下列成分组成：硼砂7.99g，硼酸3.46g，过氧化脲0.07g加工艺用水定容至700mL。

8.如权利要求5-7所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)标准品的配制和浓度的校正

将总***特异性抗原t-PSA纯品，加入标准品稀释液，配制一高浓度标准品浓液，采用逐低稀释的方法稀释到各浓度，配制成0、2.5、5、15、45、100ng/mL的系列标准品，标准品用国家标准校正。

(2)包被

采用0.5mol/L，pH值为9.5的碳酸盐缓冲液与适当浓度的***特异性抗原单抗混合成抗体浓度是1μg/mL包被液，以100μL/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上，4℃孵育过夜；

(3)洗板

用PBS-T洗液洗板孔2次；

(4)封闭

封闭液包含NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，蔗糖20.00g，proclin300 1.00ml，BSA20.00g，封闭液的PH值为7.3-7.5，150μL/孔封闭，湿盒孵育2h；

(5)干燥

去除封闭液，过夜干燥。

(6)组装为成品

将聚苯乙烯板子放入铝箔袋中并放入干燥剂，密封保存。

上述的抗***特异性抗原的单克隆抗体，是由下列的方法所制备，步骤包括：

(1)用蛋白量为50ug的***特异性抗原与弗氏完全佐剂混合；经15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫；再15天后进行第三次相同剂量与弗氏完全佐剂混合免疫；10天后尾部取血用间接ELISA方法测血清滴度，用相同剂量的纯抗原不加佐剂加强免疫；3天后取脾细胞进行融合；

(2)将免疫小白鼠脾细胞与小白鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-10∶1的比例，用50％PEG作为融合剂融合；

(3)用含HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)的无血清培养基，在37℃，5％C02的细胞培养箱中培养10天，常规间接ELISA方法筛选阳性孔；

(4)筛选出的特异性强阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获得单抗细胞株进一步扩大培养；

(5)收集培养上清液，亲和层析法纯化单克隆抗体，即为可***特异性抗原单克隆抗体；

(6)检测单克隆抗体的滴度，选取较好的一株进行标记(HRP标记)，并对标记好的单克隆抗体进行滴度测定；

(7)标记好的单克隆抗体与其他未标记的单克隆抗体进行竞争ELISA反应，选取没有竞争的一株进行夹心ELISA反应，确定最佳条件。

本发明的单克隆抗体可直接用于检测样品中的人t-PSA含量，通过大量培养单抗细胞株，即可获得大量的单克隆抗体，与多克隆抗体相比，具有纯度高，专一性强、重复性好等优点。

本发明针对临床实验室建立了一种既可以手工操作，又可以用于标准全自动检测仪器的检测手段，建立了检测人血清t-PSA的定量检测方法。本发明的***特异性抗原定量检测试剂盒(化学发光法)可以专一的检测出人血清中的PSA的含量，从而根据其含量的多少判断***癌病情的变化和治疗效果。它具有简便、快速、灵敏、稳定的优点，本发明的试剂盒，包被的抗体与酶标记的抗体及被测样品中的***特异性抗原形成“包被抗体-抗原-抗体-酶”的夹心复合物结构，所以本发明采用的是“双抗夹心一步法”的反应模式。利用辣根过氧化酶催化发光底物，发光底物发生化学反应释放大量的能量，产生激发态的中间体，当其回到稳定的基态时，可以发射出光子，利用发光仪器测量光量子的产额，该光量子的产额和样品中的检测无助的量成正比，由此建立标准曲线并计算出样品中待测物质的含量。试剂盒检测方法具有灵敏度高，检测范围宽，操作方便、对实验人员无伤害，同时生产成本低，减轻了医患双方的负担，因此更有利于***癌临床诊断的推广使用。

【附图说明】

图1显示的是用间接ELISA方法测血清滴度(细胞融合前)；

图2显示的是本发明中的杂交瘤所产生的抗t-PSA单克隆抗体在ELISA方法中滴度测量结果；图3显示的是标记HRP的抗t-PSA单克隆抗体滴度测量结果；

图4显示的是夹心法ELISA(S-ELISA)***的检测灵敏度；

图5显示的是所制备的试剂盒的标准品线形图。

【具体实施方式】

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阐述了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样是本申请中权利要求书中所限定的范围。

实施例1：动物免疫

选择与所用的骨髓瘤细胞同源的8周龄左右的雄性Balb/C健康小鼠，抗原是蛋白量为100ug的***特异性抗原与弗氏完全佐剂、PBS混合，完全乳化后，100ug每只每次，采取背部多点，及腋下、腹股沟免疫。免疫程序：经15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫；再15天后进行第三次相同剂量与福氏完全佐剂混合免疫；10天后尾部取血用间接ELISA方法测血清滴度(见附图1)，用相同剂量的纯抗原不加佐剂加强免疫；3天后取脾细胞进行融合。

表1：第三次用t-PSA免疫之后小鼠血清中的抗体滴度

实施例2：杂交瘤细胞的构建

1、骨髓瘤细胞株的培养及制备

(1)本发明采用的是SP2/0骨髓瘤细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，倍增时间为10-12h。融合时选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞。骨髓瘤细胞在融合前应先在培养基上作适应培养，使细胞生长到最佳的状态(即对数生长期)；

(2)将培养的SP2/0吸至50mL的管中，离心，弃上清，悬起，加10mL的培养基，吸取少量10倍稀释计数。

2、脾细胞的制备

(1)将小鼠放在密封袋中，充CO2待其窒息死亡；

(2)将小鼠消毒固定在解剖板上，在超净工作台中取脾，放在12mL培养基的培养皿中，剥掉粘连组织，研磨脾脏，直至剩白色组织为止，吸管全部吸起，再缓慢打出使组织块粘连的管壁上，离心，弃上清，加10mL的红细胞裂解液裂解10min，再加20-25mL的培养基终止其反应，离心后，弃上清，加10mL的培养基，吸取少量10倍稀释计数。

3、细胞融合

加强免疫后3天做细胞融合。

细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是取处于对数生长期的Sp2/0细胞与脾细胞1∶10混和，通过聚乙二醇(PEG)法以获得杂交瘤细胞，命名为3-20-1和3-26-1。所获得的杂交瘤细胞悬浮在含有饲养细胞的HAT培养基中，然后加入到96孔板中，在37℃，5％CO2的培养箱中封闭培养12天；

实施例3：单克隆抗体的制备及筛选

1、单克隆抗体的制备

从实施例二中所获得的杂交瘤细胞的孔格中回收培养基的上清液，选取在ELISA方法中与抗原多肽反应的单克隆抗体。

2、单克隆抗体的筛选

(1)将100uL浓度为0.2ug/ml的t-PSA到96孔板的每个孔格中，于4℃过夜后使其固定于固相；

(2)用150uL浓度为1％的牛血清白蛋白进行封闭2小时；

(3)将100uL杂交瘤细胞的培养基上清液加入到每个孔格中，于37℃反应2小时，然后加入稀释10K倍的辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠抗体于37℃反应1小时；

(4)使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB)作为底物进行显色20min；

(5)添加50uL浓度为0.2N的硫酸终止反应后，测量450nm的吸光度；

(6)选出吸光度大约为3的3-20-1和3-26-1，并通过有限稀释法进行亚克隆。

3、单克隆抗体的大量制备及和纯化

将亚克隆后的细胞用细胞培养转瓶进行扩大培养，约20天后，收集上清，用葡萄球菌A蛋白(Protein A)进行亲和层析纯化。得到的单克隆抗体分别命名为3-20-1与3-26-1。

4、单克隆抗体效价的测定

所筛选出的2种mAb的效价通过ELISA方法来测定。分别加入3-20-1、3-26-1(10ug/mL)，在反应后，使用辣根过氧化物酶偶联的抗-小鼠抗体与TMB进行显色，结果如图2所示两种mAb效价达到10^-9以上。

实施例4：单克隆抗体的标记及滴度的测定

将纯化出得各抗体按常规方法进行HRP标记，标记好的单克隆抗体的滴度通过下面的方法测定，将浓度为0.2ug/ml的t-PSA固定在96孔微板上(100uL/孔)。使用1％的牛血清白蛋白进行封闭2小时，加标记的单克隆抗体(第一孔稀释100倍)，从第二孔开始做4倍稀释，于室温下反应2小时。添加TMB后，反应在室温下进行20分钟，用0.2N的硫酸中止反应。测量在450nm的吸光度，按实施例三中的方式获得针对固定在固相中的抗原的滴度。结果表明具有有效的滴度(结果如图3)。

实施例5：双抗体夹心ELISA检测t-PSA方法的建立

(1)、以所述的两两配对的单克隆抗体之一包被，0.5ug/ml的单克隆抗体以100uL/孔的量加到微孔板土，于4℃孵育24小时固定于固相；

(2)、孔格使用含有0.1％Tween 20的pH值为7.4的20mM PBS(PBST)以200uL/孔的量洗2次。以150uL/孔的量加入1％牛血清白蛋白进行封闭2小时。

(3)、孔格用PBST以200uL/孔的量洗4次，加入由起始浓度10ug/ml连续4倍稀释t-PSA，于室温温育2小时，然后加入标记HRP的一株抗体(1∶4K；100uL/孔)并于室温温育2小时。

(4)、添加TMB后，反应在室温下进行20分钟，加入0.2N的硫酸来中止反应并测量450nm的吸光度。

(5)结果表明检测的灵敏度很高。(见附图4所示)

实施例6：制备本发明的***特异性抗原定量测定试剂盒(化学发光法)

(一)高碘酸钠氧化法标记辣根过氧化酶

(1)酶的氧化(全过程避光)

称取3-5mg HRP溶解于600μL ddH2O2中；

b、加入新鲜配制的150uL 0.1M高碘酸钠(NaIO4)(MW：213.89g/mol，取0.22g溶解于10mL 10mM pH7.0磷酸钠缓冲液中)；

c、混匀，室温，避光孵育20min；

d、将溶液用透析管透析，3000rpm/min，4℃，20min，溶液为1.0mM pH4.0醋酸钠缓冲液，换3-4次；

e、最后透析至800μL，至EP管中；

(2)抗体的准备和标记(避光)

a、取准备好的3mg单抗，用离心管浓缩成500μL-1000μL体积，吸出于新的15mL离心管中；

b、加入500μL 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液，混匀，检测pH值在9.0～9.5；

c、立即将透析好的HRP溶液与单抗溶液混合，室温摇晃2h，避光；

d、加入80μL新鲜配制的NaBH4(4.0mg/mL，取40mg溶解于10mL ddH2O2中)；

e、混匀(避光)，4℃孵育1.5h；

f、用PBS透析至体积为2mL；

g、加入等体积甘油，1mL/管，-20C保存

(二)酶标抗体工作液的配制

(1)酶标稀释液的配制

按照标准配方准确称取三羟甲基氨基甲烷7.27g，加工艺用水800.0mL，搅拌使充分溶解后，加入浓盐酸适量，搅拌均匀，使用数显酸度计测量液体的pH值为7.1～7.3，再将称量好的其他配方组分依次加入上述溶液中，充分搅拌溶解后，使用工艺用水定容至1200.0mL，按《316L SGP150K型不锈钢钹式液体精密过滤器标准操作规程》进行除菌过滤，过滤后液体2～8℃保存备用。

检验合格的酶结合物缓冲液按照所用抗体的稀释比例添加抗-PSA-HRP，顺时钟方向搅拌30分钟充分混合均匀后2～8℃保存备用，分装时按96人份：11.0mL/瓶，有效期18个月。

(2)酶标抗体工作液的配制

经试验证明，酶标抗体的最佳工作浓度是1∶2000，用(1)所述的稀释液将酶标抗体稀释到所需要的工作浓度。

(三)***特异性抗原标准品的配制

按照标准配方内容准确称取上述各组分，加入工艺用水800.0mL搅拌充分溶解后，使用数显酸度计测量液体的pH值应为7.1～7.3，用工艺用水定容至1000.0mL，混合均匀，将***特异性抗原纯品，加入标准品稀释液，配制一高浓度标准品浓液，采用逐低稀释的方法稀释到各浓度，配制成0、2.5、5、15、45、100ng/mL的系列标准品，2～8℃保存备用。

检验合格的PSA标准品分装时，0.5mL/瓶，有效期18个月。

(四)***特异性抗原单克隆抗体包被聚苯乙烯板

(1)将0.05mol/L，pH9.6的磷酸氢二钾溶液和适当浓度的***特异性抗原单克隆抗体混合制成包被液，将其包被于聚苯乙烯板上，放置湿盒中，过夜包被；

(2)洗涤：用PBS-Tween洗液洗板孔2次；

(3)封闭：

封闭液的配制：

准确称量NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄ 0.2g，搅拌均匀，使用数显酸度计测量液体的pH值为7.3～7.5，再将称量好的其他配方组分依次加入上述溶液中，充分搅拌溶解后，使用工艺用水定容至1000.0mL，2～8℃保存备用，有效期15天。使用时每孔加入150μL，湿盒孵育2h，甩掉封闭液，在干净的吸水纸上拍干；

(4)干燥：将聚苯乙烯板放置在冻干机上冻干2h，真空封袋，贴签后置2-8℃保存。

(五)化学发光底物液

本发明所使用的辣根过氧化酶(HRP)的化学发光底物液的配制方法是：

化学发光底物A的配制方法：

准确称取上述各组分，加入纯化水600.0mL，搅拌充分溶解后定容至700.0mL，测定溶液的pH应为9.1～9.4，2～8℃避光保存备用。

按检验合格后按96人份：6.0mL/瓶分装，有效期18个月。

化学发光底物B的配制方法：

准确称取上述各组分，加入纯化水600.0mL，搅拌充分溶解后定容至700.0mL，测定溶液的pH应为9.1～9.4，2～8℃保存备用。

检验合格后按96人份：6.0mL/瓶分装，有效期18个月。

使用方法：使用前将A液和B液按1∶1比例混合使用。

(六)10×洗涤液

准确称取上述各组分，加入工艺用水定容至800.0mL，搅拌充分溶解后，加工艺用水定容至1000.0mL，测定溶液的pH应为7.1～7.4，室温保存备用。

检验合格后按照96人份，30.0mL/瓶分装，有效期18个月。

(七)半成品及成品的组成

上述步骤所得的各种半成品组成及产品说明书等各种附件组成PSA定量测定试剂盒(化学发光法)。

试剂盒中的固相抗体是提前包被好的，不需要现场包被，使用方便且节时；校准品是液体；酶标记物是已经稀释到工作浓度的液体，也可以直接使用。

实施例7：本发明***特异性抗原定量测定试剂盒(化学发光法)操作方法如下：

(一)准备

将要待检血清样品和检测试剂盒恢复至室温(18-25℃)(大约15min)，本发明的试剂盒中的不透明的聚苯乙烯板已经将t-PSA抗体固定在板孔中，可直接使用，不用现时包被，使用非常方便。

(二)操作方法：

1、将所需要量的已包被的板条放置在支架上；

2、在包被孔中分别加入10μL的标准品和血样

3、每孔加入100μL的酶标记物，稍微振荡使其混合均匀；置湿盒中孵育1h；

4、弃去孔内液体，用稀释后的洗涤液，自动洗板机或者手工洗板4次，最后在干净的吸水纸上扣干；

5、将发光底物A、B等比例混合至本次所用的体积，每孔加入混合后的发光底物100μL，稍微振荡使其混合均匀，避光室温反应2min，

6、化学发光仪检测相对发光值(RLU)，测量时间是0.1-1秒/孔。

7、分别对标准品浓度和相对发光值(RLU)取对数值，建立标准曲线(参见附图5)，以待测血清RLU的值在标准曲线查出血清中t-PSA的浓度值，计算检测结果。

8、统计分析检测结果。

以本发明的上述试剂盒按照上述步骤进行测定所用的时间短、仅需要一个多小时就可全部完成，方便快速。

实施例八本发明的试剂盒测定时的方法学指标如下：

1、检测范围：0-100ng/mL；

2、正常参考值：＜4.0ng/mL；

3、灵敏度：最小检出限是0.04ng/mL；

4、精密度：分析内精密度(检测低、中、高三组样品(n＝10)均小于5％，分析间的精密度(检测低、中、高三组样品(n＝10)均小于15％，高于国家标准，说明本发明的试剂盒在检测试验中具有良好的重复性；

5、线性：r≥0.99；

6、特异性：和CEA、AFP、PAP等常见肿瘤标志物无交叉反应。

本发明的试剂盒所用的血清量少，只需要10μL，体外检测对患者没有任何的副作用；同时本发明用的是化学发光免疫分析方法，各项指标也优于酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，因此本发明为临床检测t-PSA提供了一种更简便、快速、准确的方法，更能满足临床上的需求。

实施例九本发明的试剂盒临床血样测值

取用医院临床收集病人血清标本66份，用本发明的试剂盒进行临床检测，其测值如下：

标记	计算浓度	理论浓度	发光值
				S0	0	0	91299
S1	2.46	2.5	779419
				S2	5.07	5	1485374
S3	15.01	15	3899760
				S4	44.87	45	9925272
S5	99.99	100	16907330

首先对上表中的标准品浓度和相对发光值(RLU)取对数值，建立标准曲线，标准曲线相关系数R值是0.99，并以待测血清RLU的值在标准曲线中查出血清中t-PSA的浓度值，统计分析检测结果，与临床病例比较，符合率达到99％。

综上所述，本发明的试剂盒在操作简单、价格便宜、对患者无副作用、快速、准确率高等优点，更适于推广使用。

Claims (2)

1.抗***特异性抗原的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCC C201202和CCTCCC201208。

2.抗***特异性抗原的单克隆抗体，分别由保藏号为CCTCC C201202和CCTCC C201208的杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为3-20-1和3-26-1。